Summary
Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.
Abstract
Het menselijk endometrium is een van de meest hormonaal responsieve weefsels in het lichaam en is essentieel voor de vaststelling van de zwangerschap. Dit weefsel kan ook ziek worden en morbiditeit en zelfs de dood veroorzaken. Model systemen om menselijke endometrium biologie te bestuderen zijn beperkt tot in vitro cultuur systemen van enkele celtypen. Bovendien, de epitheelcellen, een van de belangrijkste celtypen van het endometrium, niet goed propageren of behouden van hun fysiologische eigenschappen in de cultuur, en dus ons begrip van endometriale biologie blijft beperkt. We hebben voor de eerste keer endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit zowel epitheliale als stromale cellen van het menselijk endometrium. Deze organoïden vereisen geen exogene steiger materialen en organiseren specifiek zodat epitheelcellen de spheroid-achtige structuur omvatten en gepolariseerd worden met stromale cellen in het midden die collageen produceren en afscheiden. Oestrogeen, progesteron en androgeen receptoren worden uitgedrukt in de epitheliale en stromale cellen en behandeling met fysiologische niveaus van oestrogeen en testosteron bevorderen de organisatie van de organoïden. Dit nieuwe modelsysteem kan worden gebruikt om normale endometriale biologie en ziekte te bestuderen op manieren die voorheen niet mogelijk waren.
Introduction
Het menselijk endometrium lijnen de baarmoederholte en fungeert als het eerste contact voor het embryo tijdens de implantatie. Het endometrium bestaat uit Luminale en klier Epitheelcellen, ondersteunende stromale fibroblasten, endotheel cellen en immuuncellen. Samen vormen deze celtypen het endometrium weefsel dat een van de meest responsieve weefsels is voor geslachts steroïdhormonen1. De veranderingen die optreden tijdens elke menstruatiecyclus zijn opvallend. Er is een adequate groei en herinrichting van het endometrium nodig om de implantatie van embryo's mogelijk te maken. Afwijkende reactie op oestrogeen en progesteron kan resulteren in een refractair endometrium dat geen succesvolle instelling van de zwangerschap toestaat en zelfs kan resulteren in ziekten zoals endometriale neoplasie.
Om de hormoon responsen en essentiële veranderingen die zich voordoen in het endometrium te bestuderen, zijn cellen uit het baarmoederslijmvlies die uit de patiënten tijdens een operatie of endometriale biopsie zijn gepropageerd, in de celcultuur gekweekt. Endometrium stromale cellen vermenigvuldigen zich bij voorkeur gemakkelijk en propageren, en het proces van differentiatie geïnduceerd door progesteron kan in vitro worden samengevat. Als gevolg hiervan is veel geleerd tijdens dit differentiatieproces, genaamd decidualisatie2,3. Het andere belangrijke celtype in het endometrium, de Luminale en klier Epitheelcellen, echter niet groeien goed als traditionele monolagen, het verliezen van polariteit, steeds senescentie, en met beperkte proliferatieve potentieel. Als gevolg daarvan is er minder bekend van hun biologie en hun rol in het menselijk endometrium. Aangezien veel neoplasie afkomstig is van de epitheelcellen, blijven de mechanismen die gepaard gaan met hyperplasie of transformatie naar kankercellen volledig gedefinieerd. Bovendien, studies hebben vastgesteld dat hormoon respons impliceert de intieme paracrine acties tussen de epitheliale en stromale cellen van het endometrium4,5.
Onlangs werd een driedimensionale (3D) organoïde cultuur van endometrium epitheelcellen vastgesteld door twee onafhankelijke groepen van6,7, die de eerste rapporten zijn van organogeniden gevormd uit endometrium weefsel. Deze organoïden bestonden uit endometrium epitheelcellen ingebed in een eiwit matrix (tabel van materialen) en bevatte geen belangrijk hormonaal responsief compartiment van het baarmoederslijmvlies, de stromale fibroblasten. Aangezien de matrix eiwitten van lot tot lot kunnen variëren en signalering trajecten kunnen activeren die niet noodzakelijkerwijs in het weefsel voorkomen, zou het ideaal zijn om de matrix eiwitten te vervangen door componenten van het endometrium. In de huidige studie, een protocol voor het genereren van steigers-vrije menselijke endometriale organoïden van epitheliale en stromale cellen van het menselijk endometrium wordt gepresenteerd. De aanwezigheid van stromale cellen biedt niet alleen ondersteuning voor Epitheelcellen, maar biedt ook de noodzakelijke paracrine-acties die zijn vastgesteld om belangrijk te zijn voor de respons van het endometrium hormoon4,8,9 .
De nieuwe multicellulaire endometriale organoïde biedt een modelsysteem van het endometrium dat eenvoudig te genereren is en dat zowel epitheliale als stromale cellen bevat. Deze organoïden kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van hormonale veranderingen op de lange termijn en vroege gebeurtenissen van ziekte zoals tumorvorming als gevolg van hormonale onbalans of exogene insulten. De complexiteit van deze organoïden kan uiteindelijk worden uitgebreid met andere celtypen, waaronder endotheel-en immuuncellen met mogelijk myometriale cellen om de Fysiologie van het menselijk weefsel echt te nabootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Endometrium monsters werden verzameld van premenopauzale vrouwen die routine hysterectomie ondergaan voor goedaardige baarmoeder condities bij het Northwestern University Prentice Women's Hospital, volgens een institutioneel Review Board-goedgekeurd protocol. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle vrouwen die in de studie waren opgenomen.
1. bereiding van agarose-mallen
- Voorafgaand aan het begin van de celisolatie, gegoten en equilibraten 1,5% agarose micro mallen (tabel van materialen) om de organoïden te huis heren volgens de instructies van de fabrikant.
2. generatie van endometrium Organoïden
- Oogst primaire stromale en epitheelcellen
- Bereid in een bioveiligheidskast met aseptische techniek enzym oplossing (2,5 mg/mL Collagenase type I + 0,1 mg/mL DNase I in 10 mL dispase [500 eenheden]) bij 37 °C, en steriel-Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 μm spuit filter in een conische buis van 15 mL.
- In een bioveiligheid Cabinet met een aseptische techniek, schraap het endometrium van de baarmoeder biopsieën en het gehakt weefsel onder de motorkap in zeer kleine stukjes met een scalpel.
Opmerking: Endometrium weefsel dat ten minste 20 mm x 10 mm x 1 mm is vereist om voldoende aantal organoïden te genereren. - Zet vers gehakt weefsel in de enzym oplossing in een conische buis van 15 mL. Sluit de dop en wikkel de top met een Wax Film (tabel met materialen) om besmetting te voorkomen.
- Zet de buis met weefsel in een waterbad of een incubator bij 37 °C gedurende 30 minuten met zacht schudden (80 − 100 rpm).
- Stapel een 100 μm celzeef bovenop een celzeef van 20 μm op een conische buis van 50 mL. Filtreer de oplossing door de twee zeven en spoel de conische buis van 15 mL af met 10 mL van de gebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS; Tabel met materialen) en zet de wassing door de zeef om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.
Opmerking: De doorstroom vloeistof bevat stromale cellen en rode bloedcellen (~ 20 mL totaal). Epitheliale cellen worden verzameld op de 20 μm zeef. Stukjes onverteerd weefsel blijven bovenop de 100 μm zeef. Gooi onverteerd weefsel in een Biohazard afvalbak. - Inverteer de 20 μm celzeef van stap 2.1.5 op een nieuwe conische buis van 50 ml en was de epitheelcellen van de zeef met 20 ml organoïde media (tabel met materialen) aangevuld met 1% pen/STREP.
- Centrifugeer de conische buizen van de stappen 2.1.5 en 2.1.6 bij 500 x g gedurende 5 minuten.
- Met de verzamelde stromale cellen verwijdert u het supernatant en rebrengt u de pellet met 10 mL rode bloedcel lysisbuffer. Inbroed bij 37 °c gedurende 10 − 15 min. Centrifugeer de conische buis bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en laat de pellet remengen met 200 − 300 μL organoïde media (zie stap 2.2.2 voor verdere instructies).
- Met de verzamelde epitheliale cellen, verwijder de supernatant en opnieuw op te schorten met 100 μL organoïde media (zie stap 2.2.2 voor verdere instructies).
- Seeding van cellen
- Na het equilibreren van de 1,5% agarose mallen in Wells (1 mal per putje) van een 24-Wells plaat, verwijder organoïde media aan de buitenkant van de agarose mallen en kantel de weefselkweek plaat zodat het medium uit de cel zaaien kamer van de agarose gerechten ook kan worden voorzichtig verwijderd.
- Bekijk epitheliale (vanaf stap 2.1.9) en stromale (uit stap 2.1.8) cel suspensies onder de Microscoop. Voeg meer organoïde media toe aan zowel de epitheliale als de stromale cel suspensies 100 μL tegelijk, zodat de suspensies ruwweg gelijk zijn aan de dichtheid.
Opmerking: Epitheliale cellen zullen samen klonteren, en het is niet aan te raden om epitheelcellen in te verwerken/trypsinoiseren in eencellige suspensies. - Combineer 1 deel van stromale cellen met 3 delen epitheelcellen per volume.
- Pipetteer 50 μL (60.000 cellen) van de gecombineerde celsuspensie in de cel zaaien kamer van de agarose-mal.
- Voeg, zodra de agarose-mallen gevuld zijn met cellen, voorzichtig 400 μL verse organoïde-media toe aan de put van de 24-Well plaat.
Opmerking: Het medium bereikt net onder het oppervlak van de agarose gerechten en zal niet leiden tot de cellen te zweven uit de mallen. Na 2 − 3 dagen zullen de cellen zich vestigen en organoïden beginnen te vormen. - Verander het medium elke tweede dag met 500 μL organoïde media.
- Na 2-3 dagen, verander medium naar een die wordt aangevuld met 0,1 nM Estradiol (E) en 0,8 nM testosteron (T) ter bevordering van de organisatie van epitheliale en stromale cellen.
Opmerking: Hoewel de organisatie van epitheliale en stromale cellen kan optreden met of zonder hormonen, meer organoïden zal organiseren in de aanwezigheid van hormonen.
3. het oogsten van endometrium Organoïden voor experimenten
Opmerking: Nadat het experiment is uitgevoerd, kunnen endometrium organoïden worden verwerkt voor histologie of RNA-analyse. In de volgende stappen wordt beschreven hoe u de organoïden verwerkt.
-
Histologie
- Los 1,5% agarose op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door te koken. Laat de vloeistof agarose afkoelen tot ongeveer 50 °C.
- Kantel de 24-pits plaat onder een ontleed Microscoop en Pipetteer voorzichtig het medium van de buitenkant van de agarose mal. Pipetteer voorzichtig het medium uit het binnenste van de agarose mal om te voorkomen dat de organoïden worden verstoord.
- Pipetteer met een ontleed Microscoop voorzichtig 70-75 μL warm (50 °C) 1,5% agarose in de kamer van het agarose-schaaltje. Zorg ervoor dat u de organoïden niet verstoort.
- Laat afkoelen bij 4 °C gedurende 5 minuten.
- Voeg 4% Paraformaldehyde (PFA) toe aan elke put van de 24 goed plaat en bevestig de volledige verzegelde agarose mal die organoïden 's nachts bij 4 °C bevat. Bewaar vervolgens in 70% ethanol bij 4 °C tot het proces klaar is voor het insluiten van paraffine.
-
RNA-isolatie
- Kantel de 24-Well plaat onder een ontleed Microscoop en Pipetteer voorzichtig het medium uit de kamer van de agarose mal.
- Pipetteer 1 ml vers organoïde medium met kracht rechtstreeks in de agarose mal zodat de organoïden uit de micro putten worden gespoeld. Wees voorzichtig om niet te veel bubbels te maken.
- Herhaal de Pipetteer opnieuw met hetzelfde medium uit stap 3.2.2.
- Verzamel alle medium met de organoïden. Centrifugeer bij maximale snelheid om de organoïden te verzamelen en door te gaan naar RNA-extractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een schematische voorstelling van het protocol is afgebeeld in Figuur 1. Baarmoeder weefsel werd verkregen uit een operatie nadat het werd onderzocht door pathologen. Het baarmoederslijmvlies werd van het myometrium gescheiden door schrapen en het endometriale weefsel werd enzymatisch verteerd naar cellen zoals beschreven in het protocol. Epitheliale en stromale cellen werden toegevoegd in micro putten in de agarose mallen. Na 7 dagen in de cultuur werden organoïden behandeld met E en T gedurende 7 − 14 dagen.
Voor histologische verwerking werden de agarose-mallen met endometriale organoïden verzegeld met agarose gevolgd door fixatie met 4% PFA 's nachts. Deze mallen werden verwerkt voor standaard paraffine inbedding, gesectioneerd en gekleurd voor histologie, immunofluorescentie of immunohistochemie. De hematoxyline-en eosine-(H & E) kleuring (Figuur 2A) onthulde een spheroid-achtige structuur met een enkele laag cellen die de buitenkant en cellen in het midden binnengevoerd. Cel-specifieke markers voor endometrium epitheliale (E-cadherin) en stromale cellen (vimentin) onthulde epitheelcellen rond de organoïde met stromale cellen in het midden (Figuur 2B).
Markers van endometriale fysiologie bevestigden dat het endometrium organoïden bepaalde kenmerken van het inheemse weefsel behielden. Trichrome kleuring, die vlekken collageen blauw en cellen rood, toonde de aanwezigheid van collageen in het centrum waar stromale cellen woonden, aantonen van actieve productie en secretie van collageen door stromale cellen vergelijkbaar met het inheemse weefsel (Figuur 3 A). Bovendien onthulde immunohistochemische kleuring de aanwezigheid van oestrogeen receptoren (ER), androgeen receptoren (AR) en progesteron receptoren (PR) in zowel de epitheliale als de stromale cellen (Figuur 3B).
Figuur 1: generatie van steiger vrije 3D-endometriale organoïden van humane primaire endometriale cellen. Baarmoederweefsels werden verkregen uit premenopauzale endometrium weefsels met goedaardige pathologie en het endometrium vlies werd uit het weefsel stuk weggesneden. Bij enzymatische spijsvertering, endometrium epitheliale en stromale cellen werden geseurleerd in 1,5% agarose mallen bij een 3:1 verhouding volume en gehandhaafd in geslachtshormoon-vrije medium voor maximaal 7 dagen. Estradiol (E) en testosteron (T) werden toegevoegd aan de 3D-culturen om na te bootsen de niveaus van E en T tijdens de folliculaire fase van een menstruatiecyclus10 en ter bevordering van de organisatie van de organoïden. Aangepast van Teerawat et al., Jcem, (2019)11.
Figuur 2: histologie en immunofluorescentie kleuring van cel-specifieke markers op endometriale organoïden. Organoïden werden waargenomen na 14 dagen van stapsgewijze hormoonbehandeling die de folliculaire fase van een normale menstruatiecyclus nabootsen (0,1 nM E en 0,8 nM T gedurende 7 dagen, 1 nM E en 0,8 nM T voor een extra 6 dagen, gevolgd door 1 nM E en 1,25 nM T voor 1 dag). A) H & E kleuring is gedaan op paraffine-ingesloten organoïden. B) cel-specifieke markers werden beoordeeld door immunofluorescentie kleuring van E-cadherin (epitheel, rood), vimentine (stromal, groen) en 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI; Nucleus, blauw), die de structurele ordening van de cellen in de organoïden. Schaalbalk = 20 μm. aangepast van Teerawat et al., Jcem, (2019) <11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: endometrium organoïden vertonen kenmerken van native weefsel na 14 dagen van de folliculaire fase hormoonbehandeling. (A) trichrome-kleuring werd gedaan om collageen (blauw) en cellen (rood) te visualiseren. Trichromen vlek werd uitgevoerd op endometrium weefsel (linker paneel) en endometrium organoïden (schaal staven = 20 μm, rechter paneel). B) immunohistochemische KLEURING voor er, AR en PR werd gedaan in endometrium weefsel (schaalbalk = 100 μm bodem panelen) en endometrium organoïden (schaalbalk = 20 μm, toppanelen). Positieve vlek wordt weergegeven in bruin en hematoxyline vlek oplossing werd toegevoegd als de teller vlek weergegeven in blauw. Aangepast van Teerawat et al., Jcem, (2019)11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben menselijke endometriale organoïden gegenereerd die bestaan uit epitheliale en stromale cellen van het endometrium zonder het gebruik van exogene steiger materialen. Hoewel het al is aangetoond dat primaire endometrium epitheelcellen organoïden6,7, deze cellen werden ingebed in een gelatineuze matrix van eiwitten uitgescheiden door muis Sarcoom cellen (Zie tabel van materialen) om te helpen vormen spheroid-achtige structuren. Bovendien, endometriale stromale cellen waren afwezig. We speculeren dat de stromale cellen in ons systeem, dat is een essentiële ondersteunende component van het endometrium weefsel, mits de steiger voor epitheelcellen aan te houden en paracrine signalering opgetreden tussen celtypen. De organisatie van de epitheliale cellen rond de stromale cellen gaf een actieve interactie aan tussen de twee celtypen die de fysiologische aanwijzingen gaven. Omdat de hormonale respons van het endometrium gebaseerd is op paracrine interacties tussen de epitheliale en stromale cellen4,8,9, bieden onze multicellulaire organoïden een afwisselend, complexer nabootsen van de inheemse Weefsel.
De organoïden die hier werden gegenereerd waren voornamelijk somatische cellen, hoewel een klein percentage cellen stam achtig was. We hebben deze organoïden nog niet voor meerdere generaties gepasseerde en weten niet of ze zouden overleven en propageren. Bovendien zijn endometriale organoïden heterogeen van aard, omdat niet alle organoïden hetzelfde aantal epitheliale, stromale of stamcellen bevatten, zelfs die afkomstig zijn van hetzelfde weefsel. De grootte van de organoïden verschoof ook, terwijl de meeste cellen een spheroid-achtige structuur vormden, werden losse cellen binnen elke micro well waargenomen. De aanwezigheid van E en T bleek te bevorderen organoïde vorming met de specifieke organisatie van epitheliale cellen langs de buitenkant en stromale cellen in het centrum. We hebben niet getest of E of T alleen organoïde vorming zou bevorderen en wat de optimale behandelingsduur zou zijn. Aanvullend testen van parameters en condities zou gunstig zijn voor het genereren van de ideale endometrium organoïden die geschikt zijn voor het geplande experiment.
Medium is een belangrijk onderdeel van het kweken van organoïden voor het bevorderen van groei en overleving. Uit onze ervaring in het werken met endometriale cellen, is de groei van epitheliale cellen in cultuur de meest uitdagende in tegenstelling tot stromale cellen die goed propageren. Verschillende media werden getest, met inbegrip van de organoïde media naar keuze (tabel van materialen), die wordt gebruikt voor het genereren van mammobollen en tumorferen van borstkanker, die van epitheliale celoorsprong zijn. Uit onze tests bleek dat deze medium toegestane organoïden in staat waren om hun structurele integriteit en levensvatbaarheid te behouden in de loop van 14 − 28 dagculturen. Het effect van dit medium op stromale cellen heeft echter extra onderzoek nodig. Ondanks hun overleving en productie van collageen in de organoïde media, was de proliferatie graad waargenomen in 3D-cultuur veel minder dan in monolagen. De verminderde proliferatie kan echter ook te wijten zijn aan de 3D-structuur. Aangezien de gebruikte organoïde media commercieel beschikbaar zijn, blijven de medium componenten onduidelijk vanwege de eigen aard.
In toekomstige studies stellen we voor om de complexiteit van deze endometriale organoïden te verhogen om andere celtypen in het endometrium te verwerken, inclusief endotheel en immuuncellen. Dit is slechts het begin van de engineering een complete endometrium nabootsen die kan worden gebruikt om biologie te bestuderen, functie, ziekte, en om drugs te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) en Northwestern Feinberg school of Medicine Bridge Fund (JJK). Wij willen de noordwestelijke pathologie kern faciliteit voor de verwerking van de vaste organoïden voor paraffine insluiten erkennen. We willen het hele UG3 team erkennen, inclusief de Labs Woodruff, Burdette en Urbanek, voor de inzichtelijke discussies en samenwerkingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
