Summary
Vi försökte upprätta en svin modell av hjärtsvikt framkallas av vänster cirkumflex gatan blockering och snabba pacing att testa effekten och säkerheten för intramyocardial administration av stamceller för cell-baserade terapier.
Abstract
Även om framsteg har uppnåtts vid behandling av hjärtsvikt (HF) efter hjärtinfarkt (MI), HF efter MI är fortfarande en av de stora orsakerna till dödlighet och sjuklighet runt om i världen. Cell-baserade terapier för hjärt reparation och förbättring av vänster ventrikulärt funktion efter MI har rönt stor uppmärksamhet. Följaktligen bör säkerheten och effekten av dessa celltransplantationer testas i en preklinisk stor djurmodell av HF före klinisk användning. Grisar används ofta för hjärt-kärlsjukdom forskning på grund av deras likhet med människor när det gäller hjärtat storlek och koronar anatomi. Därför försökte vi att lägga fram ett effektivt protokoll för inrättandet av en porcine kronisk HF-modell med slutna-bröstet födans ballong ocklusion av den vänstra cirkumflex gatan (LCX), följt av snabba Ventrikulärt framröra inducerad med pacemaker implantation. Åtta veckor senare, var stamcellerna administreras genom intramyocardial injektion i peri-infarct området. Därefter utvärderades infarct storlek, cell överlevnad och vänster Ventrikulärt funktion (inklusive ekokardiografi, hemodynamic parametrar och elektrofysiologi). Denna studie hjälper till att etablera en stabil preklinisk stor djur HF modell för stamcellsbehandling.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdomar, kranskärlssjukdom (CAD) i synnerhet, förblir den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet i Hongkong och i hela världen1. I Hongkong beräknades en ökning med 26 % från 2012 till 2017 av antalet CAD-patienter som behandlades under sjukhusmyndigheten2. Bland alla CADs är akut hjärtinfarkt (MI) en ledande dödsorsak och efterföljande komplikationer, såsom hjärtsvikt (HF). Dessa bidrar till betydande medicinska, sociala och ekonomiska bördor. Hos patienter med MI är trombolytisk terapi eller primär perkutan koronar intervention (PCI) en effektiv terapi för att bevara livet, men dessa terapier kan endast minska kardiomyocyter (CM) förlust under MI. De behandlingar som finns kan inte fylla på permanent förlust av CMs, vilket leder till hjärt fibros, hjärtinfarkt ombyggnad, hjärtarytmi, och så småningom hjärtsvikt. Dödligheten vid 1 års post-MI är cirka 7% med mer än 20% patienter som utvecklar HF3. I slutet-steg HF patienter är hjärtat transplantation den enda tillgängliga effektiva terapi, men det begränsas av en brist på tillgängliga organ. Nya terapier är nödvändiga för att vända utvecklingen av post-MI HF. Som ett resultat, cell-baserad terapi anses vara en attraktiv metod för att reparera nedsatt CMs och ameliorate vänster Ventrikulärt (LV) funktion i HF följande MI. Våra tidigare studier fann stamcellstransplantation vara fördelaktigt för hjärtfunktion förbättring efter direkt intramyocardial transplantation i små djur modeller av MI4,5. Standardiserade prekliniska stora animaliska HF-protokoll behövs således för att ytterligare testa effekten och säkerheten av stamcellstransplantation före klinisk användning.
De senaste decennierna har bevittnat den utbredda användningen av grisar i kardiovaskulär forskning för stamcellsterapi. HF svin är en lovande modell av translationell forskning på grund av deras likhet med människor när det gäller hjärtstorlek, vikt, rytm, funktion och födans gatan anatomi. Dessutom kan porcin HF-modeller efterlikna post-MI HF patienter när det gäller CM metabolism, elektrofysiologiska egenskaper, och neuroendokrina förändringar under ischemiska förhållanden6. Protokollet presenteras här använder en sådan standardiserade gris HF modell, anställa en sluten-bröst koronar ballong ocklusion av den vänstra cirkumflex gatan (LCX) följt av snabba tempo inducerad av pacemakern implantation. Studien optimerar också vägen för intramyokardiell administrering av stamceller för behandling av post-MI HF. Syftet är att ta fram en porcine djurmodell av kronisk hjärtinfarkt som kan användas för att utveckla behandlingar som är kliniskt relevanta för patienter med svår CAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals som publicerades av US National Institutes of Health och förordningar vid University of Hong Kong, och protokollet godkändes av kommittén för användning av levande djur i undervisning och forskning (CULTAR) vid Universitetet i Hong Kong.
OBS: Grisar av hondjur som vägde 35–40 kg (9–12 månader gamla) användes för denna studie. Flödesschemat för detta experiment visas i figur 1.
1. Kirurgiska ingrepp
- Anestesi och beredning av djuret
- Fast djuren i 12 h och föremål för vattenbrist i 4 h före försöket.
- Söva svinen genom en intramuskulär injektion av tiletamine+zolezepam (2-7 mg/kg) och xylazin (0,5-1 mg/kg) som beretts i 20 mL normal saltlösning. Övervaka djurets palpebralt reflexer tills de är frånvarande.
- Ta bort grisens hår och sterilisera huden vid halsen och ljumsken för sektionerna 1.3-1.5. Desinficera operationsområdet 3x med 70% etanol och betadin.
- Placera en 7 mm endotrakeal röret i svin luftstrupen och placera en 22 G venös indwelling nål i örat vena.
- Flytta grisen på operationsbordet och placera i ryggläge. Anslut endotrakealröret till andnings- och mekaniskt ventilera (inspiratoriska/expiratorisk tidsförhållande 1:2) djuret med isofluran (1,5%-2,0% inandning) och syre (0,5-1,5 L/min inandning).
- Övervaka ytans elektrokardiogram och blodtryck, och kontinuerligt övervaka hjärtfrekvens, hjärtrytm, och arteriellt blodtryck via elektrofysiologi inspelningssystem.
- Ekokardiografi
- Flytta grisen till vänster lateral deubitus position och fix på bordet.
- Sätt sonden på perikardial region och utför seriell ekokardiografi, inklusive 2D och M-läge avbildning, med hjälp av en högupplöst ekokardiografisystem och en 3-9 MHz givare vid baslinjen, före celltransplantation och 8 veckor efter celltransplantation (Supplemental Figur 1).
- Analysera alla erhållna bilder med hjälp av kommersiell programvara. Beräkna LV slutet-diastolic dimension (LVEDD), LV slut-systolic dimension (LVESD), LV slut-diastolic volym (LVEDV), LV slut-systolic volym (LVESV), LV utskjutningsfraktion (LVEF), och vägg tjocklek efter standard ekokardiographic bilder erhålls från den parasternal lång-axel vy.
OBS: Alla off-line analyser genomfördes av en annan oberoende operatör med hjälp av en dator arbetsstation. Variabiliteten av mätningarna mellan olika observatörer var 4% baserat på 20 upprepade slumpmässiga bilder. Alla echocardiographic mätningar utfördes i enlighet med American Society of Echocardiography rekommendationer.
- Pacemaker implantation
- Flytta grisen till ryggläge och fixera grisens lemmar på bordet med remmar.
- Lokalisera höger halspulsåder och halsven i halspulsådern triangeln (bakom sternocleidomastoid och omgiven av stylohyoid, den digastric muskeln, och den omohyoid) och isolera höger halspulsådern och halsvenen med hemostatiska tång under sterila förhållanden (Supplemental Figur 2). Ligate den distala änden av den högra halspulsådern och halsvenen. Sy de två musklerna med 2-0 Vicryl.
- Kanalulera höger jugulär ven med en angiocath och sätt in en pacemaker leda till höger kammare under röntgenvägledning (Bild 2).
- Isolera sternocleidomastoid och främre scalene muskeln med hjälp av forceps. Implantera en pacemaker mellan de två musklerna och sy de två musklerna med 2-0 silke. Koppla pacemakern till ledningen.
- Programmera om pacemakern till backup VVI-läge (35 bpm) av en pacemakergenerator efter transplantationen.
- Applicera snabb ventrikulärt framing (150 slag/min) för att inducera HF av en pacemakergenerator 4 veckor efter MI-induktion. Ställ sedan tillbaka pacemakern till backup VVI-läge på 8 veckor.
- Invasiv analys av tryckvolymslinga
OBS: Utför invasiv odynamisk bedömning vid baslinjen, före celltransplantation och 8 veckor efter celltransplantation för att bedöma förändringar i LV-funktionen.- Isolera höger lårbensartär och lårbensven i lårbenstriangeln (omgiven av inguinal ligament, sartorius muskel, och adductor longus muskel) (Kompletterande Figur 2).
- Cannulate rätt lårbensartären med en angiocath och placera en ledare i artären via angiocath. Ta bort angiocath och kannulate en 9F-lyssla i artären under ledning av ledaren. Ta bort ledaren.
- Cannulate rätt lårbensven med en 12F-sla som beskrivs i steg 1.4.2. Sätt in en ballongkateter från den placerade 12F-satsen i den sämre vena cava (IVC) under röntgenvägledning.
- Kalibrera en 7 Fr tryck-volym (PV) kateter i isoton koksaltlösning med en PV-signalprocessor.
- För in PV-katetern i LV-apexet från den placerade 9F-hyftan under röntgenvägledning. Suspend ventilation och mäta vänster ventrikulära maximala positiva tryck derivat (+dP/dt), end-systoliskt tryck (ESP), och end-diastolic tryck (EDP) med PV signal processor.
- Mät slutet systoliskt tryck-volym förhållande (ESPVR) av PV signal processor under ocklusion av IVC.
- Starta om ventilationen när proceduren är avslutad.
- Induktion av MI
- Administrera amiodaron intravenöst (5 mg/kg intravenöst över 1 h) och lidokain (1,5 mg/kg intravenös bolus) till djuret före induktion av MI för att förhindra kammarrytmier.
- Cannulate rätt halspulsådern med en 8F-ördel som nämnts i steg 1.4.3.
- Utför koronarangiografin genom en 6F JR4-övertrådig guidningskateter via den placerade skidan som styrs av standard C-armgenomlysningsutrustning.
- Ocklude den vänstra cirkumflexen kranskärl (LCX) distala till den första trubbiga marginella grenen med perkutan transluminal koronar angioplastik (PTCA) dilatation ballong kateter inflation under röntgen vägledning (Figur 2).
- Injicera 1 mL av 700 μm svamp mikrosfärer blandas med 3 mL saltlösning beredd i en 10 mL spruta genom ballongkatetern för att blockera LCX, sedan tömma ballongen och utföra ett angiogram för att bekräfta ocklusionen.
- Upprepa injektionsproceduren för att uppnå en lyckad fullständig blockering.
- Övervaka djurs hjärtfrekvens och rytm för att upptäcka hjärtarytmier. Om ventrikulärt förmaksflimmer hände, använd en extern, biphasic defibrillator för att återupprätta en sinus rytm med hjälp av 150-300 J chocker.
- Stamcellsinjektion
- Tilldela slumpmässigt alla djur med anmärkningsvärd försämring av hjärtfunktionen (LVEF < 40% vid 8 veckor efter induktion av MI) till två olika grupper: en som kommer att få intramyokardial administrering av 2 x 108 mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-härledda mesenkymala stamceller (hiPSC-MSCs), och den andra som inte kommer att få hiPSC-MSCs.
- Förbered hiPSC-MSCs i 2 mL av normal koksaltlösning för intramyokardiell transplantation. Innan intramyokardiell hiPSC-MSCs transplantation, upprepa anestesi och djur förberedelse steg som nämns i avsnitt 1.1, denna gång sterilisera 10 cm runt apex beat området. Utför vänster thoracotomy vid 4-5 intercostal utrymme med ett upprullningsdon. Utför pericardiotomy att exponera infarcted laterala väggen.
OBS: Snittets längd var 10-12 cm. - Använd 5-8 intramyokardiella injektioner (~0,3 mL per injektion) runt det infarcted området för att administrera odlingsmedium (Tabell of Materials) till en grupp av djur eller 2 x 108 hiPSC-MSCs till den andra gruppen (Figur 3). Undvik noga eventuella skador på kranskärlen för att minska risken för blödning.
- Stäng interkostalrummet med järntråd och stäng muskellagret med 2-0 silke. Sy den subkutana vävnaden och huden med 2-0 vicryl.
- Intracardiac programmerad elektrisk stimulering
- Utför programmerad elektrisk stimulering med hjälp av en programmerbar stimulator för att bedöma ventrikulärt takyarytmi (VT) inducerande efter celltransplantationsbehandlingen.
- Sätt in en 6F elektrofysiologisk kateter i höger ventrikulära spets via lårbensvenen innan du offrar alla djuren.
- Visa de intracardiac inspelningar med ytan elektrokardiogrammen leder I, II, och III på det elektrofysiologiska inspelningssystemet med en hastighet av 200 mm/s. Leverera en 2 ms pulsbredd vid 2x den diastoliska tröskeln med hjälp av en stimulator.
- Leverera ett pacing-tåg på åtta stimuli (S1) vid två körcykellängder (200 ms och 300 ms), följt av en (S2) eller två (S2 och S3) för tidigt extra stimuli.
- Sekventiellt förkorta kopplingsintervallen tills en ventrikulär effektiv eldfast period eller arytmi induceras. Observera förekomsten av inducerbara ihållande VT (> 10 s).
2. Postoperativt protokoll
- Postoperativ medicin
- Utför konventionella farmakologiska terapier för HF. I korthet, oralt administrera metoprolol succinate (25 mg) och ramipril (2,5 mg) till alla djur dagligen.
- Intramuskulärt administrera enrofloxacin (5 mg/kg) och buprenorfin (0,01 mg/kg) till alla djur dagligen i 1 vecka efter operationen för att förhindra infektion och lindra smärta.
- För att minimera immunologiska avstötning, oralt administrera en steroid (40 mg/dag oralt) och ciklosporin (200 mg/dag oralt) till alla djur från 3 dagar före celltransplantation till 8 veckor efter.
- Bedömning av infarktstorlek
- Avliva djuren genom en överdos av dorminal (pentobarbital natrium, 100 mg/kg, IV) i slutet av experimentet.
- Öppna bröstet och samla hjärtat. Skölj hjärtat i 0,9% saltlösning.
- Seriellt avsnitt LV vävnadsprover med en skalpell vid 1 cm tjocklekar i LV tvärgående riktning.
- Välj delar av de segment som innehåller det infarcted myokardiet för att mäta väggtjocklek och infarct område.
- Fånga bilden av dessa skivor och kvantitativt analysera väggen tjocklek och infarct området med hjälp av kommersiella bildanalys programvara.
- Fixera vävnaden i 10% formalin vid 4 °C i en månad. Bädda in vävnaden inom, angränsande och avlägsna till infarct platser (~ 1 cm2 bitar) i paraffin. Avsnitt i 5 μm skivor med hjälp av en mikrotom för histologisk undersökning.
- Cell överlevnad
- Upptäcka engraftment av de transplanterade cellerna genom immunohistochemical färgning med anti-humant nukleärt antigen (HNA) enligt det protokoll som tillverkaren tillhandahåller.
- Fånga bilden i tre olika avsnitt vid fem slumpmässiga fält i varje djur och kvantitativt analysera de positiva cellerna i peri-infarct zonen.
OBS: Bildfångande system och bildanalysprogram användes för att fånga och analysera bilderna av hjärtsektionerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dödlighet
Totalt 24 grisar användes i denna studie. Tre av dem dog under MI induktion på grund av ihållande VT. Ett djur dog i öppen hjärtkirurgi för cell injektion på grund av sår blödning. Två djur dog på grund av svår infektion. Två djur uteslöts på grund av en lätt ef-minskning (LVEF-reduktion > 40 % av utgångsvärdet). Som ett resultat av detta slutförde 16 djur hela studieprotokollet.
Hjärtfunktion och ombyggnad
Seriell ekokardiografisk undersökning visade att LVEF signifikant minskade från 68,23 ± 3,52% vid baslinjen till 39,37 ± 3,22%. LVEDD ökade signifikant från 3,6 ± 0,5 till 4,8 ± 0,4 och LVESD ökade signifikant från 2,5 ± 0,3 till 3,9 ± 0,4 (Figur 4A) vid 8 veckor efter induktion av MI. LVEF och LVESD förbättrades signifikant till 52,9 ± 4,27 % respektive 3,3 ± 0,3 i hiPSC-MSC-gruppen 8 veckor efter transplantationen, jämfört med MI-statusen (figur 4A).
+dP/dt och ESPVR minskade signifikant från 1,325 ± 63 mmHg/s och 3,9 ± 0,4 vid baslinjen till 978 ± 45 mmHg/s och 1,8 ± 0,2 vid 8 veckor efter induktion av MI. Intramyokardiell administrering av hiPSC-MSCs ökade +dP/dt och ESPVR till 1,127,4 ± 50 mmHg/s och 2,6 ± 0,3 vid 8 veckor efter iPSC-MSCs transplantation, jämfört med MI-statusen (Figur 4B).
Infarct vägg tjocklek
Den genomsnittliga LV infarct väggtjocklek mättes från 5-7 seriella 1 cm tjocklek avsnitt prover i varje djur (Figur 5). Andelen LV-infarkt var 16 ± 2 %.
Cell Överlevnad efter transplantationen
Det fanns ingen cellöverlevnad runt injektionsstället i infarktområdet 8 veckor efter transplantationen, men ett litet antal av överlevnads hiPSC-MSCs var synliga i peri-infarktområdet (Figur 6).
Inducere ventrikulär arytmi
Incidensen av inducerbara ihållande ventrikulära takyarytmier kunde lätt ökas hos djur med HF (10% vid baslinjen jämfört med 75% 8 veckor efter induktion av MI). HiPSC-MSCs transplantationen modifierar inte det underliggande myokardi-substratet nämns i någon större grad för att minska mottagligheten för VT (62,5 % i hiPSC-MSCs-gruppen 8 veckor efter intramyokardiell administrering av hiPSC-MSCs, figur 7).
Bild 1: Flödesdiagram för experimentet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Svinmodell av hjärtinfarkt. Svin modell av hjärtinfarkt (MI) var framkallas genom embolization av den vänstra cirkumflex födans gatan (LCX, röd pil) distala till den första trubbig marginell gren. Denna födans gatan var ockluderas med ballong inflation och en injektion av 700 μm mikrosfärer. Födans angiografi vid pre-MI, ballong inflation och post-MI utfördes genom en 6F JR4 vägledande kateter via rätt halsartären. Pacemakern bly sattes in i den högra ventrikelväggen (blå pil). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Celltransplantation i en porcine modell av MI. Cell injektionsställen vid den laterala väggen runt infarct området i vänster kammare under vänster thoracotomy. Den blå pilen visar peri-infarct området och den röda pilen visar infarct området. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4: Hjärtfunktionen ändras efter MI. (A) En LV M-läge ekokardiogram bild vid baslinjen, MI, och cell transplantation. LVEF, LVEDD, LVESD minskade signifikant 8 veckor efter MI-induktion och ökade signifikant i hiPSC- MSCs-gruppen 8 veckor efter celltransplantation. (B) För att bedöma svinens hjärtfunktion med hjärtsvikt mättes +dP/dt-värdet och ESPVR med en PV-signalprocessor. Den sämre vena cava (IVC) var occluded av ballong inflation (blå pil) under ESPVR bedömning. Både +dP/dt och ESPVR minskade signifikant efter MI-induktion, och ökade sedan signifikant i hiPSC- MSC-grupperna 8 veckor efter transplantationen. ANOVA följt av Student-Newman-Keuls post hoc-testning (SPSS, version 14) användes med α = 0,05 för signifikans. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5: Infarct-området ändras efter felinhedning. LV tvärgående riktningsprover som är sektionerade med 1 cm tjocklekar i varje hjärta innehållande infarcted myokardium. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Cellöverlevnad efter transplantationen. Engraftment av de transplanterade hiPSC-MSCs upptäcktes av immunohistochemical färgning foranti-human nukleära antigen (röd färg). Skala bar = 100 μm. Pilar representerar positiva celler. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 7: Incidensen av ihållande ventrikel takyarytmier. (A) Ventrikulärt takyarytmier (VT, röd pil) framkallat av in vivo intracardiac programmerad elektrisk stimulering. (B) Incidensen av VT ökade signifikant efter MI induktion. Celltransplantation ökade inte förekomsten av VT. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Echocardiogram förvärv. Den vänstra panelen visar djurets position. Den högra panelen visar avsökningspositionen. Den mellersta panelen visar den ekokardiografiska bilden under denna position. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 2: Fartygens placering. Grisar placerades i ryggläge. Snitt för halsartären och femorala gatan presenteras som en röd linje. Den halspulsådern och femorala anda var under halsartären och femorala gatan respektive. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standard djurmodeller är av största vikt för att förstå patofysiologi och mekanismer för sjukdomar och testa nya therapeutics. Vårt protokoll upprättar en svin modell av HF inducerad av vänster cirkumflex gatan blockering och snabb pacing. Åtta veckor efter induktionen av MI utvecklade djuren betydande försämring av LVEF, LVEDD, LVESD, +dP/dt och ESPVR. Detta protokoll testar också administreringsmetoden för stamcellsterapi för hjärtregenerering genom intramyocardial injektion. Infarct storlek, och hjärt systoliskt och diastoliskt funktion utvärderas. Denna studie hjälper till att etablera en stabil och reproducerbar preklinisk stor djur HF modell för stamcellsbehandling, som liknar kliniska fall.
LCX blockering och snabb pacing har använts i stor utsträckning för att skapa djurmodeller av HF i våra tidigare studier7,8. LCX distala till den första trubbig marginell gren var occluded, följt av 4 veckor av snabb rätt Ventrikulärt pacing. Myokardium ischemi resulterar i förlust av kardiomyocyter under MI, som orsakar hjärt fibros, hjärtinfarkt remodeling och hjärtarytmi. Ventrikulärt pacing resulterar i betydande LV dilation, nonischemic nedskrivningar av vänster ventrikulärt kontraktilitet, och svår LV dysfunktion9,10. Längre löptider av ischemi och snabb pacing producerar en progressiv experimentell låg-output HF modell för translationell forskning. Tidigare studier etablerade hjärtsviktsmodeller genom att inducera MI10. Dödligheten i svår MI var dock högre och LVEF-minskningen av MI var instabil. Därför tillämpar vi snabb rätt Ventrikulärt fram efter LCX blockering att framkalla betydande nedskrivningar av hjärt funktion. Som kan ses i våra tidigare studier, modellen presenteras här ger stabil infarct storlek, och LVEF av denna modell reduceras till åtminstone under 40% normal6,7,8. Hade det varit färre infektioner och blödningar, vår modell framgång kunde ha varit runt 80%.
En av de största hindren för den kliniska tillämpningen av stamceller är deras dåliga överlevnad och engraftment efter transplantation. Nyligen genomförda kliniska studier och meta-analys11,12,13,14,15 har misslyckats med att visa någon konsekvent förbättring av LV-funktion eller infarct storlek efter sådan terapi. En av de potentiella orsakerna är den låga överlevnaden för transplanterade celler. Att upptäcka en optimal administrationsmetod spelar en avgörande roll i stamcellsterapier. Jämföra de tre metoderna för celltransplantation, intramyokardiell administration är effektivare än intravenös och intracoronary administration på grund av högre cell retention16,17. Därför valde vi en intramyokardiell administrationsväg för iPSC-MSCs leverans i denna studie. Echocardiographic resultat och invasiva hemodynamic resultat visat att intramyocardial administration av iPSC-MSCs ameliorated LV funktion av post-MI HF svin 8 veckor efter cell transplantation. Trots administrering av immunsuppressiva läkemedel (en steroid och cyclosporin), endast ett fåtal transplanterade celler upptäcktes i peri-infarct området. Ingen överlevande cell upptäcktes i infarcted området runt det injicerade området. Tidigare studier har också funnit en extremt liten del av stamceller i infarcted hjärtmuskeln eftertransplantationen 18,19,20,21. Cellförlust under den intramyokardiella administrationen kan påverka de experimentella resultaten. Hur man kan förbättra administrationsmetoderna och öka uppehållsgraden bör klargöras i framtida studier.
Säkerhet, särskilt arytmogenesis, är en annan viktig fråga när det gäller klinisk praxis med cellbaserade terapier. Vår senaste studie visade att intramyokardiell administrering av mänskliga embryostamcell (hESC) härledda CMs ökade förekomsten av spontana icke-ihållande ventrikulära takyarrhythmias4. I vår post-MI HF svin modell var förekomsten av spontana icke-ihållande Ventrikulärt takyarrhythmia (rate >180 bpm och >12 beats) registreras av telemetri övervakning från pacemakern 25% efter MI induktion, men ihållande VT kunde lätt induceras (80%). I denna studie förblir förekomsten av plötslig död oförändrad med eller utan administrering av hiPSC- MSCs. Dessutom har hiPSC-MSCs transplantation inte modifiera den underliggande hjärtinfarkt substrat att minska eller öka mottaglighet för ventrikulärt arytmier. Detta resultat tyder på att den stora djur kroniska HF-modellen skulle kunna användas för cellsäkerhet bedömning.
Undvikande av infektion och blödning är av största vikt för framgångsrika djurmodell etablering. För att minska risken för blödningar, bör uppmärksamhet ägnas åt att undvika eventuella skador på kranskärl och hjärtvener. Som två djur dog av svår infektion, en lämplig postoperativa medicinsk strategi kommer att vara nytta. Här tillhandahåller vi en postoperativ medicinsk strategi enligt nedan: Intramuskulärt administrera enrofloxacin (7,5 mg/kg, SID) och buprenorfin (0,02 mg/kg, BID) kombinerat med oralt administrera Amoxycillin/Clavulanic Acid (12,5mg/kg, SID) och Carprofen (2 mg/kg, SID) till alla djur under 1 vecka efter operationen för att förhindra infektion och lindra smärta.
Sammanfattningsvis ger den nuvarande metoden en stabil och reproducerbar kliniskt relevant stor djurmodell av hjärtsvikt för cellbaserade terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Alfreda och Kung Tak Chung för deras utmärkta tekniska stöd under djurförsöken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Mylan | - | - |
| Anaesthetic machines and respirator | Drager | Fabius plus XL | - |
| Angiocath | Becton Dickinson | 381147 | - |
| Anti-human nuclear antigen | abcam | ab19118 | - |
| Axio Plus image capturing system | Zeiss | Axioskop 2 PLUS | Axioskop 2 plus |
| AxioVision Rel. 4.5 software | Zeiss | - | - |
| Baytril | Bayer | - | enrofloxacin |
| Betadine | Mundipharma | - | - |
| CardioLab Electrophysiology Recording Systems | GE Healthcare | G220f | - |
| Culture media | MesenCult | 05420 | - |
| Cyclosporine | Novartis | - | - |
| Defibrillator | GE Healthcare | CardioServ | - |
| Dorminal | TEVA | - | - |
| Echocardiographic system | GE Vingmed | Vivid i | - |
| EchoPac software | GE Vingmed | - | - |
| Electrophysiological catheter | Cordis Corp | - | - |
| Embozene Microsphere | Boston Scientific | 17020-S1 | 700 μm |
| Endotracheal tube | Vet Care | VCPET70PCW | Size 7 |
| Ethanol | VWR chemicals | 20821.33 | - |
| Formalin | Sigma | HT501320 | 10% |
| IVC balloon Dilatation Catheter | Boston Scientific | 3917112041 | Mustang |
| JR4 guiding catheter | Cordis Corp | 67208200 | 6F |
| Lidocaine | Quala | - | - |
| Mersilk | Ethicon | W584 | 2-0 |
| Metoprolol succinate | Wockhardt | - | - |
| Microtome | Leica | RM2125RT | - |
| Mobile C arm fluoroscopy equipment | GE Healthcare | OEC 9900 Elite | - |
| Pacemaker | St Jude Medical | PM1272 | Assurity MRI pacemaker |
| Pacemaker generator | St Jude Medical | Merlln model 3330 | - |
| Pressure-volume catheter | CD Leycom | CA-71103-PL | 7F |
| Pressure–volume signal processor | CD Leycom | SIGMA-M | - |
| Programmable Stimulator | Medtronic Inc | 5328 | - |
| PTCA Dilatation balloon Catheter | Boston Scientific | H7493919120250 | MAVERICK over the wire |
| Ramipril | TEVA | - | - |
| Sheath introducer | Cordis Corp | 504608X | 8F, 9F, 12F |
| Steroid | Versus Arthritis | - | - |
| Temgesic | Nindivior | - | buprenorphine |
| Venous indwelling needle | TERUMO | SR+OX2225C | 22G |
| Vicryl | Ethicon | VCP320H | 2-0 |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | - | - |
| Zoletil | Virbac New Zealand Limited | - | tiletamine+zolezepam |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131, e29 (2015).
- Hospital Authority. Hospital Authority Statistical Report 2013. , Hong Kong. (2013).
- Cung, T. T., et al. Cyclosporine before PCI in Patients with Acute Myocardial Infarction. The New England Journal of Medicine. 373 (11), 1021-1031 (2015).
- Liao, S. Y., et al. Proarrhythmic risk of embryonic stem cell-derived cardiomyocyte transplantation in infarcted myocardium. Heart Rhythm. 7, 1852-1859 (2010).
- Liao, S. Y., et al. Overexpression of Kir2.1 channel in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes attenuates posttransplantation proarrhythmic risk in myocardial infarction. Heart Rhythm. 10, 273-282 (2013).
- Liu, Y., et al. Thoracic spinal cord stimulation improves cardiac contractile function and myocardial oxygen consumption in a porcine model of ischemic heart failure. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 23, 534-540 (2012).
- Liao, S. Y., et al. Improvement of Myocardial Function Following Catheter-Based Renal Denervation in Heart Failure. JACC: Basic to Translational Science. 2 (3), 270-281 (2017).
- Liao, S. Y., et al. Remodelling of cardiac sympathetic re-innervation with thoracic spinal cord stimulation improves left ventricular function in a porcine model of heart failure. Europace. 17 (12), 1875-1883 (2015).
- Daehnert, I., Rotzsch, C., Wiener, M., Schneider, P. Rapid right ventricular pacing is an alternative to adenosine in catheter interventional procedures for congenital heart disease. Heart. 90 (9), 1047-1050 (2004).
- Hála, P., et al. Tachycardia-Induced Cardiomyopathy as a Chronic Heart Failure Model in Swine. Journal of Visualized Experiments. (132), e57030 (2018).
- Santoso, T., et al. Endomyocardial implantation of autologous bone marrow mononuclear cells in advanced ischemic heart failure: a randomized placebo-controlled trial (END-HF). Journal of Cardiovascular Translational Research. 7, 545-552 (2014).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network. Effect of intracoronary delivery of autologous bone marrow mononuclear cells 2 to 3 weeks following acute myocardial infarction on left ventricular function: the LateTIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 306, 2110-2119 (2011).
- Traverse, J. H., et al. Cardiovascular Cell Therapy Research Network (CCTRN). Effect of the use and timing of bone marrow mononuclear cell delivery on left ventricular function after acute myocardial infarction: the TIME randomized trial. Journal of the American Medical Association. 308, 2380-2389 (2012).
- de Jong, R., Houtgraaf, J. H., Samiei, S., Boersma, E., Duckers, H. J. Intracoronary stem cell infusion after myocardial infarction. A meta-analysis and update on clinical trials. Circulation: Cardiovascular Interventions. 7, 156-167 (2014).
- Nowbar, A. N., et al. DAMASCENE writing group. Discrepancies in autologous bone marrow stem cell trials and enhancement of ejection fraction (DAMASCENE): weighted regression and meta-analysis. British Medical Journal. 348, g2688 (2014).
- Kanelidis, A. J., Premer, C., Lopez, J., Balkan, W., Hare, J. M. Route of Delivery Modulates the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Therapy for Myocardial Infarction: A Meta-Analysis of Preclinical Studies and Clinical Trials. Circulation Research. 120 (7), 1139-1150 (2017).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112 (9 Suppl), I150-I156 (2005).
- Hu, X., et al. A Large-Scale Investigation of Hypoxia-Preconditioned Allogeneic Mesenchymal Stem Cells for Myocardial Repair in Nonhuman Primates: Paracrine Activity Without Remuscularization. Circulation Research. 118, 970-983 (2016).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Martens, A., et al. Substantial early loss of induced pluripotent stem cells following transplantation in myocardial infarction. Artificial Organs. 38, 978-984 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538, 388-391 (2016).
