يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل الأساسي لبطانة الرحم البشرية الاوليه التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية والاحتفاظ بخصائص نسيج بطانة الرحم الأصلي. يصف هذا البروتوكول الطرق من اكتساب انسجه الرحم إلى المعالجة النسيجية لهيكل بطانة الرحم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بطانة الرحم البشرية هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه هرمونيا في الجسم وضروري لأقامه الحمل. هذا النسيج يمكن أيضا ان تصبح مريضه وتسبب الاعتلال وحتى الموت. واقتصرت النظم النموذجية لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم البشرية علي نظم الاستزراع الأنبوبي لأنواع الخلايا المفردة. الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا الظهاريه ، واحده من أنواع الخلايا الرئيسية لبطانة الرحم ، لا تنتشر بشكل جيد أو الاحتفاظ بصفاتها الفسيولوجية في الثقافة ، التالي فهمنا لعلم الاحياء بطانة الرحم لا يزال محدودا. لقد ولدت ، للمرة الاولي ، الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. هذه العضوية لا تتطلب اي مواد سقالة الخارجية وتنظيم علي وجه التحديد بحيث الخلايا الظهاريه تشمل الهيكل الشبيه كروي وتصبح مستقطبه مع الخلايا اللحمية في المركز الذي ينتج وتفرز الكولاجين. يتم التعبير عن الاستروجين ، البروجسترون ومستقبلات الاندروجين في الخلايا الظهاريه واللحمية والعلاج مع المستويات الفسيولوجية من الاستروجين والتستوستيرون تعزيز تنظيم الهيكل التنظيمي. ويمكن استخدام هذا النظام نموذج جديد لدراسة البيولوجيا بطانة الرحم العادية والمرض بطرق لم تكن ممكنة من قبل.
المقدمة
بطانة الرحم البشرية التجويف الرحمي وتعمل كاول اتصال للجنين اثناء الغرس. وتتكون بطانة الرحم من الخلايا الظهاريه المضيءه والغديه ، والخلايا الليفية الداعمة للورم ، والخلية البطانية والخلايا المناعية. معا, هذه الأنواع الخلية تشكل انسجه بطانة الرحم التي هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه لهرمونات الستيرويد الجنس1. التغييرات التي تحدث خلال كل دوره الحيض ملفتة للنظر. مطلوب النمو المناسب وأعاده تشكيل بطانة الرحم للسماح لزرع الاجنه ان يحدث. الاستجابة الشاذة للاستروجين والبروجستيرون يمكن ان يؤدي إلى بطانة الرحم الحرارية التي لا تسمح للنجاح في إنشاء الحمل ويمكن ان يؤدي حتى في الامراض بما في ذلك أورام بطانة الرحم.
من أجل دراسة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم جمع عينات بطانة الرحم من النساء قبل انقطاع الطمث التي خضعت لعمليه استئصال الرحم الروتينية لظروف رحميه حميده في مستشفي النساء بجامعه نورث وسترن ، وفقا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية. وتم الحصول علي موافقه خطيه من جميع النساء المشمولات بالدراسة.
1. اعداد قوالب اجبرز
- قبل البدء في عزل الخلايا ، يلقي وتتوازن 1.5 ٪ القوالب الدقيقة الاغاروز (جدول المواد) لإيواء العضوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. توليد الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم
- حصاد الخلايا اللحمية الاوليه والظهاره
- في خزانه السلامة الاحيائيه باستخدام تقنيه العقيم ، واعداد محلول ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي للبروتوكول. تم الحصول علي انسجه الرحم من الجراحة بعد فحصها من قبل اخصائيي الامراض. وفصل بطانة الرحم من الورم العضلي عن طريق الكشط وتم هضم انسجه بطانة الرحم انزيمي إلى الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. وأضيفت الخلايا الظهاريه واللحمية إلى ميكروويلس في قوالب اجبرز. بعد 7 أيام في الثقافة ، عولجت العضوية مع E و T لمده 7 − 14 يوما اضافيه.
بالنسبة للمعالجة النسيجية ، تم إغلاق القوالب التي تحتوي علي الهيكل العضوي لبطانة الرحم مع الاغثار متبوعه .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد ولدت لدينا الإنسان العضوي بطانة الرحم تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة الخارجية. في حين انه قد تم بالفعل تبين ان الخلايا الظهاريه بطانة الرحم الاوليه يمكن ان تشكل organoids6,7, وقد تم تضمين هذه الخلايا في مصفوفة الجيلاتين من البروتينات التي تفرزها خلايا ساركوما الفار (انظر جدول المواد) للمساعدة تشكيل هياكل تشبه كروي. الاضافه إلى ذلك ، كانت الخلايا اللحمية لبطانة الرحم غائبه. ونحن التكهن بان الخلايا اللح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIHS/المعاهد القومية للصحة/NCATS UG3 غرانت (ES029073) وشمال غرب مدرسه Feinberg كليه الطب جسر الصندوق (JJK). نود ان نعترف بالمرفق الأساسي لعلم الامراض الشمالية الغربية لمعالجه العضوية الثابتة لتضمين البارافين. نود ان نعترف بالفريق UG3 بأكمله بما في ذلك وودروف ، Burdette ، ومختبرات اوربريك للمناقشات الثاقبة والتعاون.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agarose HS ، درجة البيولوجيا الجزيئية | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| قوالب الاغاروز | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| كلوريد الأمونيوم (NH 4< / sub>Cl) | Amresco | 0621 | |
| & beta ؛ -Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| كولاجيناز ، النوع الثاني ، مسحوق | ثيرمو فيشر 17101015 | ||
| بين كورنينج | 354235 | ||
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| مستقبلات هرمون الاستروجين (SP1) ، الجسم المضاد أحادي النسيلة للأرانب | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield مع DAPI ، وسط تركيب الأنسجة | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| الملح المتوازن من Hank (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول |
| بقع الهيماتوكسيلين | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | تركيبة هاريس المعدلة ، محلول الهيبارين الخالي من الزئبق |
| تقنيات STEMCELL | تمت إضافة 07980 | إلى MammoCult | |
| media حل مخزون الهيدروكورتيزون | STEMCELL Technologies | 07925 | تمت إضافته إلى MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | مكملة ب 2 & micro ؛ لتر / مل الهيبارين و 5 & ميكرو ؛ لتر / مل هيدروكورتيزون |
| بارافورمالديهايد ، محلول 16٪ | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | |
| البنسلين الستربتومايسين | الحراري فيشر العلمي | 15140122 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4 | سيجما ألدريتش | P3813 | |
| مستقبلات البروجسترون ، PgR 1294 ، غير مترافق ، طافي مزرعة | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| مصفوفة البروتين - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| الفأر المنقى المضاد للجسم المضاد للإي كاديرين | BD Biociences | 610181 | استنساخ 36 |
| الجسم المضاد المؤتلف المضاد للفيمنتين [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| طقم تحلل وعزل الحمض النووي الريبي | Zymo Research | R2060 | |
| بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>) | سيجما ألدريتش | S6014 | |
| التستوستيرون | سيجما ألدريتش | 86500 | |
| ثلاثي الألوان صبغة | Abcam | ab150686 | |
| فيلم شمع - بارافيلم | VWR | 52858-000 |
المراجع
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualizati....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
