Summary
Viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali primari umani costituiti da cellule epiteliali e stromali e che conservano le caratteristiche del tessuto endometriale nativo. Questo protocollo descrive i metodi dall'acquisizione del tessuto uterino all'elaborazione istologica degli organoidi endometriali.
Abstract
L'endometrio umano è uno dei tessuti più ormonali reattivi nel corpo ed è essenziale per l'istituzione della gravidanza. Questo tessuto può anche diventare malato e causare morbilità e persino la morte. I sistemi modello per studiare la biologia endometriale umana sono stati limitati a sistemi di coltura in vitro di tipo a cellula singola. Inoltre, le cellule epiteliali, uno dei principali tipi di cellule dell'endometrio, non si propagano bene o mantengono i loro tratti fisiologici nella coltura, e quindi la nostra comprensione della biologia endometriale rimane limitata. Abbiamo generato, per la prima volta, organoidi endometriali costituiti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio umano. Questi organoidi non richiedono materiali di impalcatura esogeni e specificamente organizzano in modo che le cellule epiteliali comprendano la struttura simile a uno sferoide e diventino polarizzate con cellule stromali al centro che producono e secernono collagene. I recettori dell'estrogeno, del progesterone e dell'androgeno sono espressi nelle cellule epiteliali e stromali e il trattamento con livelli fisiologici di estrogeni e testosterone promuovono l'organizzazione degli organoidi. Questo nuovo sistema modello può essere utilizzato per studiare la biologia endometriale normale e la malattia in modi che prima non erano possibili.
Introduction
L'endometrio umano allinea la cavità uterina e serve come primo contatto per l'embrione durante l'impianto. L'endometrio è composto da cellule epiteliali luminali e ghiandolari, fibroblasti stromali di supporto, cellule endoteliali e cellule immunitarie. Insieme, questi tipi di cellule costituiscono il tessuto endometriale che è uno dei tessuti più reattivi agli ormoni steroidei sessuali1. I cambiamenti che si verificano durante ogni ciclo mestruale sono sorprendenti. È necessaria un'adeguata crescita e rimodellamento dell'endometrio per consentire l'impianto dell'embrione. La risposta aberrante agli estrogeni e al progesterone può provocare un endometrio refrattario che non consente l'istituzione di una gravidanza di successo e può anche provocare malattie tra cui la neoplasia endometriale.
Al fine di studiare le risposte ormonali e i cambiamenti essenziali che si verificano nell'endometrio, le cellule dei tessuti endometriali eccitate dai pazienti durante l'intervento chirurgico o la biopsia endometriale sono state propagate nella coltura cellulare. Le cellule stromali endometriali proliferano preferibilmente e si propagano prontamente, e il processo di differenziazione indotto dal progesterone può essere ricapitolato in vitro. Di conseguenza, molto è stato appreso durante questo processo di differenziazione, definito deciduizzazione2,3. L'altro tipo di cellula principale nell'endometrio, le cellule epiteliali luminali e ghiandolare, tuttavia, non crescono così come i monostrati tradizionali, perdendo la polarità, diventando senescenti e con un limitato potenziale proliferare. Di conseguenza, meno è noto della loro biologia e del loro ruolo nell'endometrio umano. Poiché molti neoplasia provengono dalle cellule epiteliali, i meccanismi associati all'iperplasia o alla trasformazione nelle cellule tumorali rimangono da definire completamente. Inoltre, gli studi hanno stabilito che la risposta ormonale coinvolge le azioni paracrine intime tra le cellule epiteliali e stromali dell'endometrio4,5.
Recentemente, una coltura organoide tridimensionale (3D) di cellule epiteliali endometriali è stata stabilita da due gruppi indipendenti6,7, che sono i primi rapporti di organoidi formati dal tessuto endometriale. Questi organoidi erano costituiti da cellule epiteliali endometriali incorporate all'interno di una matrice proteica (Table of Materials) e non includevano un importante compartimento ormonale reattivo dell'endometrio endometriale, i fibroblasti stromali. Poiché le proteine della matrice possono variare da un lotto all'altro e possono innescare percorsi di segnalazione che non si verificano necessariamente nel tessuto, sarebbe ideale sostituire le proteine della matrice con componenti dell'endometrio. Nello studio attuale, viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali umani privi di scaffold di cellule epiteliali e stromali dell'endometrio umano. La presenza di cellule stromali non solo fornisce il supporto per le cellule epiteliali, ma fornisce anche le azioni paracrine necessarie che sono state stabilite per essere importanti per la risposta dell'ormone endometriale4,8,9 .
Il nuovo organoide endometriale multicellulare offre un sistema modello dell'endometrio che è semplice da generare e che incorpora cellule epiteliali e stromali. Questi organoidi possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti ormonali a lungo termine e i primi eventi di malattia come la tumorigenesi a causa di squilibri ormonali o insulti esogeni. La complessità di questi organoidi potrebbe infine essere ampliata per includere altri tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali e immunitarie con cellule potenzialmente miometriali per imitare veramente la fisiologia del tessuto umano.
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Protocol
Campioni endometriali sono stati raccolti da donne in premenopausa sottoposte a isterectomia di routine per condizioni uterine benigne presso il Northwestern University Prentice Women's Hospital, secondo un protocollo approvato dall'Institutional Review Board. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutte le donne incluse nello studio.
1. Preparazione delle muffe Agarose
- Prima di iniziare l'isolamento cellulare, lanciare ed eclicare 1,5% di micro stampi agarose (Tabella dei materiali) per ospitare gli organoidi secondo le istruzioni del produttore.
2. Generazione di organoidi endometriali
- Raccogliere cellule stromali ed epiteliali primarie
- In un armadio di biosicurezza con tecnica asettica, preparare la soluzione enzimatica (2,5 mg/mL di tipo collagenase I - 0,1 mg/mL DNase I in 10 mL di dispasi [500 unità]) a 37 mL, e sterile-filtro la soluzione utilizzando un filtro di siringa 0,2 m in un tubo conico 15 mL.
- In un armadio di biosicurezza con tecnica asettica, raschiare l'endometrio dalle biopsie uterine e macinare il tessuto sotto il cappuccio in pezzi molto piccoli con un bisturi.
NOT: Il tessuto endometriale di almeno 20 mm x 10 mm x 1 mm è necessario per generare un numero sufficiente di organoidi. - Mettere il tessuto appena macinato nella soluzione enzimatica in un tubo conico da 15 mL. Chiudere il tappo e avvolgere la parte superiore con una pellicola di cera (Tabella dei materiali) per evitare la contaminazione.
- Mettete il tubo con il tessuto in un bagno d'acqua o in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 30 min con agitazione delicata (80-100 giri/m).
- Impilare un colino a 100 m sopra un colino da 20 m su un tubo conico da 50 ml. Filtrare la soluzione attraverso i due ceppi, quindi sciacquare il tubo conico da 15 mL con 10 mL di soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS; Tabella dei materiali) e mettere il lavaggio attraverso il colino per garantire che tutte le cellule siano raccolte.
NOT: Il liquido fluivo contiene globuli stromali e globuli rossi (20 mL in totale). Le cellule epiteliali vengono raccolte sul colino da 20 m. Pezzi di tessuto non digerito rimangono in cima al colino da 100 m. Eliminare il tessuto non digerito in un contenitore di rifiuti di pericolo biologico. - Invertire il colino a 20 m dal passo 2.1.5 su un nuovo tubo conico da 50 ml e lavare le cellule epiteliali dal colino con 20 mL di supporti organoidi (Tabella dei materiali) completate con 1% di penna/strep.
- Centrifugare i tubi conici da passi 2.1.5 e 2.1.6 a 500 x g per 5 min.
- Con le cellule strone raccolte, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 10 mL di lisi di lissi dei globuli rossi. Incubare a 37oC per 10-15 min. Centrifugare il tubo conico a 500 x g per 5 min, rimuovere il supernatante, e sospendere nuovamente il pellet con 200'300 l di supporti organoidi (vedere passo 2.2.2 per ulteriori istruzioni).
- Con le cellule epiteliali raccolte, rimuovere il sovratalgarico e sospendere nuovamente con 100 -L di supporti organoidi (vedere il passaggio 2.2.2 per ulteriori istruzioni).
- Seeding cellule
- Dopo aver equilibrato l'1,5% di stampi agarose in pozzetti (1 stampo per pozzo) di una piastra di 24 pozzetti, rimuovere i supporti organoidi all'esterno degli stampi agarose e inclinare la piastra di coltura del tessuto in modo che il mezzo dalla camera di semina cellulare dei piatti agarose può anche essere accuratamente rimosso.
- Visualizzare le sospensioni epiteliali (dal punto 2.1.9) e stromali (dal punto 2.1.8) delle sospensioni cellulari al microscopio. Aggiungere più supporti organoidi alle sospensioni delle cellule epiteliali o stromali 100 gradi alla volta, in modo che le sospensioni siano approssimativamente uguali in densità.
NOT: Le cellule epiteliali si aggregano insieme, e non è consigliabile digerire / provare le cellule epitiniali in sospensioni a cella singola. - Combina 1 parte delle cellule stromali con 3 parti di cellule epiteliali per volume.
- Pipetta 50 L (60.000 cellule) della sospensione cellulare combinata nella camera di semina cellulare dello stampo agarose.
- Una volta che gli stampi di agarose sono riempiti con le cellule, aggiungere con cura 400 - L di supporti organoidi freschi nel pozzo della piastra di 24 pozze.
NOT: Il mezzo raggiunge appena sotto la superficie dei piatti agarose e non farà galleggiare le cellule fuori dagli stampi. Dopo 2/3 giorni, le cellule si depositano e iniziano a formare organoidi. - Cambiare media ogni due giorni con 500 -L di supporti organoidi.
- Dopo 2-3 giorni, cambiare medio a uno che è integrato con 0.1 nM estradiol (E) e 0.8 nM di testosterone (T) per promuovere l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali.
NOT: Anche se l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali può verificarsi con o senza ormoni, più organoidi si organizzeranno in presenza di ormoni.
3. Raccolta degli organidi endometriali per gli esperimenti
NOT: Una volta fatto l'esperimento, gli organoidi endometriali possono essere elaborati per l'istologia o l'analisi dell'RNA. I passaggi seguenti descrivono come elaborare gli organoidi.
-
Istologia
- Sciogliere l'1,5% di agarose nella salina con buffer fosfato (PBS) bollendo. Lasciare raffreddare l'agarose liquido a circa 50 gradi centigradi.
- Sotto un microscopio dissettivo, inclinare la piastra di 24 pozze e pipetta con attenzione fuori dal mezzo dall'esterno dello stampo agarose. Attentamente pipette fuori il mezzo dall'interno dello stampo agarose per evitare di interrompere gli organoidi.
- Al microscopio sezionato, con cura la pipetta 70-75 - L di caldo (50 oC) 1,5% agarose nella camera del piatto di agarose. Fare attenzione a non disturbare gli organoidi.
- Lasciar raffreddare a 4 gradi centigradi per 5 min.
- Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in ogni pozzetto della piastra 24 e fissare l'intero stampo agarose sigillato contenente organoidi durante la notte a 4 gradi centigradi. Quindi conservare nel 70% di etanolo a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'elaborazione per l'incorporamento della paraffina.
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Isolamento dell'RNA
- Al microscopio dissezioso, inclinare la piastra di 24 pozze e pipetta con attenzione fuori dalla camera dello stampo agarose.
- Con forza pipetta 1 mL di mezzo organoide fresco direttamente nello stampo agarose in modo che gli organoidi vengano scaricati dai micropozzi. Fare attenzione a non creare troppe bolle.
- Ripetere la pipa con lo stesso supporto dal passaggio 3.2.2.
- Raccogliere tutto il mezzo contenente gli organoidi. Centrifuga a velocità massima per raccogliere gli organoidi e procedere all'estrazione dell'RNA.
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Representative Results
Uno schema del protocollo è illustrato nella Figura 1. Il tessuto uterino è stato ottenuto da un intervento chirurgico dopo che è stato esaminato dai patologi. Il rivestimento endometriale è stato separato dal miometrio raschiando e il tessuto endometriale è stato enzimaticamente digerito alle cellule come delineato nel protocollo. Le cellule epiteliali e stromali sono state aggiunte nei micropozzi negli stampi agarose. Dopo 7 giorni di coltura, gli organoidi sono stati trattati con E e T per altri 7-14 giorni.
Per la lavorazione istologica, gli stampi di agarose contenenti organoidi endometriali sono stati sigillati con agarose seguita da fissazione con 4% PFA durante la notte. Questi stampi sono stati elaborati per l'incorporamento standard della paraffina, sezionato e macchiato per l'istologia, l'immunofluorescenza o l'immunohistochimica. La colorazione ematossia e eosina (H&E) (Figura 2A) ha rivelato una struttura simile a uno sferoide con un singolo strato di celle che rivestono l'esterno e le celle al centro. I marcatori specifici delle cellule per l'epiteliale endometriale (E-cadherin) e le cellule stromali (vimentina) hanno rivelato cellule epiteliali che circondano l'organoide con cellule stromali al centro(Figura 2B).
I marcatori della fisiologia endometriale hanno confermato che gli organoidi endometriali conservavano alcune caratteristiche del tessuto nativo. La colorazione tricromatica, che macchia il collagene blu e le cellule rosse, ha mostrato la presenza di collagene all'interno del centro in cui risiedevano le cellule stromali, dimostrando la produzione attiva e la secrezione del collagene da parte di cellule stromali simili al tessuto nativo(Figura 3 A). Inoltre, la colorazione immunoistochimica ha rivelato la presenza di recettori estrogeni (ER), recettori degli androgeni (AR) e recettori del progesterone (PR) nelle cellule epiteliali e stromali (Figura 3B).
Figura 1: Generazione di organoidi endometriali 3D senza scaffold da cellule endometriali primarie umane. I tessuti uterini sono stati ottenuti da tessuti endometriali premenopausali con patologia benigna e il rivestimento endometriale è stato espulso dal pezzo di tessuto. Al momento della digestione enzimatica, le cellule endometriali e stromali sono state seminate in stampi di agarose dell'1,5% con un rapporto 3:1 per volume e mantenuti in mezzi senza ormoni sessuali per un massimo di 7 giorni. Estradiolo (E) e testosterone (T) sono stati aggiunti alle colture 3D per imitare i livelli di E e T durante la fase follicolare di un ciclo mestruale10 e per promuovere l'organizzazione degli organoidi. Adattato da Teerawat et al., JCEM, (2019)11.
Figura 2: Istologia e colorazione immunofluorescente di marcatori specifici delle cellule sugli organoidi endometriali. Gli organidi sono stati osservati dopo 14 giorni di trattamento ormonale graduale che imitavano la fase follicolare di un normale ciclo mestruale (0,1 nM E e 0,8 nM T per 7 giorni, 1 nM E e 0,8 nM T per altri 6 giorni, seguiti da 1 nM E e 1,25 nM T per 1 giorno). (A) La colorazione H&E è stata effettuata su organoidi incorporati di paraffina. (B) I marcatori specifici delle cellule sono stati valutati mediante colorazione immunofluorescente di E-cadherin (epiteliale, rosso), vimentina (stromale, verde) e 4,6-diamidino-2-fenilondole (DAPI; nucleo, blu) che ha rivelato l'organizzazione strutturale delle cellule organoidi. Barra di scala - 20 m. Adattato da Teerawat et al., JCEM, (2019)<11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gli organoidi endometriali presentano caratteristiche del tessuto nativo dopo 14 giorni di trattamento dell'ormone di fase follicolare. (A) La colorazione tricromatica è stata fatta per visualizzare il collagene (blu) e le cellule (rosso). La macchia tricromatica è stata eseguita su tessuto endometriale (pannello sinistro) e organoid endometriali (barre di scala - 20 m, pannello destro). (B) La colorazione immunoistochimica per ER, AR e PR è stata effettuata in tessuto endometriale (barra di scala - 100 pannelli inferiori) e organoidi endometriali (barra di scala - 20 m, pannelli superiori). La macchia positiva è mostrata in una soluzione di macchia marrone ed ematossilina aggiunta come la macchia del contatore mostrata in blu. Adattato da Teerawat et al., JCEM, (2019)11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo generato organoidi endometriali umani composti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio senza l'uso di materiali scaffold esogeni. Mentre è già stato dimostrato che le cellule epiteliali endometriali primarie possono formare organoidi6,7, queste cellule sono state incorporate in una matrice gelatinosa di proteine secrete da cellule di sarcoma del topo (vedi Tabella dei materiali)per aiutare formano strutture simili a sferoidi. Inoltre, le cellule stromali endometriali erano assenti. Ipotizziamo che le cellule stromali del nostro sistema, che è una componente di supporto essenziale del tessuto endometriale, a condizione che l'impalcatura per le cellule epiteliali ad aderire e segnalazione paracrina si è verificato tra i tipi di cellule. L'organizzazione delle cellule epiteliali intorno alle cellule stromali ha indicato un'interazione attiva tra i due tipi di cellule che ha fornito i segnali fisiologici. Poiché la risposta ormonale dell'endometrio si basa sulle interazioni paracrine tra le cellule epiteliali e stromali4,8,9, i nostri organoidi multicellulari forniscono un'imitazione alternativa e più complessa fazzoletto.
Gli organoidi che sono stati generati qui erano per lo più cellule somatiche, anche se una piccola percentuale di cellule era simile a quello stemo. Non abbiamo ancora passaggiato questi organoidi per più generazioni e non sappiamo se sopravviverebbero e si propagheranno. Inoltre, gli organoidi endometriali sono di natura eterogenea in quanto non tutti gli organoidi contenevano lo stesso numero di cellule epiteliali, stromali o staminali, anche quelle provenienti dallo stesso tessuto. Anche le dimensioni degli organoidi differivano e mentre la maggior parte delle cellule formavano sferoidi come strutture, sono state osservate cellule sciolte all'interno di ogni micropo. La presenza di E e T sembrava promuovere la formazione organoide con l'organizzazione specifica di cellule epiteliali che rivestono le cellule esterne e stromali al centro. Non abbiamo testato se E o T da solo promuoverebbero la formazione di organoidi e quale sarebbe la durata ottimale del trattamento. Ulteriori test dei parametri e delle condizioni sarebbero utili per generare gli organoidi endometriali ideali adatti per l'esperimento pianificato.
Il medium è una componente importante della coltura degli organoidi per promuovere la crescita e la sopravvivenza. Dalla nostra esperienza nel lavoro con cellule endometriali, la crescita delle cellule epiteliali nella coltura è la più difficile in contrasto con le cellule stromali che si propagano bene. Sono stati testati diversi mezzi di comunicazione, tra cui i supporti organoidi di scelta (Tabella dei materiali), che viene utilizzato per generare mammosfere e sfere tumorali del cancro al seno, che sono di origine epiteliale. I nostri test hanno rivelato che questo mezzo ha permesso agli organoidi di mantenere la loro integrità strutturale e vitalità nel corso di colture di 14-28 giorni. L'effetto di questo mezzo sulle cellule stromali, tuttavia, richiede ulteriori indagini. Nonostante la loro sopravvivenza e la produzione di collagene nei supporti organoidi, il tasso di proliferazione osservato nella cultura 3D era molto meno che nei monostrati. La diminuzione della proliferazione può tuttavia essere dovuta anche alla struttura 3D. Dato che i supporti organoidi utilizzati sono disponibili in commercio, i componenti medi rimangono poco chiari a causa della sua natura proprietaria.
In studi futuri, abbiamo immaginato di aumentare la complessità di questi organoidi endometriali per incorporare altri tipi di cellule presenti nell'endometrio, comprese le cellule endoteliali e immunitarie. Questo è solo l'inizio della progettazione di un'imitazione endometriale completa che può essere utilizzata per studiare biologia, funzione, malattia e per testare i farmaci.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dalla sovvenzione NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) e dal fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Vorremmo riconoscere lo strumento di patologia nordoccidentale per l'elaborazione degli organoidi fissi per l'incorporamento della paraffina. Vorremmo conoscere l'intero team UG3, compresi i laboratori Woodruff, Burdette e Urbanek, per le discussioni e le collaborazioni approfondite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose HS, molecular biology grade | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Agarose molds | Sigma-Aldrich | Z764043 | (https://www.microtissues.com/) |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Amresco | 0621 | |
| β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | |
| Collagenase, Type II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4513 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Eosin Stain | VWR | 95057-848 | |
| Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9101-S | |
| Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1x without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hematoxylin Stain Solution | Thermo Fisher Scientific | 3530-32 | Modified Harris formulation, mercury free |
| Heparin solution | STEMCELL Technologies | 07980 | added to MammoCult media |
| Hydrocortisone stock solution | STEMCELL Technologies | 07925 | added to MammoCult media |
| Organoid media - Mammocult | STEMCELL Technologies | 05620 | supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant | Agilent Technologies | M356801-2 | |
| protein matrix - Matrigel | BD Biosciences | 356231 | |
| Purified mouse anti-E-cadherin antibody | BD Biociences | 610181 | Clone 36 |
| Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776] | Abcam | ab92547 | |
| RNA lysis and isolation kit | Zymo Research | R2060 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Testosterone | Sigma-Aldrich | 86500 | |
| Trichrome Stain | Abcam | ab150686 | |
| Wax film - Parafilm | VWR | 52858-000 |
References
- Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
- Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
- Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
- Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
- Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
- Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
- Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
- Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).
