Summary
Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.
Abstract
El endometrio humano es uno de los tejidos más hormonalmente sensibles en el cuerpo y es esencial para el establecimiento del embarazo. Este tejido también puede enfermarse y causar morbilidad e incluso la muerte. Los sistemas modelo para estudiar la biología endometrial humana se han limitado a los sistemas de cultivo in vitro de tipos de células únicas. Además, las células epiteliales, uno de los principales tipos celulares del endometrio, no propagan bien ni conservan sus rasgos fisiológicos en el cultivo, y por lo tanto nuestra comprensión de la biología endometrial sigue siendo limitada. Hemos generado, por primera vez, organoides endometriales que consisten en células epiteliales y estromales del endometrio humano. Estos organoides no requieren ningún material de andamio exógeno y se organizan específicamente para que las células epiteliales abarquen la estructura similar a los esferoides y se polarericen con células estromales en el centro que producen y secretan colágeno. Los receptores de estrógeno, progesterona y andrógenos se expresan en las células epiteliales y estromales y el tratamiento con niveles fisiológicos de estrógeno y testosterona promueven la organización de los organoides. Este nuevo sistema modelo se puede utilizar para estudiar la biología endometrial normal y la enfermedad de maneras que antes no eran posibles.
Introduction
El endometrio humano recubre la cavidad uterina y sirve como primer contacto para el embrión durante la implantación. El endometrio se compone de células epiteliales luminales y glandulares, fibroblastos estromales de apoyo, células endoteliales y células inmunitarias. Juntos, estos tipos de células conforman el tejido endometrial que es uno de los tejidos más sensibles a las hormonas esteroides sexuales1. Los cambios que ocurren durante cada ciclo menstrual son sorprendentes. Se requiere un crecimiento y remodelación adecuados del endometrio para permitir la implantación de embriones. Respuesta aberrante al estrógeno y la progesterona puede resultar en un endometrio refractario que no permite el establecimiento exitoso del embarazo e incluso puede resultar en enfermedades como la neoplasia endometrial.
Con el fin de estudiar las respuestas hormonales y los cambios esenciales que se producen en el endometrio, las células de los tejidos endometriales exhalados de los pacientes durante la cirugía o la biopsia endometrial se han propagado en el cultivo celular. Las células estromales endometriales proliferan y propagan fácilmente, y el proceso de diferenciación inducido por la progesterona puede recapitularse in vitro. Como resultado, mucho se ha aprendido durante este proceso de diferenciación, llamado decidualización2,3. El otro tipo de célula importante en el endometrio, las células epiteliales luminales y glandulares, sin embargo, no crecen bien como las monocapas tradicionales, perdiendo polaridad, convirtiéndose en senescente, y teniendo un potencial proliferativo limitado. Como resultado, se sabe menos de su biología y su papel en el endometrio humano. Como muchas neoplasias se originan a partir de las células epiteliales, los mecanismos asociados con la hiperplasia o la transformación a las células cancerosas siguen estando completamente definidos. Además, los estudios han establecido que la respuesta hormonal implica las acciones paracrinos íntimas entre las células epiteliales y estromales del endometrio4,5.
Recientemente, dos grupos independientes6,7,que son los primeros informes de organoides formados a partir de tejido endometrial, estableció un cultivo organoide tridimensional (3D) de células epiteliales endometriales. Estos organoides estaban compuestos de células epiteliales endometriales incrustadas dentro de una matriz proteica(Tabla de Materiales)y no incluían un compartimiento sensible hormonalmente importante del endometrio endometrial, los fibroblastos estromales. Como las proteínas de la matriz pueden variar de un lote a un lote y pueden desencadenar vías de señalización que no necesariamente se producen en el tejido, sería ideal reemplazar las proteínas de matriz con componentes del endometrio. En el estudio actual, se presenta un protocolo para generar organoides endometriales humanos libres de andamios de células epiteliales y estromales del endometrio humano. La presencia de células estromales no sólo proporciona el apoyo a las células epiteliales, sino que también proporciona las acciones paracrinos necesarias que se han establecido para ser importantes para la respuesta de la hormona endometrial4,8,9 .
El nuevo organoide endometrial multicelular ofrece un sistema modelo del endometrio que es fácil de generar y que incorpora células epiteliales y estromales. Estos organoides se pueden utilizar para estudiar cambios hormonales a largo plazo y eventos tempranos de enfermedad como la tumorigenesis debido a desequilibrio hormonal o insultos exógenos. La complejidad de estos organoides podría eventualmente ampliarse para incluir otros tipos celulares, incluyendo células endoteliales e inmunes con células posiblemente miometriales para imitar realmente la fisiología del tejido humano.
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Protocol
Se recogieron muestras de endometriales de mujeres premenopáusicas sometidas a histerectomía de rutina para afecciones uterinas benignas en el Hospital de Mujeres de la Universidad Northwestern Prentice, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todas las mujeres incluidas en el estudio.
1. Preparación de moldes de agarosa
- Antes del inicio del aislamiento celular, moldee y equilibra 1.5% micromoldes de agarosa(Tabla de Materiales)para albergar los organoides de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Generación de organoides endometriales
- Cosecha de células estromales y epiteliales primarias
- En un gabinete de bioseguridad utilizando una técnica aséptica, prepare la solución enzimática (2,5 mg/ml de colagenasa tipo I + 0,1 mg/ml de DNase I en 10 ml de dosis [500 unidades]) a 37 oC, y filtre estérilmente la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,2 m en un tubo cónico de 15 ml.
- En un gabinete de bioseguridad utilizando una técnica aséptica, raspa el endometrio de las biopsias uterinas y el tejido picado bajo el capó en trozos muy pequeños con un bisturí.
NOTA: Se requiere tejido endometrial de al menos 20 mm x 10 mm x 1 mm para generar un número suficiente de organoides. - Poner tejido recién picado en la solución enzimática en un tubo cónico de 15 ml. Cierre la tapa y envuelva la tapa con una película de cera(Tabla de materiales)para evitar la contaminación.
- Coloque el tubo con tejido en un baño de agua o una incubadora a 37 oC durante 30 minutos con un suave temblor (80-100 rpm).
- Apilar un colador de células de 100 m en la parte superior de un colador de células de 20 m en un tubo cónico de 50 ml. Filtrar la solución a través de los dos coladores, y luego enjuagar el tubo cónico de 15 ml con 10 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS; Tabla de Materiales) y poner el lavado a través del colador para asegurarse de que todas las células se recogen.
NOTA: El líquido de flujo a través contiene células estromales y glóbulos rojos (20 ml en total). Las células epiteliales se recogen en el colador de 20 m. Los trozos de tejido no digerido permanecen encima del colador de 100 m. Deseche el tejido no digerido en un contenedor de residuos peligrosos. - Invierta el colador de células de 20 m del paso 2.1.5 en un nuevo tubo cónico de 50 ml y lave las células epiteliales del colador con 20 ml de medios organoides(Tabla de materiales)complementados con 1% de pluma/estreptococo.
- Centrifugar los tubos cónicos de los escalones 2.1.5 y 2.1.6 a 500 x g durante 5 min.
- Con las células estromales recogidas, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet con 10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incubar a 37 oC durante 10 a 15 minutos. Centrifule el tubo cónico a 500 x g durante 5 min, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet con 200 a 300 ml de medios organoides (consulte el paso 2.2.2 para obtener más instrucciones).
- Con las células epiteliales recogidas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender con 100 s de medios organoides (consulte el paso 2.2.2 para obtener más instrucciones).
- Células de sembrado
- Después de equilibrar los moldes de agarosa del 1,5% en pozos (1 molde por pozo) de una placa de 24 pocillos, retire los medios organoides en el exterior de los moldes de agarosa e incline la placa de cultivo de tejido para que el medio de la cámara de sembración celular de los platos de agarosa también pueda ser cuidadosamente retirados.
- Vea las suspensiones celulares epiteliales (del paso 2.1.9) y estromales (del paso 2.1.8) bajo el microscopio. Añadir más medios organoides a las suspensiones de células epiteliales o estromales 100 oL a la vez, de modo que las suspensiones sean aproximadamente iguales en densidad.
NOTA: Las células epiteliales se aglutinarán, y no es aconsejable digerir/trippsinizar las células epiteliales en suspensiones de una sola célula. - Combine 1 parte de las células estromales con 3 partes de células epiteliales por volumen.
- Pipetear 50 l (60.000 células) de la suspensión de celda combinada en la cámara de sembración celular del molde de agarosa.
- Una vez que los moldes de agarosa se llenan de células, agregue cuidadosamente 400 ml de medios organoides frescos en el pozo de la placa de 24 pocillos.
NOTA: El medio llega justo debajo de la superficie de los platos de agarosa y no hará que las células flotan fuera de los moldes. Después de 2 a 3 días, las células se asentarán y comenzarán a formar organoides. - Cambie el medio cada segundo día con 500 ml de medios organoides.
- Después de 2-3 días, cambiar medio a uno que se complementa con 0.1 nM estradiol (E) y 0.8 nM testosterona (T) para promover la organización de células epiteliales y estromales.
NOTA: Aunque la organización de las células epiteliales y estromales puede ocurrir con o sin hormonas, más organoides se organizarán en presencia de hormonas.
3. Cosecha de organoides endometriales para experimentos
NOTA: Una vez realizado el experimento, los organoides endometriales se pueden procesar para su histología o análisis de ARN. Los pasos siguientes describen cómo procesar los organoides.
-
Histología
- Disolver 1.5% agarosa en solución salina con fosfato (PBS) por ebullición. Deje que el agarosa líquida se enfríe a aproximadamente 50 oC.
- Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pocillos y pipetee cuidadosamente el medio desde el exterior del molde de agarosa. Pipetear cuidadosamente el medio del interior del molde de agarosa para evitar interrumpir los organoides.
- Bajo un microscopio de disección, pipeta cuidadosamente 70-75 s de caliente (50 oC) 1.5% agarose en la cámara de la placa de agarosa. Tenga cuidado de no molestar a los organoides.
- Dejar enfriar a 4oC durante 5 min.
- Añadir un 4% de paraformaldehído (PFA) en cada pocal de la placa de 24 pocillos y fijar todo el molde de agarosa sellada que contiene organoides durante la noche a 4 oC. Luego almacenar en 70% etanol a 4 oC hasta que esté listo para procesar para la incrustación de parafina.
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Aislamiento de ARN
- Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pocillos y pipetee cuidadosamente el medio de la cámara del molde de agarosa.
- Pipeta forzosa de 1 ml de medio organoide fresco directamente en el molde de agarosa para que los organoides se expulsen de los micropozos. Tenga cuidado de no crear demasiadas burbujas.
- Repita el pipeteo de nuevo con el mismo medio del paso 3.2.2.
- Recoger todo el medio que contiene los organoides. Centrifugar a la velocidad máxima para recoger los organoides y proceder a la extracción de ARN.
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Representative Results
En la Figura 1se muestra un esquema del protocolo. El tejido uterino se obtuvo de la cirugía después de que fue examinado por los patólogos. El revestimiento endometrial se separó del miometrio raspando y el tejido endometrial se digería enzimáticamente a las células como se describe en el protocolo. Las células epiteliales y estromales se añadieron a los micropozos en los moldes de agarosa. Después de 7 días en cultivo, los organoides fueron tratados con E y T durante 7 a 14 días adicionales.
Para el procesamiento histológico, los moldes de agarosa que contienen organoides endometriales fueron sellados con agarosa seguida de fijación con 4% de PFA durante la noche. Estos moldes fueron procesados para la incrustación estándar de parafina, seccionados y manchados para histología, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E)(Figura 2A)reveló una estructura similar a un esferoide con una sola capa de células que recubren el exterior y las células en el centro. Los marcadores específicos de las células para las células epiteliales endometriales (E-cadherina) y estromales (vimentina) revelaron células epiteliales que rodean el organoides con células estromales en el centro(Figura 2B).
Marcadores de fisiología endometrial confirmaron que los organoides endometriales retenían ciertas características del tejido nativo. La tinción tricroma, que mancha el azul de colágeno y las células rojas, mostró la presencia de colágeno dentro del centro donde residían las células estromales, demostrando la producción activa y la secreción de colágeno por células estromales similares al tejido nativo(Figura 3 A). Además, la tinción inmunohistoquímica reveló la presencia de receptores de estrógeno (ER), receptores de andrógenos (AR) y receptores de progesterona (PR) en las células epiteliales y estromales(Figura 3B).
Figura 1: Generación de organoides endometriales 3D libres de andamios a partir de células endometriales primarias humanas. Los tejidos uterinos se obtuvieron de tejidos endometriales premenopáusicos con patología benigna y el revestimiento endometrial se extirpó de la pieza tisular. Tras la digestión enzimática, las células epiteliales y estromales endometriales se sembraron en moldes de agarosa del 1,5% en una proporción de 3:1 en volumen y se mantuvieron en un medio libre de hormonas sexuales durante un máximo de 7 días. Estradiol (E) y testosterona (T) se añadieron a los cultivos 3D para imitar los niveles de E y T durante la fase folicular de un ciclo menstrual10 y para promover la organización de los organoides. Adaptado de Teerawat et al., JCEM, (2019)11.
Figura 2: Histología y tinción inmunofluorescente de marcadores celulares específicos en organoides endometriales. Se observaron organoides después de 14 días de tratamiento hormonal escalonado imitando la fase folicular de un ciclo menstrual normal (0,1 nM E y 0,8 nM T durante 7 días, 1 nM E y 0,8 nM T durante 6 días adicionales, seguidos de 1 nM E y 1,25 nM T durante 1 día). (A) la tinción de H&E se realizó en organoides incrustados en parafina. (B) Los marcadores específicos de las células se evaluaron mediante la tinción inmunofluorescente de E-cadherina (epitelial, roja), vimentina (estromado, verde) y 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; núcleo, azul) que reveló la organización estructural de las células en las células en la célula organoides. Barra de escala a 20 m. Adaptado de Teerawat et al., JCEM, (2019)<11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Losorganoides endometriales exhiben características del tejido nativo después de 14 días de tratamiento hormonal en fase folicular. (A) La tinción tricroma se realizó para visualizar colágeno (azul) y células (rojo). La mancha tricroma se realizó en tejido endometrial (panel izquierdo) y organoides endometriales (barras de escala de 20 m, panel derecho). (B) La tinción inmunohistoquímica para ER, AR y PR se realizó en tejido endometrial (barra de escala de 100 m de paneles inferiores) y organoides endometriales (barra de escala de 20 m, paneles superiores). La mancha positiva se muestra en marrón y se añadió solución de tinción de hematoxilina como la mancha de contador mostrada en azul. Adaptado de Teerawat et al., JCEM, (2019)11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos generado organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Si bien ya se ha demostrado que las células epiteliales endometriales primarias pueden formar organoides6,7, estas células se incrustaron en una matriz gelatinosa de proteínas secretadas por las células del sarcoma del ratón (ver Tabla de Materiales)para ayudar a forman estructuras esferoides. Además, las células estromales endometriales estaban ausentes. Especulamos que las células estromales de nuestro sistema, que es un componente de apoyo esencial del tejido endometrial, proporcionaron el andamio para que las células epiteliales se adhieran y la señalización paracrina se produjo entre los tipos de células. La organización de las células epiteliales alrededor de las células estromales indicó una interacción activa entre los dos tipos de células que proporcionaban las señales fisiológicas. Como la respuesta hormonal del endometrio se basa en interacciones paracrinos entre las células epiteliales y estromales4,8,9, nuestros organoides multicelulares proporcionan una imitación alternativa y más compleja de la célula nativa Tejido.
Los organoides que se generaron aquí eran en su mayoría células somáticas, aunque un pequeño porcentaje de células era similar a un tallo. Todavía no hemos pasado estos organoides durante varias generaciones y no sabemos si sobrevivirían y se propagarían. Además, los organoides endometriales son de naturaleza heterogénea, ya que no todos los organoides contenían el mismo número de células epiteliales, estromales o madres, incluso las procedentes del mismo tejido. Los tamaños de los organoides también diferían y mientras que la mayoría de las células formaban esferoides como estructuras, se observaron células sueltas dentro de cada micropo. La presencia de E y T parecía promover la formación de organoides con la organización específica de células epiteliales que recubren las células externas y estromales en el centro. No hemos probado si E o T por sí solos promoverían la formación de organoides y cuál sería la duración óptima del tratamiento. Pruebas adicionales de parámetros y condiciones serían beneficiosas para generar los organoides endometriales ideales adecuados para el experimento planeado.
El medio es un componente importante del cultivo de organoides para promover el crecimiento y la supervivencia. A partir de nuestra experiencia en el trabajo con células endometriales, el crecimiento de células epiteliales en el cultivo es el más desafiante en contraste con las células estromales que se propagan bien. Se probaron diferentes medios, incluyendo los medios organoides de elección(Tabla de Materiales),que se utiliza para generar mamesferas y tumoresferas de cáncer de mama, que son de origen epitelial celular. Nuestras pruebas revelaron que este medio permitió a los organoides mantener su integridad estructural y viabilidad a lo largo de cultivos de 14 a 28 días. El efecto de este medio en las células estromales, sin embargo, necesita una investigación adicional. A pesar de su supervivencia y producción de colágeno en los medios organoides, la tasa de proliferación observada en el cultivo 3D fue mucho menor que en monocapas. Sin embargo, la disminución de la proliferación también puede deberse a la estructura 3D. Dado que los medios organoides utilizados están disponibles comercialmente, los componentes medios siguen sin estar claros debido a su naturaleza patentada.
En estudios futuros, prevemos aumentar la complejidad de estos organoides endometriales para incorporar otros tipos celulares que se encuentran en el endometrio, incluyendo células endoteliales e inmunitarias. Esto es sólo el comienzo de la ingeniería de un imitador endometrial completo que se puede utilizar para estudiar biología, función, enfermedad, y para probar medicamentos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por la subvención NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) y el fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Nos gustaría reconocer el Centro Básico de Patología del Noroeste para procesar los organoides fijos para la incrustación de parafina. Nos gustaría reconocer a todo el equipo de UG3, incluidos los laboratorios Woodruff, Burdette y Urbanek, por las discusiones y colaboraciones perspicaces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
