Summary
وسعينا إلى إنشاء نموذج خنازير من فشل القلب الناجم عن انسداد الشريان المحيط الأيسر والسرعة السريعة لاختبار تأثير وسلامة الإدارة داخل القلب للخلايا الجذعية للعلاجات القائمة على الخلايا.
Abstract
على الرغم من أن التقدم قد أحرز في علاج قصور القلب (HF) بعد احتشاء عضلة القلب (MI)، HF اتباع MI لا يزال واحدا من الأسباب الرئيسية للوفيات والاعتلال في جميع أنحاء العالم. وقد اجتذبت العلاجات القائمة على الخلية لإصلاح القلب وتحسين وظيفة البطين الأيسر بعد MI اهتماما كبيرا. وبناء على ذلك، ينبغي اختبار سلامة وفعالية عمليات زرع الخلايا هذه في نموذج حيواني كبير قبل السريرية من HF قبل الاستخدام السريري. تستخدم الخنازير على نطاق واسع لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية بسبب تشابهها مع البشر من حيث حجم القلب وتشريح الشريان التاجي. ولذلك، سعينا لتقديم بروتوكول فعال لإنشاء نموذج HF مزمن porcine باستخدام انسداد البالون التاجي الصدري المغلق من الشريان المحيط الأيسر (LCX)، تليها سرعة البطين السريع الناجمة عن زرع منظم ضربات القلب. وبعد ثمانية أسابيع، أُعطيت الخلايا الجذعية عن طريق الحقن داخل القلب في منطقة ما حول العالم. ثم تم تقييم حجم الفاركت، وبقاء الخلية، ووظيفة البطين الأيسر (بما في ذلك تخطيط صدى القلب، والمعلمات الديناميكية الدموية، والفيزيولوجيا الكهربائية). تساعد هذه الدراسة على إنشاء نموذج HF حيواني كبير قبل الظهر لعلاج الخلايا الجذعية.
Introduction
أمراض القلب والأوعية الدموية, مرض الشريان التاجي (CAD) على وجه الخصوص, لا تزال السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في هونغ كونغ والعالم1. في هونغ كونغ، كان من المتوقع أن يكون هناك زيادة بنسبة 26٪ من 2012 إلى 2017 من عدد المرضى الذين عولجوا تحت سلطة المستشفىبنسبة 2. من بين جميع الـ CADs، يُعد احتشاء عضلة القلب الحاد (MI) سببًا رئيسيًا للوفاة ومضاعفات لاحقة، مثل قصور القلب (HF). تساهم هذه الأعباء في أعباء طبية واجتماعية ومالية كبيرة. في المرضى الذين يعانون من MI، العلاج الجلطاتية أو التدخل التاجي الأولي عن طريق الجلد (PCI) هو علاج فعال في الحفاظ على الحياة، ولكن هذه العلاجات يمكن أن تقلل فقط من فقدان القلبية (CM) خلال MI. العلاجات المتاحة غير قادرة على تجديد فقدان دائم ل CMs، مما يؤدي إلى تليف القلب، وإعادة عرض عضلة القلب، وعدم انتظام ضربات القلب، وفشل القلب في نهاية المطاف. معدل الوفيات في 1- سنة بعد MI حوالي 7٪ مع أكثر من 20٪ المرضى النامية HF3. في مرحلة نهاية المرضى HF، زرع القلب هو العلاج الفعال الوحيد المتاح، ولكن محدودة من نقص الأعضاء المتاحة. العلاجات الجديدة ضرورية لعكس تطور ما بعد الترددات المتوسطة. ونتيجة لذلك، يعتبر العلاج القائم على الخلايا نهجاً جذاباً لإصلاح ضعاف CMs وتحسين وظيفة البطين الأيسر (LV) في التردد العالي بعد الـ MI. وجدت دراساتنا السابقة أن زرع الخلايا الجذعية مفيد لتحسين وظيفة القلب بعد زرع القلب مباشرة في نماذج الحيوانات الصغيرة من MI4،5. وبالتالي، هناك حاجة إلى بروتوكولات HF الحيوانية الكبيرة قبل السريرية الموحدة لمواصلة اختبار فعالية وسلامة زرع الخلايا الجذعية قبل الاستخدام السريري.
وقد شهدت العقود الأخيرة الاستخدام الواسع النطاق للخنازير في أبحاث القلب والأوعية الدموية للعلاج بالخلايا الجذعية. الخنازير HF هي نموذج واعد من البحوث الترجمية نظرا لتشابهها مع البشر من حيث حجم القلب، والوزن، والإيقاع، وظيفة، وتشريح الشريان التاجي. وعلاوة على ذلك، يمكن نماذج HF porcine تقليد المرضى ما بعد التردد MI من حيث التمثيل الغذائي CM، والخصائص الكهربائية، والتغيرات الهرمونية العصبية في ظل ظروف الإقفاري6. البروتوكول المعروض هنا يستخدم مثل هذا نموذج HF خنزير موحدة، واستخدام انسداد البالون التاجي الصدر المغلق من الشريان دائرة الدائرة اليسرى (LCX) تليها سرعة سريعة الناجمة عن زرع منظم ضربات القلب. كما تحسن الدراسة مسار الإدارة القلبية للخلايا الجذعية لعلاج ما بعد الترددات المتوسطة. والغرض من ذلك هو إنتاج نموذج حيواني من احتشاء عضلة القلب المزمن الذي يمكن استخدامه لتطوير العلاجات ذات الصلة سريريا للمرضى الذين يعانون من CAD شديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد اجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية الذى نشرته المعاهد الوطنية الامريكية للصحة ولوائح جامعة هونج كونج ووافقت لجنة استخدام الحيوانات الحية فى جامعة هونج كونج على البروتوكول .
ملاحظة: خنازير المزرعة الإناث وزنها 35-40 كجم (9-12 شهرا) واستخدمت لهذه الدراسة. يظهر المخطط الانسيابي لهذه التجربة في الشكل 1.
1. العمليات الجراحية
- تخدير وإعداد الحيوان
- 2- سرع الحيوانات لمدة 12 ساعة وتخضع للحرمان من المياه لمدة 4 ساعات قبل التجربة.
- تخدير الخنازير من خلال حقن العضلي من البلاطة + zolezepam (2-7 ملغ / كغ) و xylazine (0.5-1 ملغ / كغ) أعدت في 20 مل من المالحة العادية. مراقبة ردود الفعل الحيوان palpebral حتى أنها غائبة.
- إزالة شعر الخنزير وتعقيم الجلد في الرقبة والفخذ للأقسام 1.3-1.5. تطهير منطقة العملية 3x مع 70٪ الإيثانول وبيتادين.
- ضع أنبوب انتراراخي 7 ملم في القصبة الهوائية المسامية ووضع إبرة الوريد 22 G الوريدية في الوريد.
- نقل الخنزير على طاولة التشغيل ومكان في موقف supine. توصيل أنبوب endotracheal إلى التنفس والتهوية ميكانيكيا (الملهم / نسبة الوقت منتهية 1:2) الحيوان مع ايزوفلوران (1.5٪ - 2.0٪ استنشاق) والأكسجين (0.5-1.5 لتر / دقيقة استنشاق).
- مراقبة تخطيط القلب السطحي وضغط الدم، ومراقبة معدل ضربات القلب، وأنظمة تسجيل القلب، وضغط الدم الشرياني باستمرار.
- ضربات القلب
- نقل الخنزير إلى اليسار موقف مفكك الجانبي وإصلاح على الطاولة.
- وضع المسبار على المنطقة الم pericardial وتنفيذ تخطيط صدى القلب التسلسلي، بما في ذلك التصوير 2D و M-الوضع، وذلك باستخدام نظام صدى القلب عالية الدقة و محول 3-9 ميغاهرتز في خط الأساس، قبل زرع الخلايا و 8 أسابيع بعد زرع الخلايا(الشكل التكميلي 1).
- تحليل جميع الصور التي تم الحصول عليها باستخدام البرمجيات التجارية. احسب بعد نهاية LV الانبساطي (LVEDD) ، LV النهاية الانقباضي البعد (LVES) ، LV نهاية الانقباضية (LVESD) ، LV نهاية الانقباضية (LVES) ، و LV بعد الانقباض (LVES) ، و LV بعد أن يتم الحصول على الصور ذات القلب صدى القياسية من عرض محور طويل paraster.
ملاحظة: أجريت جميع التحليلات خارج الخط من قبل مشغل مستقل آخر باستخدام محطة عمل كمبيوتر. وكان تباين القياسات بين مختلف المراقبين 4٪ استنادا إلى 20 صورة عشوائية متكررة. وقد أجريت جميع قياسات صدى القلب وفقا لتوصيات الجمعية الأمريكية للتصوير الصوتي للدق.
- زرع جهاز تنظيم ضربات القلب
- نقل الخنزير إلى موقف سوبين وإصلاح أطراف الخنزير على الطاولة مع الأشرطة.
- حدد موقع الشريان السباتي الأيمن والورد الوداجي في المثلث السباتي (خلف الستراتوكليدوماستويد ومحاطة باللماهان، والعضلات الهئيدية، وomohyoid) وعزل الشريان السباتي والحق في الوريد الوداجي مع ملقط hemostatic في ظل ظروف معقمة(الشكل التكميلي 2). Ligate نهاية اعزاء الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي. خياطة عضلات اثنين مع 2-0 فيكريل.
- Cannulate الوريد الوداجي الأيمن مع عنسية وعائية وإدراج يؤدي منظم ضربات القلب إلى البطين الأيمن تحت توجيه الأشعة السينية (الشكل 2).
- عزل sternocleidomastoid والعضلات تحجيم الأمامي باستخدام ملقط. زرع جهاز تنظيم ضربات القلب بين عضلات البلدين وخياطة عضلات اثنين مع 2-0 الحرير. قم بتوصيل منظم ضربات القلب إلى العميل المتوقع.
- قم بإعادة برمجة جهاز تنظيم ضربات القلب إلى وضع VVI الاحتياطي (35 bpm) بواسطة مولد منظم ضربات القلب بعد الزرع.
- تطبيق سرعة البطين السريع (150 نبضة / دقيقة) للحث HF بواسطة مولد منظم ضربات القلب 4 أسابيع بعد التعريفي MI. ثم تعيين منظم ضربات القلب مرة أخرى إلى وضع VVI احتياطية في 8 أسابيع.
- تحليل حلقة حجم الضغط الغازي
ملاحظة: إجراء تقييم ديناميكي للدَرَم الغازي عند خط الأساس، قبل زرع الخلايا و8 أسابيع بعد زرع الخلايا لتقييم التغيرات في وظيفة LV.- عزل الشريان الفخذي الأيمن وريد الفخذ في مثلث الفخذ (محاط بالرباط الأرني، وعضلات السارتوريوس، والعضلات اللوغوسة)(الشكل التكميلي 2).
- cannulate الشريان الفخذي الأيمن مع عنان الأوعية ووضع سلك دليل في الشريان عن طريق أنجيوكاث. إزالة أنجيوكاث و cannulate أغدد 9F في الشريان تحت إشراف دليل واير. إزالة أسلاك الدليل.
- Cannulate الوريد الفخذي الأيمن مع 12F الغمز كما هو موضح في الخطوة 1.4.2. أدخل قسطرة بالون من غَدْد 12F الموضوع في الوريد السفلي (IVC) تحت توجيه الأشعة السينية.
- معايرة 7 Fr ضغط حجم (PV) قسطرة في ملحي متساوي التوتر مع معالج إشارة PV.
- أدخل القسطرة الكهروضوئية في قمة LV من 9F مُوضع تحت توجيه الأشعة السينية. قم بتعليق التهوية وقياس مشتق الضغط الإيجابي الأقصى البطيني الأيسر (+dP/dt)، والضغط الانقباضي (ESP)، والضغوط الانبساطية الطرفية (EDP) مع معالج الإشارة الكهروضوئية.
- قم بقياس العلاقة النهائية بين الضغط والحجم الانقباضي (ESPVR) بواسطة معالج الإشارة الكهروضوئية أثناء انسداد IVC.
- إعادة تشغيل التهوية عند الانتهاء من الإجراء.
- التعريفي من MI
- إعطاء عن طريق الوريد أميودارون (5 ملغ / كغ عن طريق الوريد على 1 ساعة) وlidocaine (1.5 ملغ / كغ من البولين الوريدي) إلى الحيوان قبل تحريض MI لمنع عدم انتظام ضربات القلب البطيني.
- Cannulate الشريان السباتي الأيمن مع 8F اغرد كما ذكر في الخطوة 1.4.3.
- قم بإجراء تصوير الأوعية التاجية من خلال قسطرة 6F JR4 التوجيهية عبر الأسلاك عبر العغاد الموضوع الذي تسترشد به معدات تنظير الذراع C القياسية.
- Occlude الشريان التاجي دائرة اليسار (LCX) قفر إلى الفرع الهامشي منفرجة الأولى مع الرأب الوعائي التاجي التاجي عن طريق الجلد (PTCA) تضخم قسطرة بالون التفاح تحت توجيه الأشعة السينية(الشكل 2).
- حقن 1 مل من 700 ميكروفيرات الإسفنج 700 ميكروفرس μm مختلطة مع 3 مل من الملح الملحي أعدت في حقنة 10 مل من خلال القسطرة البالون لمنع LCX، ثم تفريغ البالون وإجراء تصوير الأوعية للتأكد من انسداد.
- كرر إجراء الحقن لتحقيق انسداد كامل ناجح.
- مراقبة معدل ضربات القلب الحيوانية والإيقاع للكشف عن عدم انتظام ضربات القلب. إذا حدث الرجفان البطيني، استخدم مزيل رجفان خارجي ثنائي الطور لإعادة إنشاء إيقاع الجيوب الأنفية باستخدام صدمات 150-300 J.
- حقن الخلايا الجذعية
- تعيين عشوائيا جميع الحيوانات مع ضعف ملحوظ من وظيفة القلب (LVEF < 40٪ في 8 أسابيع بعد تحريض MI) لمجموعتين مختلفتين: واحدة من شأنها أن تتلقى الإدارة داخل القلب من 2 × 108 البشرية المستحثة الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات (هيبسك-MSCs)، والآخر الذي لن يتلقى hiPSC-MSCs.
- إعداد hiPSC-MSCs في 2 مل من المالحة العادية لزراعة داخل القلب. قبل زرع هيبسك-MSCs داخل الرحم، كرر خطوات التخدير وإعداد الحيوان المذكورة في القسم 1.1، وهذه المرة تعقيم 10 سم حول منطقة فوز قمة. أداء استئصال الصدر الأيسر في الفضاء النتركوسي 4-5 مع الداهم. أداء pericardiotomy لفضح الجدار الجانبي فيرد.
ملاحظة: كان طول الشق 10-12 سم. - استخدام 5-8 الحقن داخل القلب (~ 0.3 مل لكل حقن) حول منطقة المزارع لإدارة ثقافة المتوسطة(جدول المواد) لمجموعة واحدة من الحيوانات أو 2 × 108 hiPSC-MSCs إلى المجموعة الأخرى(الشكل 3). تجنب بعناية أي ضرر في الشرايين التاجية للحد من خطر النزيف.
- أغلق الفضاء الوربي بسلك حديدي واغلق طبقة العضلات مع 2-0 حرير. خياطة الأنسجة تحت الجلد والجلد مع 2-0 vicryl.
- التحفيز الكهربائي المبرمج داخل القلب
- تنفيذ التحفيز الكهربائي المبرمج باستخدام محفز قابل للبرمجة لتقييم عدم قابلية التاشينغ البطيني (VT) بعد علاج زرع الخلايا.
- أدخل قسطرة كهربائية 6F في قمة البطين الأيمن عبر الوريد الفخذي قبل التضحية بجميع الحيوانات.
- عرض التسجيلات داخل القلب مع تخطيط القلب السطح يؤدي الأول والثاني والثالث على نظام تسجيل electrophysiological بسرعة 200 مم / الثانية. تقديم عرض نبض 2 مللي ثانية في 2x عتبة الانبساطي باستخدام محفز.
- تقديم قطار سرعة من ثمانية محفزات (S1) في اثنين من أطوال دورة محرك الأقراص (200 مللي ثانية و 300 مللي ثانية)، تليها واحدة (S2) أو اثنين (S2 و S3) المحفزات الإضافية السابقة لأوانها.
- تقصير تسلسلي فترات اقتران حتى يتم الناجم عن فترة الانكسار فعالة البطين أو عدم انتظام ضربات القلب. لاحظ وجود VT المستمر غير قابل للاستدامة (> 10 s).
2. بروتوكول ما بعد العملية الجراحية
- طب ما بعد الجراحة
- إجراء العلاجات الدوائية التقليدية لHHH. باختصار، إدارة الفم metoprolol succinate (25 ملغ) وراميبريل (2.5 ملغ) لجميع الحيوانات يوميا.
- تدار انيروفلوركاساسين داخل العضل (5 ملغم / كغ) وbuprenorphine (0.01 ملغ / كغ) لجميع الحيوانات يوميا لمدة 1 أسبوع بعد الجراحة لمنع العدوى وتخفيف الألم.
- لتقليل الرفض المناعي، عن طريق الفم الستيرويد (40 ملغ / يوم شفويا) والسيكلوسبورين (200 ملغ / يوم شفويا) لجميع الحيوانات من 3 أيام قبل زرع الخلايا إلى 8 أسابيع بعد.
- تقييم حجم الفارك
- القتل الرحيم الحيوانات عن طريق جرعة زائدة من dorminal (الصوديوم pentobarbital، 100 ملغم / كجم، الرابع) في نهاية التجربة.
- افتح الصدر واجمع القلب. شطف القلب في 0.9٪ المالحة.
- تسلسلي قسم عينات أنسجة LV مع مشرط بسماكة 1 سم في اتجاه LV عرضية.
- حدد أجزاء من الشرائح التي تحتوي على عضلة القلب المُهدَّد لقياس سمك الجدار ومنطقة الفاركت.
- التقاط صورة لهذه الشرائح وتحليل كمية سمك الجدار ومنطقة افاركت باستخدام البرمجيات التجارية تحليل الصور.
- إصلاح الأنسجة في 10٪ formalin في 4 °C لمدة شهر. تضمين الأنسجة داخل, المتاخمة والبعيدة لمواقع infarct (~ 1 سم2 قطعة) في البارافين. مقطعة إلى 5 μm شرائح باستخدام microtome لفحص النسيج.
- بقاء الخلية
- الكشف عن engraftment من الخلايا المزروعة عن طريق تلطيخ المناعة الكيميائية مع مستضد مضاد للإنسان (HNA) وفقا للبروتوكول المقدم من قبل الشركة المصنعة.
- التقاط الصورة في ثلاثة أقسام مختلفة في خمسة حقول عشوائية في كل وتحليل كمية الخلايا الإيجابية في منطقة ما حول البحار.
ملاحظة: تم استخدام نظام التقاط الصور وبرامج تحليل الصور لالتقاط وتحليل صور أقسام القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الوفيات
وقد استخدم ما مجموعه 24 خنزيرا في هذه الدراسة. ثلاثة منهم ماتوا أثناء إدخال MI بسبب VT المستمرة. توفي واحد في جراحة القلب المفتوح لحقن الخلية بسبب نزيف الجرح. وتوفي حيوانان بسبب عدوى شديدة. تم استبعاد حيوانين بسبب انخفاض طفيف في EF (تخفيض LVEF > 40٪ من خط الأساس). ونتيجة لذلك، أكمل 16 حيواناً بروتوكول الدراسة بأكمله.
وظيفة القلب وإعادة عرض
وأظهر الفحص التسلسلي لصدى القلب أن LVEF انخفض بشكل ملحوظ من 68.23 ± 3.52٪ عند خط الأساس إلى 39.37 ± 3.22٪. LVEDD زيادة كبيرة من 3.6 ± 0.5 إلى 4.8 ± 0.4 وارتفع بشكل ملحوظ من 2.5 ± 0.3 إلى 3.9 ± 0.4(الشكل 4أ)في 8 أسابيع بعد التعريفي من MI. تحسن LVEF وLVESD بشكل ملحوظ إلى 52.9 ± 4.27٪ و 3.3 ± 0.3 على التوالي في مجموعة hiPSC-MSCs بعد 8 أسابيع من الزرع ، مقارنة بحالة MI (الشكل 4A).
انخفض +dP/dt و ESPVR بشكل ملحوظ من 1,325 ± 63 مم زئبق/س و 3.9 ± 0.4 عند خط الأساس إلى 978 ± 45 مم زئبق/س و 1.8 ± 0.2 في 8 أسابيع بعد تحريض الـ MI. وزادت الإدارة داخل الرحم من الـ HIPSC-MSCs من +dP/dt و ESPVR إلى 1,127.4 ± 50 مم زئبق/ث و2.6 ± 0.3 في 8 أسابيع بعد زرع iPSC-MSCs، مقارنة بحالة MI(الشكل 4B).
سمك الجدار في المزارع
تم قياس متوسط سمك الجدار LV من 5-7 المسلسل 1 سم سمك قسم عينات في كل (الشكل 5). وكانت النسبة المئوية لتششاء LV 16 ± 2٪.
بقاء الخلية بعد الزرع
لم يكن هناك بقاء الخلية حول موقع الحقن في منطقة 8 أسابيع بعد الزرع، ولكن كان هناك عدد قليل من hiPSC-MSCs البقاء مرئية في المنطقة المحيطة - افاركت (الشكل 6).
عدم انتظام ضربات القلب البطيني غير القابل للانزكاح
يمكن زيادة حدوث لا يمكن الحصول عليها من البطين المستمر tachyarrhythythmias بسهولة في الحيوانات مع HF (10٪ في خط الأساس مقابل 75٪ 8 أسابيع بعد تحريض MI). لا تقوم زراعة hiPSC-MSCs بتعديل الركيزة الأساسية عضلة القلب لتقليل قابلية VT (62.5٪ في مجموعة HIPSC-MSCs 8 أسابيع بعد الإدارة القلبية من hiPSC-MSCs ، الشكل 7).
الشكل 1: مخطط انسيابي للتجربة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نموذج بورسين من احتشاء عضلة القلب. تم حث نموذج الزسيني من احتشاء عضلة القلب (MI) عن طريق انسداد الشريان التاجي الأيسر (LCX ، السهم الأحمر) إلى الفرع الهامشي الأول منفرجة. تم انسداد هذا الشريان التاجي مع تضخم البالون وحقن 700 ميكروpheres μm. تم إجراء تصوير الأوعية التاجية في ما قبل MI ، تضخم البالون ، وما بعد MI من خلال قسطرة 6F JR4 التوجيهية عبر الشريان السباتي الأيمن. تم إدخال الرصاص منظم ضربات القلب في جدار البطين الأيمن (السهم الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زرع الخلايا في نموذج من الـMI. مواقع حقن الخلية في الجدار الجانبي حول منطقة افاركت من البطين الأيسر أثناء استئصال الصدر الأيسر. يظهر السهم الأزرق منطقة محيطة و السهم الأحمر يظهر منطقة الاحفار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يتغير وظيفة القلب بعد MI. (أ) صورة تخطيط صدى القلب في وضع LV M عند خط الأساس وMI وزرع الخلايا. LVEF, LVEDD, LVESD انخفضت بشكل ملحوظ 8 أسابيع بعد التعريفي MI وزيادة كبيرة في مجموعة hiPSC-MSCs 8 أسابيع بعد زرع الخلايا. (B) لتقييم وظيفة القلب للخنازير مع قصور القلب، تم قياس قيمة +dP/dt و ESPVR بمعالج إشارة PV. تم انسداد الوريد السفلي (IVC) من قبل تضخم البالون (السهم الأزرق) خلال تقييم ESPVR. انخفض كل من dP / dt + وSPVR بشكل ملحوظ بعد الحث MI، ثم زادت بشكل كبير في مجموعات hiPSC-MSC 8 أسابيع بعد الزرع. ANOVA تليها الطالب نيومان كيولس اختبار ما بعد مخصص (SPSS، الإصدار 14) تم استخدامها مع α = 0.05 للأهمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: منطقة infarct التغييرات بعد MI. LV عينات الاتجاه عرضية مقطعة في 1 سم سمك في كل قلب يحتوي على عضلة القلب في المزارع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: بقاء الخلايا بعد الزرع. تم الكشف عن engraftment من hiPSC-MSCs المزروعة بواسطة الملطّخات المناعية للضداد النووي البشري (اللون الأحمر). شريط مقياس = 100 μm. الأسهم تمثل الخلايا الإيجابية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: حالات اتشائي البطين المستمر. (أ)البطين tachyarrhythmias (VT، السهم الأحمر) التي يسببها في الجسم الحي داخل القلب المبرمجة التحفيز الكهربائي. (ب) زيادة معدل الإصابة VT بشكل ملحوظ بعد الحث على MI. لم يزيد زرع الخلايا من حدوث VT. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: اكتساب مخطط صدى القلب. لوحة اليسار يظهر موقف الحيوان. تُظهر اللوحة اليمنى موضع التحقيق. تُظهر اللوحة الوسطى صورة صدى القلب تحت هذا الموضع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: موقع السفن. تم وضع الخنازير في موقف supine. يتم تقديم شقوق الشريان السباتي والشريان الفخذي كخط أحمر. وكان الوريد الوداجي وريد الفخذ تحت الشريان السباتي والشريان الفخذي على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نماذج حيوانية قياسية ذات أهمية قصوى لفهم علم الفيزيولوجيا المرضية وآليات الأمراض واختبار العلاجات الجديدة. بروتوكول لدينا يؤسس نموذج porcine من HF الناجمة عن انسداد الشريان دائرة اليسار وسرعة سريعة. بعد ثمانية أسابيع من تحريض MI، وضعت الحيوانات ضعف كبير من LVEF، LVEDD، LVESD، +dP / dt، وSPVR. هذا البروتوكول أيضا اختبارات طريقة إدارة العلاج بالخلايا الجذعية لتجديد القلب عن طريق الحقن داخل القلب. يتم تقييم حجم الاحتشاح ، والقلب الانقباضي والانبساطي وظيفة. تساعد هذه الدراسة على إنشاء نموذج HF حيواني كبير قبل السريرية ومستقرة وقابلة للتكاثر لعلاج الخلايا الجذعية، وهو مشابه للحالات السريرية.
وقد استخدمت انسداد LCX وسرعة سرعة على نطاق واسع لخلق نماذج حيوانية من HF في دراساتنا السابقة7،8. تم انسداد LCX إلى الفرع الهامشي الأول منفرجة، تليها 4 أسابيع من سرعة البطين الأيمن السريع. يؤدي نقص تروية عضلة القلب إلى فقدان عضلة القلب خلال الـ MI، والذي يسبب تليف القلب، وإعادة عرض عضلة القلب، وعدم انتظام ضربات القلب. يؤدي سرعة البطين إلى تمدد LV كبير ، وضعف عدم الإشهار في قابلية البطين الأيسر ، والخلل الوظيفي الحادLV 9،10. فترات أطول من نقص التروية والسرعة السريعة تنتج التدريجي التجريبية منخفضة الانتاج HF نموذج للبحوث الترجمة. الدراسات السابقة التي أنشأت نماذج قصور القلب عن طريق حث MI10. ومع ذلك، كان معدل الوفيات من MI شديدة أعلى وخفض LVEF من MI غير مستقر. ولذلك، فإننا نطبق سرعة البطين الأيمن السريع بعد انسداد LCX للحث على ضعف كبير في وظيفة القلب. كما يمكن أن نرى في دراساتنا السابقة، النموذج المعروض هنا ينتج حجم مستقر في المزارع، ويتم تخفيض LVEF من هذا النموذج إلى أقل من 40٪ طبيعي6،,7،,8. لو كان هناك عدد أقل من الإصابات والنزيف، لكان معدل نجاحنا النموذجي حوالي 80%.
واحدة من العقبات الرئيسية أمام التطبيق السريري للخلايا الجذعية هو ضعف بقائها وgragraftment بعد زرع. الدراسات السريرية الحديثة والتحليل التلوي11,12,13,14,15 وقد فشلت في إثبات أي تحسن ثابت في وظيفة LV أو حجم نقش بعد هذا العلاج. أحد الأسباب المحتملة هو انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة للخلايا المزروعة. اكتشاف طريقة الإدارة الأمثل يلعب دورا حاسما في علاجات الخلايا الجذعية. مقارنة الطرق الثلاث لزرع الخلايا، و الإدارة داخل القلب هو أكثر كفاءة من الحقن الوريدي وداخل الرحم بسبب ارتفاع الاحتفاظ بالخلايا16،17. لذلك، اخترنا مسار الإدارة داخل القلب لـ iPSC-MSCs في هذه الدراسة. أظهرت نتائج صدى القلب والنتائج الديناميكية الدموية الغازية أن الإدارة داخل القلب من iPSC-MSCs تحسين وظيفة LV للخنازير HF بعد 8 أسابيع من زرع الخلايا. على الرغم من إدارة الأدوية المثبطة للمناعة (الستيرويد والسيكلوسبورين) ، تم اكتشاف عدد قليل فقط من الخلايا المزروعة في منطقة ما حول المزارع. ولم يتم اكتشاف أي خلية على قيد الحياة في المنطقة التي تم الاحشها حول الموقع المحقون. وقد وجدت الدراسات السابقة أيضا جزءا صغيرا للغاية من الخلايا الجذعية في عضلة القلب في المزارع بعد زرع18,19,20,21. قد يؤثر فقدان الخلايا أثناء الإدارة القلبية على النتائج التجريبية. وينبغي توضيح كيفية تحسين أساليب الإدارة وزيادة معدل الإقامة في الدراسات المستقبلية.
السلامة، وخاصة عدم الاضطرابات، هي مصدر قلق حيوي آخر فيما يتعلق بالممارسة السريرية مع العلاجات القائمة على الخلايا. أظهرت دراستنا الأخيرة أن الإدارة داخل الرحم من الخلايا الجذعية الجنين البشري (hESC) تستمد CMs زيادة حدوث عفوية غير مستمرة البطين tachyarrhythmias4. في نموذجنا ما بعد التردد على MI HF porcine ، كان معدل الإصابة بطيني البطين غير المستمر التلقائي (rate>180 bpm و>12 نبضات) المسجلة عن طريق مراقبة القياس عن بعد من منظم ضربات القلب 25٪ بعد إدخال MI ، ولكن يمكن أن يتم حث VT المستمر بسهولة (80٪). في هذه الدراسة، يبقى حدوث الوفاة المفاجئة دون تغيير مع أو بدون إدارة مرض الهبسك-MSCs. وعلاوة على ذلك، لم تُعدل زراعة الهيبسك-MSCs الركيزة الأساسية عضلة القلب لتقليل أو زيادة قابلية عدم انتظام ضربات القلب البطيني. وتشير هذه النتيجة إلى أن نموذج الحيوان الكبير المزمن HF يمكن استخدامه لتقييم سلامة الخلايا.
تجنب العدوى والنزيف هي ذات أهمية قصوى لإنشاء نموذج الحيوان الناجح. للحد من خطر النزيف، يجب إيلاء الاهتمام لتجنب أي ضرر في الشرايين التاجية والأوردة القلبية. كما توفي حيوانان من العدوى الحادة، استراتيجية طبية مناسبة بعد الجراحة سوف تستفيد. هنا، ونحن نقدم استراتيجية طبية ما بعد الجراحة على النحو التالي: إدارة إينروفلوكساسين العضل (7.5 ملغ / كغ، SID) وbuprenorphine (0.02 ملغم / كغ، BID) جنبا إلى جنب مع إدارة شفويا Amoxycillin / Clavulanic حمض (12.5mg / كجم, SID) وCarprofen (2 ملغم / كغ, SID) لجميع الحيوانات لمدة أسبوع بعد الجراحة لمنع العدوى وتخفيف الألم.
باختصار، توفر الطريقة الحالية نموذج حيواني كبير ذو صلة سريرياً ومستقراً ومكرراً من فشل القلب للعلاجات القائمة على الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يعترف المؤلفان ألفريدا والكونغ تاك تشونغ لدعمهما التقني الممتاز خلال التجارب الحيوانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Mylan | - | - |
| Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
| Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
| Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
| Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
| AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
| Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
| Betadine | Mundipharma | - | - |
| CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
| Culture media | MesenCult | 05420 | - |
| Cyclosporine | Novartis | - | - |
| Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
| Dorminal | TEVA | - | - |
| Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
| EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
| Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
| Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
| Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
| Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
| Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
| IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
| JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
| Lidocaine | Quala | - | - |
| Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
| Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
| Microtome | Leica | RM2125RT | - |
| Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
| Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
| Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
| Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
| Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
| Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
| PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
| Ramipril | TEVA | - | - |
| Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
| Steroid | Versus Arthritis | - | - |
| Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
| Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
| Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
| Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131, e29 (2015).
- Hospital Authority. Hospital Authority Statistical Report 2013. , Hong Kong. (2013).
- Cung, T. T., et al. Cyclosporine before PCI in Patients with Acute Myocardial Infarction. The New England Journal of Medicine. 373 (11), 1021-1031 (2015).
- Liao, S. Y., et al. Proarrhythmic risk of embryonic stem cell-derived cardiomyocyte transplantation in infarcted myocardium. Heart Rhythm. 7, 1852-1859 (2010).
- Liao, S. Y., et al. Overexpression of Kir2.1 channel in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes attenuates posttransplantation proarrhythmic risk in myocardial infarction. Heart Rhythm. 10, 273-282 (2013).
- Liu, Y., et al. Thoracic spinal cord stimulation improves cardiac contractile function and myocardial oxygen consumption in a porcine model of ischemic heart failure. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 23, 534-540 (2012).
- Liao, S. Y., et al. Improvement of Myocardial Function Following Catheter-Based Renal Denervation in Heart Failure. JACC: Basic to Translational Science. 2 (3), 270-281 (2017).
- Liao, S. Y., et al. Remodelling of cardiac sympathetic re-innervation with thoracic spinal cord stimulation improves left ventricular function in a porcine model of heart failure. Europace. 17 (12), 1875-1883 (2015).
- Daehnert, I., Rotzsch, C., Wiener, M., Schneider, P. Rapid right ventricular pacing is an alternative to adenosine in catheter interventional procedures for congenital heart disease. Heart. 90 (9), 1047-1050 (2004).
- Hála, P., et al. Tachycardia-Induced Cardiomyopathy as a Chronic Heart Failure Model in Swine. Journal of Visualized Experiments. (132), e57030 (2018).
- Santoso, T., et al. Endomyocardial implantation of autologous bone marrow mononuclear cells in advanced ischemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (END-HF). Journal of Cardiovascular Translational Research. 7, 545-552 (2014).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network. Effect of intracoronary delivery of autologous bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks following acute myocardial infarction on left ventricular function: the LateTIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 306, 2110-2119 (2011).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network (CCTRN). Effect of the use and timing of bone marrow mononuclear cell delivery on left ventricular function after acute myocardial infarction: the TIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 308, 2380-2389 (2012).
- de Jong, R., Houtgraaf, J. H., Samiei, S., Boersma, E., Duckers, H. J. Intracoronary stem cell infusion after myocardial infarction. A meta-analysis and update on clinical trials. Circulation: Cardiovascular Interventions. 7, 156-167 (2014).
- Nowbar, A. N., et al. DAMASCENE writing group. Discrepancies in autologous bone marrow stem cell trials and enhancement of ejection fraction (DAMASCENE): weighted regression and meta-analysis. British Medical Journal. 348, g2688 (2014).
- Kanelidis, A. J., Premer, C., Lopez, J., Balkan, W., Hare, J. M. Route of Delivery Modulates the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Therapy for Myocardial Infarction: A Meta-Analysis of Preclinical Studies and Clinical Trials. Circulation Research. 120 (7), 1139-1150 (2017).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112 (9 Suppl), I150-I156 (2005).
- Hu, X., et al. A Large-Scale Investigation of Hypoxia-Preconditioned Allogeneic Mesenchymal Stem Cells for Myocardial Repair in Nonhuman Primates: Paracrine Activity Without Remuscularization. Circulation Research. 118, 970-983 (2016).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Martens, A., et al. Substantial early loss of induced pluripotent stem cells following transplantation in myocardial infarction. Artificial Organs. 38, 978-984 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
