Summary
Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.
Abstract
O endométrio humano é um dos tecidos mais responsivos hormonalmente no corpo e é essencial para o estabelecimento da gravidez. Este tecido também pode tornar-se doente e causar morbidade e até mesmo a morte. Os sistemas modelo para estudar a biologia endometrial humana foram limitados aos sistemas in vitro da cultura de únicos tipos da pilha. Além disso, as células epiteliais, um dos principais tipos de células do endométrio, não se propagam bem ou mantêm suas características fisiológicas na cultura e, portanto, nossa compreensão da biologia endometrial permanece limitada. Nós geramos, pela primeira vez, os organóides endometrial que consistem em pilhas epithelial e stromal do endométrio humano. Estes organóides não exigem nenhuns materiais exógenos do andaime e organizam-se especificamente de modo que as pilhas epithelial engloquem a estrutura spheroid-like e se tornem polarizada com as pilhas stromal no centro que produzem e secretam o colagénio. Os receptores de estrogênio, progesterona e andrógeno são expressos nas células epiteliais e estromais e tratamento com níveis fisiológicos de estrogênio e testosterona promovem a organização dos organóides. Este novo modelo de sistema pode ser usado para estudar a biologia endometrial normal e doença de maneiras que não eram possíveis antes.
Introduction
O endométrio humano alinha a cavidade uterine e sere como o primeiro contato para o embrião durante a implantação. O endométrio é composto de células epiteliais luminais e glandulares, fibroblastos estromais favoráveis, células endoteliais e células imunes. Juntos, esses tipos de células compõem o tecido endometrial, que é um dos tecidos mais responsivos aos hormônios esteróides sexuais1. As mudanças que ocorrem durante cada ciclo menstrual são impressionantes. O crescimento e a remodelação apropriados do endométrio são exigidos para permitir que a implantação do embrião ocorra. A resposta aberrante ao estrogênio e progesterona pode resultar em um endométrio refratário que não permite o estabelecimento bem-sucedido da gravidez e pode até resultar em doenças, incluindo neoplasia endometrial.
A fim de estudar as respostas hormonais e alterações essenciais que ocorrem no endométrio, as células dos tecidos endometriais extirpada de pacientes durante a cirurgia ou biópsia endometrial têm sido propagadas na cultura celular. Células estromais endometriais preferencialmente proliferam e se propagam prontamente, e o processo de diferenciação induzido pela progesterona pode ser recapitulado in vitro. Como resultado, muita coisa foi aprendida durante esse processo de diferenciação, denominada decidualização2,3. O outro tipo principal da pilha no endométrio, as pilhas epithelial Luminal e glandular, entretanto, não cresce bem como monolayers tradicionais, perdendo a polaridade, tornando-se senescent, e tendo o potencial proliferative limitado. Como resultado, menos é conhecido de sua biologia e seu papel no endométrio humano. Como muitas Neoplasias se originam das células epiteliais, os mecanismos associados à hiperplasia ou transformação de células cancerosas permanecem totalmente definidos. Além disso, estudos estabeleceram que a resposta hormonal envolve as ações paracrinas íntimas entre as células epiteliais e estromais do endométrio4,5.
Recentemente, umacultura organoid tridimensional (3D) de pilhas epithelial endometrial foi estabelecida por dois grupos independentes6,7, quesão os primeiros relatórios dos organóides dados forma do tecido endometrial. Estes organóides foram compreendidos das pilhas epithelial endometrial encaixadas dentro de uma matriz da proteína (tabela dos materiais) e não incluiu um compartimento hormonalmente responsivo importante do endométrio endometrial, os fibroblasto stromal. Como as proteínas da matriz podem variar de lote para lote e pode desencadear vias de sinalização que não ocorrem necessariamente no tecido, seria ideal para substituir as proteínas da matriz com componentes do endométrio. No estudo atual, um protocolo para gerar organóides endometrial humanos Scaffold-livres de pilhas epithelial e stromal do endométrio humano é apresentado. A presença de células estromais não só fornece o suporte para células epiteliais, mas também fornece as ações paracrinas necessárias que foram estabelecidas para serem importantes para a resposta hormonal endometrial4,8,9 .
O organoid endometrial multicelular novo oferece um sistema modelo do endométrio que é simples de gerar e que incorpora pilhas epithelial e stromal. Estes organóides podem ser usados para estudar as mudanças hormonais a longo prazo e os eventos adiantados da doença tais como o tumorigênese devido ao desequilíbrio hormonal ou aos insultos exógenos. A complexidade destes organóides poderia eventualmente ser expandida para incluir outros tipos da pilha, incluindo pilhas endothelial e imunes com as pilhas possivelmente myometrial para imitar verdadeiramente a fisiologia humana do tecido.
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Protocol
Amostras endometriais foram coletadas de mulheres na pré-menopausa submetidas à histerectomia de rotina para condições uterinas benignas no hospital das mulheres da Universidade do noroeste, de acordo com protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional. O consentimento por escrito foi obtido de todas as mulheres incluídas no estudo.
1. preparação de moldes de agarose
- Antes do início da célula de isolamento, elenco e equilibrar 1,5% agarose micro moldes (tabela de materiais) para abrigar os organóides de acordo com as instruções do fabricante.
2. geração de Organoides endometriais
- Colheita de células estromal primárias e epiteliais
- Em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica, prepare a solução enzimática (2,5 mg/ml de colagenase tipo i + 0,1 mg/ml DNase i em 10 ml de Dispase [500 unidades]) a 37 ° c e esterilizado-filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,2 μm em um tubo cônico de 15 ml.
- Em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica, raspar o endométrio das biópsias uterinas e picar o tecido a capa em pedaços muito pequenos com um bisturi.
Nota: O tecido endometrial com pelo menos 20 mm x 10 mm x 1 mm é necessário para gerar números suficientes de organóides. - Coloque o tecido recém-picado na solução enzimática em um tubo cônico de 15 mL. Feche a tampa e enrole a parte superior com um filme de cera (tabela de materiais) para evitar a contaminação.
- Põr o tubo com o tecido em um banho de água ou em uma incubadora em 37 ° c por 30 minutos com agitação delicada (80 − 100 RPM).
- Empilhe um filtro de células de 100 μm na parte superior de um filtro de célula de 20 μm em um tubo cônico de 50 mL. Filtre a solução através dos dois filtros e, em seguida, enxague o tubo cônico de 15 mL com 10 mL da solução de sal balanceada de Hank (HBSS; Tabela de materiais) e põr a lavagem através do filtro para assegurar-se de que todas as pilhas estejam coletadas.
Nota: O líquido de fluxo-através contem pilhas stromal e glóbulos vermelhos (~ 20 mL total). As células epiteliais são coletadas no filtro de 20 μm. Os pedaços de tecido não digerido permanecem em cima do filtro de 100 μm. Descarte o tecido não digerido em um recipiente de resíduos de risco biológico. - Inverta o filtro de células de 20 μm da etapa 2.1.5 para um novo tubo cônico de 50 mL e lave as células epiteliais fora do filtro com 20 mL de meio organoide (tabela de materiais) suplementado com 1% de caneta/Strep.
- Centrifugue os tubos cônicos das etapas 2.1.5 e 2.1.6 em 500 x g por 5 min.
- Com as células estromais coletadas, retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet com 10 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Incubar a 37 ° c por 10 − 15 min. centrifugar o tubo cônico a 500 x g durante 5 min, retirar o sobrenadante e ressuscite o pellet com 200 − 300 μL de meio organoide (ver passo 2.2.2 para mais instruções).
- Com as células epiteliais coletadas, retire o sobrenadante e Resuspenda com 100 μL de meio organoide (ver passo 2.2.2 para mais instruções).
- Células de semeadura
- Após equilibrar os moldes do agarose de 1,5% nos poços (1 molde por o poço) de uma placa de 24 poços, remova meios organoid na parte externa dos moldes do agarose e incline a placa da cultura do tecido de modo que o meio da câmara de semeadura da pilha dos pratos do agarose possa igualmente ser cuidadosamente removidos.
- Veja as suspensões epiteliais (da etapa 2.1.9) e stromal (da etapa 2.1.8) o microscópio. Adicione mais meios organoid às suspensões epithelial ou stromal da pilha 100 μL em um momento, de modo que as suspensões sejam aproximadamente iguais na densidade.
Nota: Células epiteliais irão se juntar, e não é aconselhável para digerir/Trypsinize células epiteliais em suspensões de células únicas. - Combine 1 parte de pilhas stromal com 3 porções de pilhas epithelial pelo volume.
- Pipeta 50 μL (60.000 pilhas) da suspensão combinada da pilha na câmara de semeadura da pilha do molde do agarose.
- Uma vez que os moldes do agarose são enchidas com as pilhas, adicione com cuidado 400 μL de meios organoid frescos no poço da placa 24-well.
Nota: O meio atinge logo abaixo da superfície dos pratos de agarose e não fará com que as células flutuem para fora dos moldes. Após 2 − 3 dias, as células se instalam e começam a formar organóides. - Mude o meio cada segundo dia com 500 μL de meios organoid.
- Após 2-3 dias, mude o meio a um que é suplementado com o estradiol de 0,1 nanômetro (E) e a testosterona de 0,8 nanômetro (T) para promover a organização de pilhas epithelial e stromal.
Nota: Embora a organização de pilhas epithelial e stromal possa ocorrer com ou sem hormonas, mais organóides organizará na presença de hormonas.
3. colhendo Organoides endometriais para experimentos
Nota: Depois que o experimento é feito, os organóides endometriais podem ser processados para histologia ou análise de RNA. As etapas a seguir descrevem como processar os organóides.
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Histologia
- Dissolva 1,5% de agarose em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) por ebulição. Permita que o agarose líquido esfrie a aproximadamente 50 ° c.
- um microscópio de dissecação, incline a placa 24-well e pipeta com cuidado para fora o meio da parte externa do molde do agarose. Cuidadosamente pipeta para fora o meio do interior do molde do agarose para evitar interromper os organóides.
- um microscópio de dissecação, cuidadosamente Pipetar 70-75 μL de quente (50 ° c) 1,5% agarose na câmara do prato de agarose. Tenha cuidado para não perturbar os organóides.
- Deixe esfriar a 4 ° c por 5 min.
- Adicione o paraformaldeído de 4% (PFA) em cada poço da placa de 24 poços e fixe o molde selado inteiro do agarose que contem organóides durante a noite em 4 ° c. Em seguida, armazene em 70% etanol a 4 ° c até estar pronto para o processo de incorporação de parafina.
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Isolação do RNA
- um microscópio de dissecação, incline a placa 24-well e pipeta com cuidado para fora o meio da câmara do molde do agarose.
- A pipeta forcefully 1 ml do meio organoid fresco diretamente no molde do agarose assim que os organóides são liberados fora dos micropoços. Tenha cuidado para não criar muitas bolhas.
- Repita a pipetagem novamente com o mesmo meio da etapa 3.2.2.
- Colete todo o meio contendo os organóides. Centrifugue na velocidade máxima para recolher os organóides e para proceder à extração do RNA.
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Representative Results
Um esquema do protocolo é representado na Figura 1. O tecido uterine foi obtido da cirurgia depois que foi examinado por patologistas. O forro endometrial foi separado do miométrio raspando e o tecido endometrial foi digerido enzimaticamente às pilhas como esboçado no protocolo. As pilhas epithelial e stromal foram adicionadas em micropoços nos moldes do agarose. Após 7 dias na cultura, os organóides foram tratados com o e e o T por uns 7 − 14 dias adicionais.
Para o processamento histológico, os moldes de agarose contendo organóides endometriais foram selados com agarose seguido de fixação com 4% de PFA durante a noite. Estes moldes foram processados para a incorporação padrão da parafina, seccionado e manchado para a histologia, a imunofluorescência ou o immunohistochemistry. A coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (Figura 2a) revelou uma estrutura semelhante a esferóide com uma única camada de células que alinham o exterior e as células no centro. Os marcadores Cell-specific para o epithelial endometrial (E-cadherin) e as pilhas stromal (Vimentin) revelaram as pilhas epithelial que cercam o organoid com as pilhas stromal no centro (Figura 2B).
Os marcadores da fisiologia endometrial confirmaram que os organóides endometrial conservaram determinadas características do tecido nativo. A coloração Tricrômico, que mancha o colágeno azul e as células vermelhas, mostrou a presença de colágeno dentro do centro onde residiam as células estromais, demonstrando produção ativa e secreção de colágeno por células estromais semelhantes ao tecido nativo (Figura 3 A). Além disso, a coloração imuno-histoquímica revelou a presença de receptores de estrogênio (ER), receptores de andrógeno (AR) e receptores de progesterona (RP) nas células epitelial e estromal (Figura 3B).
Figura 1: geração de organóides endometriais 3D livres de Scaffold de células endometriais primárias humanas. Os tecidos uterine foram obtidos dos tecidos endometrial na pré-menopausa com patologia benigna e o forro endometrial foi extirpado da parte do tecido. Em cima da digestão enzimática, as pilhas epithelial e stromal endometrial foram semeadas em moldes do agarose de 1,5% em uma relação 3:1 pelo volume e mantidas no meio hormona-livre do sexo por até 7 dias. Estradiol (E) e testosterona (T) foram adicionados às culturas 3D para imitar os níveis de e e T durante a fase folicular de um ciclo menstrual10 e para promover a organização dos organóides. Adaptado de Teerawat et al., Jcem, (2019)11.
Figura 2: histologia e coloração imunofluorescente de marcadores específicos de células em organóides endometriais. Os organóides foram observados após 14 dias de tratamento hormonal Stepwise imitando a fase folicular de um ciclo menstrual normal (0,1 nM e e 0,8 nM T por 7 dias, 1 nM e e 0,8 nM T por 6 dias adicionais, seguidos por 1 nM e e 1,25 nM T por 1 dia). (A) a coloração de H & E foi feita em organóides embutidos em parafina. (B) marcadores específicos de células foram avaliados por coloração imunofluorescente de e-caderina (epitelial, vermelho), vimentina (estromal, verde) e 4 ′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; núcleo, azul) que revelaram a organização estrutural das células no organóides. Barra de escala = 20 μm. adaptado de Teerawat et al., Jcem, (2019) <11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: organóides endometriais exibem características do tecido nativo após 14 dias de tratamento hormonal de fase folicular. (A) a coloração Tricrômico foi feita para visualizar o colágeno (azul) e as células (vermelho). A mancha de trichrome foi executada no tecido endometrial (painel esquerdo) e nos organóides endometrial (barras da escala = 20 μm, painel direito). (B) a coloração imuno-histoquímica para er, ar e RP foi feita em tecido endometrial (barra de escala = 100 μm de painéis inferiores) e organóides endometriais (barra de escala = 20 μm, painéis superiores). A mancha positiva é mostrada na solução da mancha do marrom e do hematoxilina foi adicionada como a mancha contrária mostrada no azul. Adaptado de Teerawat et al., Jcem, (2019)11. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nós geramos os organóides endometrial humanos compreendidos das pilhas epithelial e stromal do endométrio sem o uso de materiais exógenos do andaime. Embora já tenha sido demonstrado que as células epiteliais do endométrio primário podem formar organóides6,7, essascélulas foram encaixadas em uma matriz gelatinosa de proteínas secretadas por células de sarcoma de camundongo (ver tabela de materiais) para ajudar forma spheroid-como estruturas. Além, as pilhas stromal endometrial eram ausentes. Nós especulamos que as pilhas stromal em nosso sistema, que é um componente de suporte essencial do tecido endometrial, forneceram o andaime para que as pilhas epithelial aderiram a e a sinalização do parácrina ocorresse entre tipos da pilha. A organização das pilhas epithelial em torno das pilhas stromal indicou uma interação ativa entre os dois tipos da pilha que forneceram as indicações fisiológicas. Como a resposta hormonal do endométrio se baseia em interações paracrinas entre as células epiteliais eestromais4,8,9,nossos organóides multicelulares fornecem um imitado alternativo, mais complexo do nativo Tecido.
Os organóides que foram gerados aqui foram principalmente células somáticas, embora um pequeno percentual de células foi semelhante a um tronco. Nós ainda não é esses organóides para várias gerações e não sei se eles iriam sobreviver e propagar. Além, os organóides endometrial são heterogêneos na natureza que não todos os organóides continham o mesmo número de pilhas epithelial, stromal ou de haste, mesmo aquelas que originam do mesmo tecido. Os tamanhos dos organóides igualmente diferiram e quando a maioria de pilhas se formaram esferóide como estruturas, as pilhas frouxas dentro de cada de micropoços foram observadas. A presença de e e de T pareceu promover a formação organoid com a organização específica de pilhas epithelial que alinham as pilhas exteriores e stromal no centro. Nós não testamos se E ou T sozinho promoveria a formação organoid e o que a duração óptima do tratamento seria. Testes adicionais de parâmetros e condições seriam benéficos para gerar os organóides endometriais ideais adequados para o experimento planejado.
O meio é um componente importante da cultura de organóides para promover o crescimento e a sobrevivência. De nossa experiência em trabalhar com pilhas endometrial, o crescimento de pilhas epithelial na cultura é o mais desafiante em contraste às pilhas stromal que se propagam bem. Os meios diferentes foram testados, incluindo os meios organoid da escolha (tabela dos materiais), que é usado para gerar mamoferas e tumorspheres do cancro da mama, que são da origem epithelial da pilha. Nossos testes revelaram que este meio permitiu que os organóides mantenham sua integridade estrutural e viabilidade ao longo das culturas de 14 − 28 dias. O efeito deste meio em pilhas stromal, entretanto, precisa a investigação adicional. Apesar de sua sobrevivência e produção de colágeno na mídia organoide, a taxa de proliferação observada na cultura 3D foi muito menor do que em monocamada. A proliferação diminuída pode entretanto ser devido à estrutura 3D também. Dado que os meios organoid usados estão comercialmente disponíveis, os componentes médios permanecem obscuros devido a sua natureza proprietária.
Em estudos futuros, nós imaginamos o aumento da complexidade desses organóides endometriais para incorporar outros tipos de células encontradas no endométrio, incluindo células endoteliais e imunes. Este é apenas o início da engenharia de um imitado endometrial completo que pode ser usado para estudar Biologia, função, doença, e para testar drogas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pela NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) e pela Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Nós gostaríamos de reconhecer a facilidade do núcleo da patologia do noroeste para processar os organóides fixos para a incorporação da parafina. Gostaríamos de reconhecer toda a equipe UG3, incluindo os laboratórios Woodruff, Burdette e Urbanek para as discussões e colaborações perspicazes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
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