Summary
Ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher primärer Endometrium-Organoide, die aus epithelialer und stromaler Zellen bestehen und Eigenschaften des nativen Endometriumgewebes beibehalten, wird vorgestellt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden von der Erfassung des Gebärmuttergewebes bis zur histologischen Verarbeitung von Endometriumorganoiden.
Abstract
Das menschliche Endometrium ist eines der hormonell ansprechbarsten Gewebe im Körper und ist für die Etablierung einer Schwangerschaft unerlässlich. Dieses Gewebe kann auch krank werden und Morbidität und sogar Tod verursachen. Modellsysteme zur Untersuchung der Humanendometriumbiologie sind auf In-vitro-Kultursysteme einzelner Zelltypen beschränkt. Darüber hinaus vermehren sich die Epithelzellen, eine der wichtigsten Zelltypen des Endometriums, nicht gut oder behalten ihre physiologischen Merkmale in der Kultur, und so bleibt unser Verständnis der Endometriumbiologie begrenzt. Wir haben zum ersten Mal Endometrium-Organoide erzeugt, die sowohl epitheliale als auch stromale Zellen des menschlichen Endometriums bestehen. Diese Organoide benötigen keine exogenen Gerüstmaterialien und organisieren sich gezielt so, dass Epithelzellen die sphäroidartige Struktur umfassen und mit Stromalzellen in der Mitte polarisieren, die Kollagen produzieren und absondern. Östrogen, Progesteron und Androgen-Rezeptoren werden in den epitheliaalen und stromalen Zellen exprimiert und Die Behandlung mit physiologischen Niveaus von Östrogen und Testosteron fördern die Organisation der Organoide. Dieses neue Modellsystem kann verwendet werden, um normale Endometriumbiologie und Krankheiten auf eine Weise zu studieren, die vorher nicht möglich war.
Introduction
Das menschliche Endometrium säumt die Gebärmutterhöhle und dient als erster Kontakt für den Embryo während der Implantation. Das Endometrium besteht aus luminalen und drüsen Epithelzellen, unterstützenden stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen. Zusammen bilden diese Zelltypen das Endometriumgewebe, das eines der reaktionsschnellsten Gewebe für Sexualsteroidhormoneist 1. Die Veränderungen, die während jedes Menstruationszyklus auftreten, sind auffallend. Ein angemessenes Wachstum und eine Umgestaltung des Endometriums ist erforderlich, damit eine Embryoimplantation möglich ist. Eine aberrante Reaktion auf Östrogen und Progesteron kann zu einem feuerfesten Endometrium führen, das keine erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft zulässt und sogar zu Krankheiten wie endometriener Neoplasie führen kann.
Um die Hormonreaktionen und wesentlichen Veränderungen im Endometrium zu untersuchen, wurden Zellen aus Endometriumgeweben, die von Patienten während der Operation oder der Endometriumbiopsie entnommen wurden, in der Zellkultur vermehrt. Endometrium-Stromalzellen vermehren sich bevorzugt und vermehren sich leicht, und der durch Progesteron induzierte Differenzierungsprozess kann in vitro rekapituliert werden. Als Ergebnis wurde während dieses Differenzierungsprozesses viel gelernt, die so genannten Dezidualisierung2,3. Der andere große Zelltyp im Endometrium, die luminalen und drüsigen Epithelzellen, wachsen jedoch nicht gut als traditionelle Monolayer, verlieren Polarität, werden seneszierend und haben ein begrenztes proliferatives Potenzial. Infolgedessen ist weniger über ihre Biologie und ihre Rolle im menschlichen Endometrium bekannt. Da viele Neoplasie aus den Epithelzellen stammen, müssen Mechanismen, die mit Hyperplasie oder Transformation in Krebszellen verbunden sind, noch vollständig definiert werden. Darüber hinaus haben Studien festgestellt, dass die Hormonreaktion die intimen parakrinen Aktionen zwischen den epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums4,5umfasst.
Kürzlich wurde eine dreidimensionale (3D) Organoidkultur von endometriellen Epithelzellen von zwei unabhängigen Gruppen6,7, die erste Berichte über Organoide aus Endometriumgewebe sind. Diese Organoide bestanden aus endometrialen Epithelzellen, die in eine Proteinmatrix (Tabelle der Materialien)eingebettet waren, und enthielten kein wichtiges hormonell reaktionsfähiges Fach des Endometriums, die stromalen Fibroblasten. Da die Matrixproteine von Los zu Los variieren und Signalwege auslösen können, die nicht unbedingt im Gewebe vorkommen, wäre es ideal, die Matrixproteine durch Komponenten des Endometriums zu ersetzen. In der aktuellen Studie wird ein Protokoll zur Erzeugung von gerüstfreien menschlichen Endometriumorganoiden epitheliale und stromalen Zellen des menschlichen Endometriums vorgestellt. Das Vorhandensein von Stromalzellen bietet nicht nur die Unterstützung für Epithelzellen, sondern auch die notwendigen parakrinen Aktionen, die für die Endometriumhormonreaktion4,8,9 wichtig sein sollen. .
Das neue multizelluläre Endometriumorganoid bietet ein Modellsystem des Endometriums, das einfach zu erzeugen ist und sowohl epitheliale als auch stromale Zellen umfasst. Diese Organoide können verwendet werden, um langfristige hormonelle Veränderungen und frühe Ereignisse von Krankheiten wie Tumorigenese aufgrund von hormonellen Ungleichgewicht oder exogene Beleidigungen zu studieren. Die Komplexität dieser Organoide könnte schließlich auf andere Zelltypen erweitert werden, einschließlich endotheliale und Immunzellen mit möglicherweise myometrialen Zellen, um die Physiologie des menschlichen Gewebes wirklich nachzuahmen.
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Protocol
Endometriale Proben wurden von prämenopausalen Frauen gesammelt, die sich einer routinemäßigen Hysterektomie für gutartige Gebärmuttererkrankungen im Northwestern University Prentice Women es Hospital unterziehen, gemäß einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Die schriftliche Zustimmung wurde von allen Frauen eingeholt, die in die Studie einbezogen wurden.
1. Herstellung von Agarose-Formen
- Vor Beginn der Zellisolierung 1,5% Agarose-Mikroformen(Materialtabelle) gießen und ausdemieren, um die Organoide gemäß den Anweisungen des Herstellers zu beherbergen.
2. Erzeugung von Endometrium-Organoiden
- Ernte primäre stromal- und epitheliale Zellen
- In einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik Enzymlösung (2,5 mg/ml Kollagenase Typ I + 0,1 mg/ml DNase I in 10 ml Dispase [500 Einheiten]) bei 37 °C vorbereiten und die Lösung mit einem 0,2 m-Spritzenfilter in ein 15 ml konisches Rohr steril filtern.
- In einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik Endometrium aus den Gebärmutterbiopsien abkratzen und Gewebe unter der Haube in sehr kleine Stücke mit einem Skalpell zerkleinern.
HINWEIS: Endometriumgewebe, das mindestens 20 mm x 10 mm x 1 mm beträgt, ist erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Organoiden zu erzeugen. - In einer 15 ml konischen Röhre frisch gehacktes Gewebe in die Enzymlösung geben. Schließen Sie die Kappe und wickeln Sie die Oberseite mit einem Wachsfilm (Materialtabelle), um eine Kontamination zu verhindern.
- Das Rohr mit Gewebe in ein Wasserbad oder einen Inkubator bei 37 °C 30 min mit sanftem Schütteln (80 bis 100 U/min) geben.
- Stapeln Sie ein 100-m-Zellsieb auf einem 20-m-Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen. Filtern Sie die Lösung durch die beiden Siebe und spülen Sie dann das 15 ml konische Rohr mit 10 ml der ausgewogenen Salzlösung von Hank (HBSS; Materialtabelle) und legen Sie die Wäsche durch das Sieb, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden.
HINWEIS: Die Durchflussflüssigkeit enthält Stromalzellen und rote Blutkörperchen (insgesamt ca. 20 ml). Epithelzellen werden auf dem 20-m-Sieb gesammelt. Brocken unverdautes Gewebe verbleiben auf dem 100 m Sieb. Entsorgen Sie unverdautes Gewebe in einen Biorisiko-Abfallbehälter. - Invertieren Sie das 20 m Zellsieb von Schritt 2.1.5 auf ein neues 50 ml konisches Rohr und waschen Sie die Epithelzellen vom Sieb mit 20 ml organoiden Medien (Materialtabelle) ergänzt mit 1% Stift/Strep.
- Zentrifugieren Sie die konischen Rohre aus den Schritten 2.1.5 und 2.1.6 bei 500 x g für 5 min.
- Mit den gesammelten Stromalzellen den Überstand entfernen und das Pellet mit 10 ml roter Blutzelllysepuffer wieder aufhängen. Bei 37 °C für 10 bis 15 min inkubieren. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 500 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 200 bis 300 l Organoidmedien wieder auf (weitere Anweisungen siehe Schritt 2.2.2).
- Entfernen Sie mit den gesammelten Epithelzellen den Überstand und setzen Sie ihn mit 100 l Organoidmedien erneut aus (weitere Anweisungen finden Sie unter Schritt 2.2.2).
- Säzellen
- Nach dem Ausgleich der 1,5% Agarose-Formen in Brunnen (1 Form pro Brunnen) einer 24-Well-Platte, entfernen Sie organoide Medien an der Außenseite der Agarose-Formen und kippen Sie die Gewebekulturplatte, so dass das Medium aus der Zellsäkammer der Agarose-Gerichte auch sorgfältig entfernt werden.
- Sehen Sie epitheliale (ab Schritt 2.1.9) und stromale (ab Schritt 2.1.8) Zellsuspensionen unter dem Mikroskop. Fügen Sie entweder den epithelialen oder stromalen Zellsuspensionen jeweils mehr organoide Medien hinzu, so dass die Suspensionen in etwa gleich dicht sind.
HINWEIS: Epithelzellen verklumpen zusammen, und es ist nicht ratsam, Epithelzellen in einzelzellige Suspensionen zu verdauen/trypsinisieren. - Kombinieren Sie 1 Teil der Stromalzellen mit 3 Teilen der Epithelzellen nach Volumen.
- Pipette 50 l (60.000 Zellen) der kombinierten Zellsuspension in die Zellsaatkammer der Agaroseform.
- Sobald die Agarose-Formen mit Zellen gefüllt sind, fügen Sie vorsichtig 400 l frische organoide Medien in den Brunnen der 24-Well-Platte.
HINWEIS: Das Medium reicht knapp unter der Oberfläche der Agarose-Gerichte und lässt die Zellen nicht aus den Formen schweben. Nach 2 bis 3 Tagen setzen sich die Zellen ab und beginnen, Organoide zu bilden. - Wechseln Medium jeden zweiten Tag mit 500 L Organoid-Medien.
- Nach 2-3 Tagen, ändern Medium zu einem, das mit 0,1 nM Estradiol (E) und 0,8 nM Testosteron (T) ergänzt wird, um die Organisation von Epithel- und Stromalzellen zu fördern.
HINWEIS: Obwohl die Organisation von Epithel- und Stromalzellen mit oder ohne Hormone auftreten kann, organisieren sich mehr Organoide in Gegenwart von Hormonen.
3. Ernte von Endometrium-Organoiden für Experimente
HINWEIS: Nach Abschluss des Experiments können Endometrium-Organoide für die Histologie oder RNA-Analyse verarbeitet werden. Die folgenden Schritte beschreiben, wie die Organoide verarbeitet werden.
-
Histologie
- 1,5% Agarose in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) durch Kochen auflösen. Lassen Sie die flüssige Agarose auf ca. 50 °C abkühlen.
- Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie das Medium vorsichtig von der Außenseite der Agaroseform heraus. Das Medium vorsichtig aus dem Inneren der Agaroseform herauszupfeifen, um eine Störung der Organoide zu vermeiden.
- Unter einem Sezieren mikroskop, sorgfältig Pipette 70-75 l warm (50 °C) 1,5% Agarose in die Kammer der Agaroseschale. Achten Sie darauf, die Organoide nicht zu stören.
- Bei 4 °C 5 min abkühlen lassen.
- 4% Paraformaldehyd (PFA) in jeden Brunnen der 24 Brunnenplatte geben und die gesamte versiegelte Agaroseform mit Organoiden über Nacht bei 4 °C fixieren. Dann in 70% Ethanol bei 4 °C lagern, bis sie für die Paraffineinbettung bereit sind.
-
RNA-Isolierung
- Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie vorsichtig das Medium aus der Kammer der Agaroseform heraus.
- Kraftvoll Pipette 1 ml frisches organoides Medium direkt in die Agaroseform, so dass die Organoide aus den Mikrobrunnen gespült werden. Achten Sie darauf, nicht zu viele Blasen zu erstellen.
- Wiederholen Sie die Pipettenz erneut mit dem gleichen Medium aus Schritt 3.2.2.
- Sammeln Sie alle Mediums, das die Organoide enthält. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit, um die Organoide zu sammeln und zur RNA-Extraktion überzugehen.
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Representative Results
Ein Schaltplan des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Uterusgewebe wurde aus der Operation gewonnen, nachdem es von Pathologen untersucht wurde. Die Endometriumschleimhaut wurde durch Abkratzen vom Myometrium getrennt und das Endometriumgewebe enzymatisch zu den Zellen verdaut, wie im Protokoll beschrieben. Epithel- und Stromalzellen wurden in den Agaroseformen in Mikrobrunnen zugegeben. Nach 7 Tagen in der Kultur wurden Organoide mit E und T für weitere 7 bis 14 Tage behandelt.
Für die histologische Verarbeitung wurden die Agaroseformen, die Endometrium-Organoide enthielten, mit Agarose versiegelt, gefolgt von einer Fixierung mit 4% PFA über Nacht. Diese Formen wurden für Standard-Paraffin-Einbettungen verarbeitet, geschnitten und für die Histologie, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie gebeizt. Die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) (Abbildung 2A) zeigte eine sphäroidartige Struktur mit einer einzigen Zellschicht, die die Außenseite und die Zellen in der Mitte auskundaufzen. Zellspezifische Marker für endometriale Epithel (E-Cadherin) und Stromalzellen (Vimentin) zeigten Epithelzellen, die das Organoid mit Stromalzellen in der Mitte umgeben (Abbildung 2B).
Marker der endometrialen Physiologie bestätigten, dass die Endometrium-Organoide bestimmte Eigenschaften des nativen Gewebes beibehielten. Trichrome Färbung, die Kollagen blau und Zellen rot färbt, zeigte das Vorhandensein von Kollagen in der Mitte, wo Stromalzellen residierten, was die aktive Produktion und Sekretion von Kollagen durch Stromalzellen ähnlich dem nativen Gewebe demonstrierte(Abbildung 3 A). Darüber hinaus ergab die immunhistochemische Färbung das Vorhandensein von Östrogenrezeptoren (ER), Androgenrezeptoren (AR) und Progesteronrezeptoren (PR) sowohl in den epitheliaalen als auch in den Stromalzellen(Abbildung 3B).
Abbildung 1: Erzeugung von gerüstfreien 3D-Endometriumorganoiden aus menschlichen primären Endometriumzellen. Uterine Gewebe wurden aus prämenopausalen Endometriumgeweben mit gutartiger Pathologie gewonnen und die Endometriumsenfutter wurde aus dem Gewebestück entfernt. Bei enzymatischer Verdauung wurden endometriumtrienepitheliale und stromale Zellen in 1,5% Agaroseformen mit einem Volumenverhältnis von 3:1 ausgesät und in einem sexualhormonfreien Medium bis zu 7 Tage lang gehalten. Estradiol (E) und Testosteron (T) wurden zu den 3D-Kulturen hinzugefügt, um die Niveaus von E und T während der Follikelphase eines Menstruationszyklus10 zu imitieren und die Organisation der Organoide zu fördern. Angepasst von Teerawat et al., JCEM, (2019)11.
Abbildung 2: Histologie und immunfluoreszierende Färbung zellspezifischer Marker auf endometrientrienden Organoiden. Organoide wurden nach 14 Tagen stufenweiser Hormonbehandlung beobachtet, die die Follikelphase eines normalen Menstruationszyklus imitierten (0,1 nM E und 0,8 nM T für 7 Tage, 1 nM E und 0,8 nM T für weitere 6 Tage, gefolgt von 1 nM E und 1,25 nM T für 1 Tag). (A) H&E-Färbung wurde auf Paraffin eingebetteten Organoiden durchgeführt. (B) Zellspezifische Marker wurden durch immunfluoreszierende Färbung von E-Cadherin (epitheliale, rot), Vimentin (stromal, grün) und 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI; Kern, blau) bewertet, die eine strukturelle Organoide. Skala bar = 20 'm. Angepasst von Teerawat et al., JCEM, (2019)<11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Endometrium-Organoide weisen Nach 14 Tagen follikulärer Phasenhormonbehandlung Merkmale des nativen Gewebesauf. (A) Trichrome Färbung wurde durchgeführt, um Kollagen (blau) und Zellen (rot) zu visualisieren. Trichrome Flecken wurden auf Endometriumgewebe (linke spulische Platte) und Endometrium-Organoide (Scale Bars = 20 m, rechte S-Platte) durchgeführt. (B) Die immunhistochemische Färbung für ER, AR und PR erfolgte im Endometriumgewebe (Scale bar = 100 m Bodenplatten) und endometrialen Organoiden (Scale bar = 20 m, obere Paneele). Positiver Fleck wird in braun und Hämatoxylin-Färbung Lösung wurde als Der Zähler fleck in blau gezeigt hinzugefügt. Angepasst von Teerawat et al., JCEM, (2019)11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir haben menschliche Endometrium-Organoide erzeugt, die aus epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums bestehen, ohne die Verwendung von exogenen Gerüstmaterialien. Während bereits gezeigt wurde, dass primäre endometriale Epithelzellen Organoide bilden können6,7, wurden diese Zellen in eine gelatineartige Matrix von Proteinen eingebettet, die von Maussarkomzellen abgesondert wurden (siehe Tabelle der Materialien), um sphäroidartige Strukturen bilden. Darüber hinaus fehlten endometriale Stromalzellen. Wir spekulieren, dass die Stromalzellen in unserem System, die ein wesentlicher unterstützender Bestandteil des Endometriumgewebes sind, das Gerüst für Epithelzellen zur Einhaltung und Parakrinsignalisierung zwischen den Zelltypen zur Verfügung stellten. Die Organisation der Epithelzellen um die Stromalzellen deutete auf eine aktive Wechselwirkung zwischen den beiden Zelltypen hin, die die physiologischen Hinweise lieferte. Da die hormonelle Reaktion des Endometriums auf parakrinen Wechselwirkungen zwischen den epitheliaalen und stromalen Zellen4,8,9beruht, bieten unsere multizellulären Organoide eine alternative, komplexere Mimik der nativen gewebe.
Die hier erzeugten Organoide waren meist somatische Zellen, obwohl ein kleiner Prozentsatz der Zellen stammzellenartig war. Wir haben diese Organoide noch nicht für mehrere Generationen durchzogen und wissen nicht, ob sie überleben und sich fortverbreiten würden. Darüber hinaus sind Endometrium-Organoide heterogener Natur, da nicht alle Organoide die gleiche Anzahl von Epithel-, Stromal- oder Stammzellen enthielten, selbst solche, die aus demselben Gewebe stammten. Die Größen der Organoide unterschieden sich ebenfalls und während die meisten Zellen sphäroide ähnliche Strukturen bildeten, wurden lose Zellen in jedem Mikrobrunnen beobachtet. Die Anwesenheit von E und T schien die Organoidbildung mit der spezifischen Organisation von Epithelzellen zu fördern, die die äußeren und stromalen Zellen in der Mitte auskkleidungen. Wir haben nicht getestet, ob E oder T allein die Organoidbildung fördern würde und was die optimale Behandlungsdauer wäre. Zusätzliche Tests von Parametern und Bedingungen wären von Vorteil, um die idealen Endometrium-Organoide zu erzeugen, die für das geplante Experiment geeignet sind.
Medium ist ein wichtiger Bestandteil der Kultivierung von Organoiden zur Förderung von Wachstum und Überleben. Aus unserer Erfahrung in der Arbeit mit Endometriumzellen ist das Wachstum von Epithelzellen in der Kultur die größte Herausforderung im Gegensatz zu Stromalzellen, die sich gut ausbreiten. Verschiedene Medien wurden getestet, einschließlich der organoiden Medien der Wahl (Tabelle der Materialien), die verwendet wird, um Mammosphären und Tumorsphären von Brustkrebs zu erzeugen, die epithelialen Zellursprung sind. Unsere Tests ergaben, dass dieses Medium Organoiden erlaubte, ihre strukturelle Integrität und Lebensfähigkeit im Laufe von 14-28-Tage-Kulturen zu erhalten. Die Wirkung dieses Mediums auf Stromalzellen bedarf jedoch einer zusätzlichen Untersuchung. Trotz ihres Überlebens und der Produktion von Kollagen in den organoiden Medien war die in der 3D-Kultur beobachtete Proliferationsrate viel geringer als bei Monolayern. Die verminderte Proliferation kann jedoch auch auf die 3D-Struktur zurückzuführen sein. Da die verwendeten Organoidmedien kommerziell erhältlich sind, bleiben mittlere Komponenten aufgrund ihrer proprietären Natur unklar.
In zukünftigen Studien stellen wir uns vor, die Komplexität dieser Endometrium-Organoide zu erhöhen, um andere Zelltypen zu integrieren, die im Endometrium gefunden werden, einschließlich Endothel- und Immunzellen. Dies ist nur der Anfang der Entwicklung einer kompletten Endometrium-Mimik, die verwendet werden kann, um Biologie zu studieren, Funktion, Krankheit, und Medikamente zu testen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) und dem Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK) finanziert. Wir möchten die Northwestern Pathology Core Facility für die Verarbeitung der festen Organoide für paraffinige Einbettung würdigen. Wir möchten das gesamte UG3-Team einschließlich der Labore Woodruff, Burdette und Urbanek für die aufschlussreichen Diskussionen und Kooperationen würdigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
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