Summary
提出了一种产生人类原发子宫内膜器官的方案，该细胞由上皮细胞和基质细胞组成，并保留原生子宫内膜组织的特性。该协议描述了从子宫组织采集到子宫内膜器官组织处理的方法。
Abstract
人类子宫内膜是体内激素反应最灵敏的组织之一，对妊娠的建立至关重要。这种组织也可能生病，导致发病，甚至死亡。研究人类子宫内膜生物学的模型系统仅限于单细胞类型的体外培养系统。此外，上皮细胞是子宫内膜的主要细胞类型之一，在培养中不能很好地繁殖或保持其生理特性，因此我们对子宫内膜生物学的理解仍然有限。我们首次生成了由人类子宫内膜的上皮细胞和基质细胞组成的子宫内膜器官。这些有机体不需要任何外源性支架材料，并特别组织，使上皮细胞包含球形状结构，并变得极化与基质细胞在中心产生和分泌胶原蛋白。雌激素，黄体酮和雄激素受体在上皮和基质细胞中表达，用雌激素和睾丸激素的生理水平促进器官组织。这个新的模型系统可以用来研究正常的子宫内膜生物学和疾病的方式，以前是不可能的。
Introduction
人类子宫内膜线子宫腔，并作为胚胎在植入过程中的第一次接触。子宫内膜由发光和腺上皮细胞、支持性基质成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞组成。总之，这些细胞类型组成子宫内膜组织，这是对性类固醇激素1反应最灵敏的组织之一。每个月经周期发生的变化是惊人的。需要适当的生长和重塑子宫内膜，以允许胚胎植入发生。对雌激素和孕激素的异常反应可能导致难治性子宫内膜，不允许成功建立妊娠，甚至可能导致疾病，包括子宫内膜肿瘤。
为了研究子宫内膜的激素反应和基本变化，在手术或子宫内膜活检期间从患者身上切除的子宫内膜组织细胞在细胞培养中繁殖。子宫内质基质细胞优先增殖和繁殖，孕酮诱导的分化过程可在体外重述。因此，在这个分化过程中，人们学到了很多东西，称为二元化2，3。然而，子宫内膜中的另一个主要细胞类型，即发光和腺皮细胞，没有像传统的单层那样生长良好，失去极性，变得衰老，增殖潜力有限。因此，人们对于它们的生物学及其在人类子宫内膜中的作用知之甚少。由于许多肿瘤来自上皮细胞，与增生或癌细胞转化相关的机制仍有待完全定义。此外，研究已经证实，激素反应涉及子宫内膜4，5的上皮细胞和基质细胞之间的亲密对位细胞作用。
最近，由两个独立的组6，7建立了子宫内膜上皮细胞的三维（3D）有机体培养，这是首次报告由子宫内膜组织形成的器官。这些有机体由嵌入在蛋白质基质（材料表）内的子宫内膜上皮细胞组成，不包括子宫内膜内膜的重要激素反应室，即基质成纤维细胞。由于基质蛋白可能因批次而异，并可触发不一定在组织中出现的信号通路，因此，将基质蛋白替换为子宫内膜的成分是理想的选择。在目前的研究中，提出了一种产生无支架的人类子宫内膜器官的人类子宫内膜器官的表皮和基质细胞的协议。基质细胞的存在不仅为上皮细胞提供了支持，而且还提供了必要的副细胞作用，这些作用已被确定对子宫内膜激素反应4、8、9重要。.
新的多细胞子宫内膜器官提供了一个宫内膜的模型系统，易于生成，并结合上皮细胞和基质细胞。这些有机体可用于研究长期荷尔蒙变化和疾病的早期事件，如由于荷尔蒙失衡或外源性侮辱引起的肿瘤发生。这些器官的复杂性最终可以扩大，包括其他细胞类型，包括内皮细胞和免疫细胞与可能的骨髓细胞，以真正模仿人体组织生理学。
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Protocol
根据机构审查委员会批准的方案，子宫内膜样本是从西北大学普伦蒂斯妇女医院接受常规子宫切除术的绝经前妇女那里采集的。研究中的所有妇女都获得了书面同意。
1. 准备阿加罗斯模具
- 在开始细胞分离之前，根据制造商的说明铸造和平衡 1.5% 角糖微模（材料表），以容纳有机体。
2. 子宫内膜器官的生成
- 收获原位位和上皮细胞
- 在使用无菌技术的生物安全柜中，在37°C下制备酶溶液（2.5mg/mL胶原酶I型= 0.1mg/mL DNase I在10mL的消血 [500单位]）下），并使用 0.2 μm 注射器过滤器将溶液无菌过滤到 15 mL 锥形管中。
- 在使用无菌技术的生物安全柜中，用手术刀将子宫活检和引擎盖下的薄荷组织刮掉子宫内膜。
注：子宫内膜组织是至少20毫米x10毫米x1毫米需要产生足够的器官。 - 将新鲜切碎的组织放入15 mL锥形管中的酶溶液中。合上盖子，用蜡膜（材料表）包裹顶部，以防止污染。
- 将带组织管的管子放在水浴或37°C的培养箱中30分钟，轻轻摇动（80~100 rpm）。
- 在 50 mL 锥形管上堆叠一个 100 μm 细胞过滤器，顶部有 20 μm 细胞过滤器。通过两个过滤器过滤溶液，然后用汉克平衡盐溶液（HBSS） 冲洗15 mL锥形管;材料表）并放入滤网，以确保收集所有细胞。
注：流经液体含有基质细胞和红血球（总计约20 mL）。上皮细胞在20μm滤网上收集。未消化的组织块仍留在100μm滤网的顶部。将未消化的组织丢弃到生物危害废物容器中。 - 将步骤 2.1.5 中的 20 μm 细胞滤网倒置到新的 50 mL 锥形管上，用 20 mL 的有机体介质（材料表）将上皮细胞从滤网中洗去，并辅以 1% 笔/链球菌。
- 将锥形管从步骤 2.1.5 和 2.1.6 以 500 x g离心 5 分钟。
- 使用收集的基质细胞，去除上清液，用10 mL的红细胞赖沙缓冲液重新悬浮颗粒。 在37°C孵育10~15分钟，将锥形管在500 x g下离心5分钟，去除上清液，用200~300μL的有机体介质重新悬浮颗粒（有关进一步说明，见步骤2.2.2）。
- 使用收集的上皮细胞，取出上清液，用100μL的有机体介质重新悬浮（有关进一步说明，请参阅步骤2.2.2）。
- 种子细胞
- 在24孔板的孔中平衡1.5%的甘蔗霉菌（每孔1个模具）后，去除角胶模具外侧的有机体介质，并倾斜组织培养板，以便从角胶盘的细胞播种室中的介质也可以小心删除。
- 在显微镜下查看上皮（从步骤 2.1.9）和基质（从步骤 2.1.8）细胞悬浮液。 一次向上皮或基质细胞悬浮液100μL添加更多有机体介质，使悬浮液的密度大致相等。
注：上皮细胞会聚集在一起，不宜将上皮细胞消化/胰腺化成单细胞悬浮液。 - 按体积将基质细胞的1个部分与上皮细胞的3个部分结合。
- 将50μL（60，000细胞）的组合细胞悬浮液放入甘油霉菌的细胞播种室。
- 一旦蔗糖模具充满细胞，小心地将400μL的新鲜有机体介质加入24孔板的井中。
注：介质到达刚到的甘蔗盘的表面下方，不会使细胞从模具中浮出。2⁄3天后，细胞将稳定下来并开始形成有机体。 - 每第二天更换一次介质，使用500μL的有机体介质。
- 2-3天后，将介质更改为辅以0.1 nM雌二醇（E）和0.8 nM睾酮（T）的介质，以促进上皮细胞和基质细胞的组织。
注：虽然上皮和基质细胞的组织可以发生与或没有激素，更多的器官组织在激素的存在。
3. 收获子宫内膜器官进行实验
注：实验完成后，子宫内膜器官可以处理用于组织学或RNA分析。以下步骤描述了如何处理有机物。
-
组织学
- 通过沸腾将1.5%的甘蔗在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中溶解。让液体甘蔗冷却至约50°C。
- 在解剖显微镜下，倾斜 24 孔板，并小心地从甘蔗模具外部移出介质。小心地从胶糖模具内部移出介质，以避免干扰有机物。
- 在解剖显微镜下，小心地将70-75 μL的暖（50°C）1.5%角贺参放入角玫瑰盘的腔室。小心不要打扰有机物。
- 在4°C下冷却5分钟。
- 在24个井板的每口井中加入4%的甲醛（PFA），并在4°C内固定含有有机物的整个密封的甘蔗霉菌。然后在4°C下储存70%乙醇，直到准备加工成石蜡。
-
RNA分离
- 在解剖显微镜下，倾斜 24 孔板，并小心地从甘蔗模具室移出介质。
- 强力移液器 1 mL 的新鲜有机物介质直接进入胶原体模具，使有机物从微井中冲出。小心不要产生太多的气泡。
- 使用步骤 3.2.2 中的同一介质再次重复移液。
- 收集所有含有有机物的介质。以最大速度离心以收集有机物并进行RNA提取。
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Representative Results
图 1中描述了协议的原理图。子宫组织是在病理学家检查后从手术中获得的。子宫内膜内膜通过刮擦从子宫内膜中分离出来，子宫内膜组织被酶化地消化到协议中概述的细胞中。在甘蔗霉菌中，将上皮细胞和基质细胞添加到微井中。在培养7天后，用E和T治疗有机体7~14天。
在组织学处理中，含有子宫内膜有机体的腺胶模用腺胶密封，然后固定4%PFA过夜。这些模具被加工为标准石蜡嵌入，切片和染色为成体学，免疫荧光或免疫组化学。血氧林和欧辛（H&E）染色（图2A）揭示了一个球形状结构，外层和细胞在中心内衬有单层细胞。子宫内膜上皮（E-cadherin）和基质细胞（基质素）的细胞特异性标记揭示了围绕器官的上皮细胞，其中有基质细胞在中心（图2B）。
子宫内膜生理学的标记证实，子宫内膜器官保留了原生组织的某些特征。三铬染色，染色胶原蛋白蓝色和细胞红色，显示胶原蛋白的存在，在基质细胞所在的中心，表明活性生产和分泌胶原蛋白的基质细胞类似于原生组织（图3 A）此外，免疫组织化学染色显示上皮细胞和基质细胞中存在雌激素受体（ER）、雄激素受体（AR）和孕激素受体（PR）。
图1：从人类原发子宫内膜细胞生成无支架的3D子宫内膜器官。子宫组织从绝经前子宫内膜组织获得良性病理，子宫内膜衬里从组织片中切除。在酶消化时，子宫内膜上皮和基质细胞以3：1的体积比例播种成1.5%的甘草霉菌，并在无性激素培养基中维持长达7天。Estradil （E） 和睾酮 （T） 被添加到 3D 培养物中，以模仿月经周期10的卵泡阶段的 E 和 T 水平，并促进器官组织。改编自Teerawat等人，JCEM，（2019）11.
图2：子宫内膜器官细胞特异性标记物的组织学和免疫荧光染色。在14天的循序激素治疗后，模仿正常月经周期的卵泡阶段（0.1 nM E 和 0.8 nM T 7 天，1 nM E 和 0.8 nM T 再增加 6 天，然后是 1 nM E 和 1.25 nM T 1 天）。（A） H&E 染色是在石蜡嵌入的有机物上进行的.（B） 细胞特异性标记通过免疫荧光染色的E-cadherin（上皮，红色），维明他（频，绿色）和4+6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI;细胞核，蓝色），揭示了细胞的结构组织有机物。刻度条 = 20 μm. 改编自 Teerawat等人，JCEM，（2019年）<11 。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：子宫内膜器官在卵泡期激素治疗14天后表现出原生组织的特性。（A） 三铬染色是使胶原蛋白（蓝色）和细胞（红色）可视化的。在子宫内膜组织（左面板）和子宫内膜器官（刻度棒 = 20 μm，右侧面板）上进行了三铬染色。（B） 在子宫内膜组织（刻度棒 = 100 μm 底部面板）和子宫内膜器官（刻度棒 = 20 μm，顶部面板）中进行了ER、AR和PR的免疫组织化学染色。正染色以棕色显示，血氧林染色溶液作为蓝色表示的计数器染色。改编自Teerawat等人，JCEM，（2019）11. 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们产生了由内膜的上皮和基质细胞组成的人类子宫内膜器官，没有使用外源性支架材料。虽然已经表明，原子宫内膜上皮细胞可以形成器官6，7，这些细胞被嵌入在由小鼠肉瘤细胞分泌的蛋白质的胶质基质（见材料表），以帮助形成类球体状结构。此外，内膜基质细胞不存在。我们推测，我们系统中的基质细胞是子宫内膜组织的重要支持成分，为上皮细胞的支架提供了粘附，在细胞类型之间发生对位信号。基质细胞周围上皮细胞的组织表明，两种细胞类型之间存在主动相互作用，这提供了生理线索。由于子宫内膜的激素反应依赖于上皮细胞和基质细胞4、8、9之间的副细胞相互作用，我们的多细胞器官提供了另一种更复杂的原生模拟组织。
这里产生的器官大部分是体细胞，尽管一小部分细胞是干细胞状。我们还没有通过这些器官多代，不知道它们是否会生存和繁殖。此外，子宫内膜器官在性质上是异质的，因为并非所有器官都含有相同数量的上皮、基质或干细胞，甚至那些来自同一组织。器官的大小也不同，虽然大多数细胞形成类球状状结构，但观察到每个微孔内的松散细胞。E和T的存在似乎促进器官的形成与上皮细胞在中心外部和基质细胞内的特定组织。我们没有测试单独E或T是否会促进器官形成，以及治疗的最佳长度。对参数和条件进行额外测试，有利于生成适合计划实验的理想子宫内膜器官。
中培养物是促进生长和生存的重要成分。根据我们处理子宫内膜细胞的经验，与繁殖良好的基质细胞相比，培养中的上皮细胞生长是最具挑战性的。测试了不同的介质，包括选择的有机体介质（材料表），用于生成乳腺癌的乳腺球和肿瘤球，这是上皮细胞来源。我们的测试表明，这种介质允许有机物在14-28天培养过程中保持其结构完整性和生存能力。然而，这种介质对基质细胞的影响还有待进一步调查。尽管胶原蛋白在有机体介质中存活和生产，但在3D培养中观察到的增殖率远低于单层。然而，扩散的减少可能是由于3D结构。鉴于使用的有机体介质是商用的，由于介质的专有性质，介质成分仍然不清楚。
在未来的研究中，我们设想增加这些子宫内膜器官的复杂性，以纳入子宫内膜中发现的其他细胞类型，包括内皮细胞和免疫细胞。这只是工程的一个完整的子宫内膜模拟，可用于研究生物学，功能，疾病，和测试药物的开始。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由NIEHS/NIH/NCATS UG3赠款（ES029073）和西北范伯格医学院桥梁基金（JJK）资助。我们要感谢西北病理学核心设施，用于处理石蜡嵌入的固定有机物。我们要感谢整个 UG3 团队，包括伍德拉夫、伯德特和厄本内克实验室，他们进行了富有洞察力的讨论和协作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
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