Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren von okulärer Hypertonie und glaukomatischer Neurodegeneration in Mausaugen durch intracameralInjektion von Silikonöl und das Verfahren zur Silikonölentfernung aus der vorderen Kammer vor, um erhöhten Augeninnendruck Normalen.
Abstract
Erhöhter Augeninnendruck (IOP) ist ein gut dokumentierter Risikofaktor für Glaukom. Hier beschreiben wir eine neuartige, effektive Methode zur konsequenten Induktion einer stabilen IOP-Erhöhung bei Mäusen, die die postoperative Komplikation der Verwendung von Silikonöl (SO) als Tamponade-Mittel in der menschlichen Glaskörperchirurgie imitiert. In diesem Protokoll wird SO in die vordere Kammer des Mausauges injiziert, um die Pupille zu blockieren und den Zustrom von wässrigem Humor zu verhindern. Die hintere Kammer akkumuliert wässrigen Humor und dies wiederum erhöht den IOP des hinteren Segments. Eine einzelne SO-Injektion erzeugt eine zuverlässige, ausreichende und stabile IOP-Erhöhung, die eine signifikante glaukomatige Neurodegeneration induziert. Dieses Modell ist eine echte Replik des sekundären Glaukoms in der Augenklinik. Um die klinische Umgebung weiter nachzuahmen, kann SO aus der vorderen Kammer entfernt werden, um den Drainageweg wieder zu öffnen und den Zufluss von wässrigem Humor zu ermöglichen, der durch das trabekuläre Netz (TM) im Winkel der vorderen Kammer entwässert wird. Da IOP schnell wieder normal ist, kann das Modell verwendet werden, um die Wirkung der Senkung des IOP auf glaukomatous retinale Ganglienzellen zu testen. Diese Methode ist einfach, erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Wiederholungsverfahren, simuliert klinische Situationen genau und kann auf verschiedene Tierarten anwendbar sein. Es können jedoch geringfügige Änderungen erforderlich sein.
Introduction
Der fortschreitende Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs) und ihren Axonen ist das Kennzeichen des Glaukoms, einer häufigen neurodegenerativen Erkrankung in der Netzhaut1. Es wird bis 2040 mehr als 100 Millionen Personen im Alter von 40 bis 80 Jahren betreffen2. Der IOP bleibt der einzige veränderbare Risikofaktor bei der Entwicklung und Progression des Glaukoms. Um die Pathogenese, Progression und mögliche Behandlungen von Glaukom zu erforschen, ist ein zuverlässiges, reproduzierbares und induzierbares experimentelles okuläres Hypertonie-/Glaukommodell, das die wichtigsten Merkmale menschlicher Patienten repliziert, unerlässlich.
IOP hängt vom wässrigen Humorzufluss in die vordere Kammer vom Ziliarkörper in der hinteren Kammer ab und fließt durch das trabekuläre Netz (TM) im Winkel der vorderen Kammer aus. Bei Erreichen eines stabilen Zustands wird der IOP beibehalten. Wenn der Zufluss den Abfluss über- oder kleiner überschreitet, steigt bzw. fällt der IOP. Durch die Verringerung des wässrigen Abflusses entweder durch Verschluss des Winkels der vorderen Kammer oder durch Beschädigung der TM, wurden mehrere Glaukommodelle eingerichtet3,4,5,6,7,8,9,10. Diese Modelle sind normalerweise mit irreversiblen Augengewebeschäden verbunden, und der hohe IOP in der vorderen Kammer verursacht auch unerwünschte Komplikationen wie Hornhautödem eimten und intraokulare Entzündungen, die die Durchführung und Interpretation von Retinal-Bildgebung und sehischer Funktion erschweren.
Um ein Modell zu entwickeln, das diese Mängel überwindet, konzentrierten wir uns auf das gut dokumentierte Sekundärglaukom, das durch Silikonöl (SO) verursacht wird und als postoperative Komplikation der menschlichen vitreoinalen Chirurgie11,12auftritt. SO wird als Tamponade in Netzhautoperationen wegen seiner hohen Oberflächenspannung verwendet. SO kann die Pupille jedoch physisch ausblenden, da sie leichter ist als die wässrigen und glasigen Flüssigkeiten, was einen wässrigen Fluss in die Vorderkammer verhindert. Die Behinderung verursacht IOP-Erhöhung in der hinteren Kammer aufgrund der wässrigen Humor Akkumulation. Dies motivierte uns, ein neuartiges okulares Hypertonie-Mausmodell zu entwickeln und zu charakterisieren, das auf intracameraler SO-Injektion und Pupillenblock13basiert, mit den wichtigsten Merkmalen des Sekundärglaukoms: effektiver Pupillenblock, signifikante IOP-Erhöhung, die nach DER SO-Entfernung wieder normal werden kann, und glaukomatus Neurodegeneration.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für SO-induzierte okuläre Hypertonie im Mausauge vor, einschließlich SO-Injektion und -Entfernung und IOP-Messung.
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stanford University genehmigt.
1. Augen-Hypertonie-Induktion durch intracamerale Injektion von SO
- Bereiten Sie eine Glas-Mikropipette für intracameral SO Injektion durch Ziehen einer Glaskapillare mit einem Pipettenzieher, um eine Mikropipette zu erzeugen. Schneiden Sie eine Öffnung an der Spitze der Mikropipette und schärfen Sie die Spitze mit einer Mikroschleifer-Abschrägungsmaschine weiter, um eine 35°-40°-Abschrägung zu machen.
- Polieren Sie die Ränder der Abschrägung und entfernen Sie alle Trümmer durch Waschen mit Wasser. Autoclavieren Sie die Mikropipette vor der Verwendung.
- Bereiten Sie die Paracentese-Nadel für den Hornhauteintrag vor. Befestigen Sie dazu eine 32 G Nadel an einer 5 ml Spritze an einem Luer-Schloss und sichern Sie sie weiter mit Klebeband. Biegen Sie die Nadelschräge nach oben bei 30°.
- Bereiten Sie den SO-Injektor vor, indem Sie zuerst eine stumpfe 18 G Nadel auf einer 10 ml Spritze befestigen und sichern. Dann befestigen Sie ein Kunststoffrohr mit der 18 G Nadel an einem Ende und füllen Sie es mit SO nach Bedarf durch das andere Ende.
- Befestigen Sie die sterilisierte Mikropipette am Kunststoffrohr und drücken Sie den Spritzenkolben, um die gesamte Mikropipette mit SO zu füllen.
2. Intracameral SO Injektion für ein Auge
- Legen Sie eine 9-10 Wochen alte männliche C57B6/J-Maus in eine Induktionskammer mit 3% Isofluran, die mit Sauerstoff bei 2 L/min für 3 min gemischt wird.
- Intraperitoneal injizieren 2,2,2-Tribromethanol bei 0,3 mg/g Körpergewicht.
HINWEIS: Im Gegensatz zu Ketamin/Xylazin verursacht 2,2,2-Tribromethanol keine offensichtliche Pupillendilatation. - Prüfen Sie, ob auf eine Zehenklemme und die fehlende Bewegung der Schnurrhaare oder des Schwanzes reagiert wird, um die Anästhesiestärke zu bestimmen.
- Platzieren Sie die Maus in einer seitlichen Position auf einer Operationsplattform. Um seine Empfindlichkeit während des Verfahrens zu reduzieren, wenden Sie vor der Injektion einen Tropfen von 0,5% Proparacainhydrochlorid auf die Hornhaut an.
- Machen Sie einen Einstiegsschnitt mit der 32 G Paracentese-Nadel am superotemporalen Quadranten, ca. 0,5 mm vom Limbus entfernt.
- Tunnel durch die Schichten der Hornhaut für ca. 0,3 mm, bevor sie in die vordere Kammer eindringt. Achten Sie darauf, die Linse oder Iris nicht zu berühren.
- Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um etwas wässrigen Humor (ca. 1,2 L) aus der vorderen Kammer durch den Tunnel (Parazentosien) freizusetzen.
- Warten Sie 8 min, um den IOP weiter zu verringern. Dies kann durch Messung des kontralateralen Kontrollauges bestimmt werden.
- Setzen Sie die mit SO vorinstallierte Glasmikropipette durch den Hornhauttunnel in die vordere Kammer ein, wobei die Abschrägung nach unten zur Irisoberfläche zeigt.
- Drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um SO in die vordere Kammer zu injizieren, bis das SO-Tröpfchen den größten Teil der Irisoberfläche mit einem Durchmesser von 2,3 bis 2,4 mm bedeckt.
- Lassen Sie die Mikropipette in der vorderen Kammer für 10 s mehr, bevor Sie sie langsam zurückziehen.
- Drücken Sie vorsichtig das obere Augenlid, um den Hornhautschnitt zu schließen, um SO-Leckage zu minimieren.
- Antibiotikum Salbe (Bacitracin-Neomycin-Polymyxin) auf die Augenoberfläche auftragen.
- Während des gesamten Eingriffs befeuchten Sie häufig die Hornhaut mit künstlichen Tränen.
- Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis vollständig von der Anästhesie erholt.
3. SO Entfernung
- Bereiten Sie das Bewässerungssystem vor.
- Bereiten Sie die Bewässerungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und legen Sie sie in die Bewässerungsflasche. Elevate die Bewässerungslösungflasche auf 110 x 120 cm (81 x 88 mmHg) über der Operationsplattform.
- Befestigen Sie einen IV-Verwaltungssatz an der Bewässerungslösungsflasche. Entfernen Sie Luftblasen aus dem IV-Schlauch. Schließen Sie eine 33 G Nadel, die auf 20° gegenüber gebogen ist, bis zum IV-Schlauch an.
- Um das Entwässerungssystem vorzubereiten, entfernen Sie den Kolben aus einer 1 ml Spritze. Befestigen Sie eine 33 G Nadel an der Spritze und biegen Sie die Nadel auf 20°.
- Entfernen Sie SO aus der vorderen Kammer.
- Intraperitoneal injizieren 2,2,2-Tribromethanol (0,3 mg/g Körpergewicht). Prüfen Sie, ob die Zehenzange nicht reagiert, um die Anästhesiestärke und die bewegungsunbewegte Kraft der Schnurrhaare oder des Schwanzes zu bestimmen.
- Legen Sie die Maus auf eine Operationsplattform und befestigen Sie sie in der seitlichen Position mit Klebeband. Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Proparacainhydrochlorid auf die Hornhaut auf, um ihre Empfindlichkeit zu reduzieren.
- Machen Sie zwei Einschnitte im zeitlichen Quadranten der Hornhaut zwischen 2 und 5 Uhr am Rand des SO-Tröpfchens mit der vorgefertigten 32 G Paracentesis-Nadel.
- Setzen Sie eine 33 G Bewässerungsnadel, die mit der Bewässerungslösung verbunden ist, durch einen Hornhautschnitt, maximale Geschwindigkeit.
- Setzen Sie eine weitere 33 G Drainagenadel an der Spritze ohne Kolben durch den anderen Hornhautschnitt befestigt, damit das SO-Tröpfchen die vordere Kammer verlassen kann, während es mit Bewässerungslösung bewässert wird.
- Ziehen Sie die Drainagenadel, dann die Bewässerungsnadel.
- Injizieren Sie eine Luftblase in die vordere Kammer, um ihre normale Tiefe zu erhalten, und drücken Sie, um den Hornhautschnitt zu schließen.
- Antibiotikum Salbe auf beide Augen auftragen.
- Halten Sie die Maus auf dem Heizrückgewinnungspad, bis vollständig aus der Anästhesie erholt.
4. IOP-Messung einmal pro Woche
- Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer, die mit 3% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff, bei 2L/min für 3 min durchsetzt ist.
- Intraperitoneal injizieren Xylazin und Ketamin (0,01 mg Xylazin/g, 0,08 mg Ketamin/g).
- Halten Sie die Hornhaut feucht, indem Sie künstliche Tränen während des gesamten Verfahrens anwenden.
- Warten Sie ca. 15 min, damit sich der Schüler vollständig vermehren kann.
- Messen Sie den IOP beider Augen mit einem Tonometer gemäß produktanweisungen. Bringen Sie das Tonometer in die Nähe des Mausauges. Halten Sie den Abstand von der Spitze der Sonde zur Maushornhaut bei ca. 3 x 4 mm. Drücken Sie die Messtaste 6x, um einen Messwert zu erzeugen. Von jedem Auge werden drei maschinengenerierte Messwerte erhalten, um den mittleren IOP zu erhalten.
- Opfern Sie die Tiere nach 8 Wochen nach der SO-Injektion und führen Sie die Immunhistochemie der gesamten Netzhaut, RGC-Zählung, Sehnerv (ON) halbdünnen Abschnitte und Quantifizierung der überlebenden Axone, die vor13beschrieben wurden.
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Representative Results
Bald nach der Injektion können wir leicht Mäuse identifizieren, die keine stabile okuläre Hypertonie erzeugen, weil die SO-Tröpfchen zu klein sind (ca. 1,5 mm)13. Diese Tiere sind von späteren Versuchen ausgeschlossen. Nach den Injektionsverfahren erhalten mehr als 80 % der SO-injizierten Mäuse Tröpfchen, die größer als 1,6 mm sind. Wir haben den IOP dieser Mausaugen einmal pro Woche für 8 Wochen nach einer einzigen SO-Injektion gemessen. Der IoD des Auges, das SO erhielt, blieb hoch, im Allgemeinen doppelt so hoch wie der IOP des kontralateralen Kontrollauges, was auf eine effektive Pupillenblockierung hindeutet (Abbildung 1). Ödeme in der MausHornhaut kann unter einem Lichtdissektionsmikroskop nach einer intracameralen Injektion überprüft werden, die normalerweise 2 bis 3 Tage für die Genesung dauert. Die Pupillendilatation braucht Zeit, und man muss auf die Pupillendilatation warten, bevor man die IOP-Messung nimmt. Daher versuchen wir, den IOP nach einer Injektion nicht zu früh zu messen. Aus dem gleichen Grund empfehlen wir nicht, den IOP zu oft zu messen. Mit einer anderen Gruppe von Mäusen spülten wir die SO 2 Wochen nach der SO-Injektion aus der vorderen Kammer heraus, und wir warteten eine weitere Woche, um die Hornhaut erholen zu lassen, bevor wir IOP missten, wodurch der IOP stabil wieder normal wurde (Abbildung 1).
Um die Auswirkungen der durch SO-Injektion induzierten okulären Hypertonie auf RGCs zu bestimmen, quantifizierten wir die überlebende RGC-Somata in den peripheren Regionen der retinalen Ganzhänge durch RBPMS-Färbung14,15 und die überlebenden Axone in den ON-Halbquerschnitten durch PPD-Färbung16 nach 8 Wochen nach SO-Injektion. Glaukomatöser RGC-Tod und Axondegeneration waren bei SO-induzierten augenbedingten Hypertonie-Unterspannungsaugen (SOHU) dramatisch (Abbildung 2). Weitere Einzelheiten hierzu finden Sie im Diskussionsbereich.
Abbildung 1: IOP-Messungen in SO-Augen und kontralateralen Kontrollaugen mit oder ohne SO-Entfernung. SO = SO injizierte Augen; CL = kontralaterale Kontrollaugen. Die Daten werden als Mittel dargestellt: S.E.M, n = 12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Glaukomas-RGC-Soma und Axondegeneration bei SOHU. (A) Oberpanel zeigt die periphere Region, die RGCs (RBPMS+, rot) 8 Wochen nach DER SO-Injektion von vollmontierten Netzhaut zeigt. Scale bar = 20 m. Untere Platte zeigt halbdünne Bilder von Querschnitten des ON mit PPD gefärbt nach 8 Wochen nach SO-Injektion. Scale bar = 10 m (B) Quantifizierungsdaten der überlebenden RGCs in der peripheren Netzhaut (n = 12) und Axone in der ON (n = 10) nach 8 Wochen nach der SO-Injektion im Vergleich zu den Augen der kontralateralen Kontrolle (CL). Die Daten werden als Mittel dargestellt: P < 0,0001; Schüler paired t Test. RGC = retinale Ganglienzelle; ON = Sehnerv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier zeigen wir ein einfaches, aber effektives Verfahren zur Induktion einer anhaltenden IOP-Erhöhung im Mausauge durch intracameral Injektion von SO. Dieses Verfahren kann schnell von jedem erlernt werden, der Erfahrung mit Mikrodissektion unter dem Mikroskop hat. Das primäre potenzielle Ausfallrisiko ist das Auslaufen von SO aus dem Hornhautschnitt. Einer der Vorteile der Verwendung von SO ist jedoch, dass wir, da das Öltröpfchen sichtbar und messbar ist, Leicht Mäuse identifizieren können, die Tröpfchen zu klein erhielten, um kurz nach der Injektion eine stabile okuläre Hypertonie auszulösen, und sie von nachfolgenden Experimenten ausschließen können. Wir haben routinemäßig eine Erfolgsrate von 80% erreicht und etwa 20% der Mäuse aufgrund eines kleinen SO-Tröpfchens (ca. 1,5 mm)13ausgeschlossen. Ein erfahrener Chirurg, der einen relativ langen Tunnel (0,3 mm) innerhalb der Hornhautschichten machen kann, bevor er mit der abgeschrägten Spitze in die Vorderkammer eindringt, kann jedoch fast jede SO-Leckage verhindern, indem er die innere Öffnung des Hornhauttunnels viel kleiner macht als die äußere Öffnung. Daher wurden fast alle Mäuse mit einem SO-Tröpfchen über 1,8 mm injiziert. Neben der Länge des Tunnels sind einige andere kritische Punkte hervorzuheben. Erstens ist es wichtig, den IOP niedrig in der injizierten Auge zu halten, um zu vermeiden, dass die SO aus der vorderen Kammer geschoben wird. Ein häufiger Fehler ist es, zu viel SO zu injizieren, was die Leckage erleichtert. Wir begrenzen das Volumen von SO in der vorderen Kammer, so dass es fast, aber nicht vollständig, die Irisoberfläche bedeckt. Der Durchmesser dieses SO-Tröpfchens beträgt 2,3 x 2,4 mm. Zweitens wird der Hornhauttunnelschnitt so nah wie möglich am Limbus gemacht, damit der Schnitt nahe an die Iris herankommt, sie aber nicht verletzt, so dass die Iris den Schnitt leicht aufnehmen kann. Drittens sollte die Einspritzgeschwindigkeit so langsam wie möglich sein, um einen übermäßigen Überlauf der SO in die vordere Kammer zu vermeiden. Viertens hilft die obere Augenlidmassage nach der Injektion dem Hornhautschnitt zu schließen und hilft manchmal der vorderen Synechiae der peripheren Iris, den Hornhautschnitt zu schließen und somit Öllecks zu vermeiden.
Es gibt eine Zunahme des IOP nur im hinteren Teil des Auges, aber nicht in der vorderen Kammer, so dass es ein einzigartiges Merkmal dieses Modells. Die Pupillenblockierung verhindert einen wässrigen Humoreinzug in die Vorderkammer und erhöht daher den IOP nur im hinteren Teil. Die physikalische Barriere, die durch die SO zusammen mit der Iris und der großen Augenlinse gebildet wird, kann die vordere Kammer vom hinteren Segment trennen, was die IOP-Höhe nur im hinteren Segment einschränken kann, wo sich das wässrige Material ansammelt. Wenn die Mauspupille nach der Dilatation größer als das SO-Tröpfchen ist, werden die vorderen und hinteren Kammern wieder verbunden, was eine schnelle Erhöhung des IOP in der vorderen Kammer durch wässrige Überflutung in sie ermöglicht. Daher kann ein Tonometer den erhöhten IOP erst nach dem Entfernen des Pupillenblocks erkennen, so dass der wahre IOP im hinteren Segment zweifellos unterschätzt wird. Daher nannten wir dieses Modell das SO-induzierte okuläre Hypertonie-Unterspannungsmodell (SOHU), das dieses Schlüsselmerkmal des Modells genauer und nützlicher widerspiegelt. Am besten wäre es, den IOP im hinteren Segment direkt messen zu können, aber bisher ist dies nicht möglich. Diese einzigartige Pathogenese des SOHU-Modells hat zwei vorteilhafte Eigenschaften: Erstens haben die experimentellen Augenaugen klare Augenelemente, die eine in vivo-Bewertung der visuellen Funktion und Morphologie ermöglichen, und zweitens die schwere glaukomatende Neurodegeneration. ermöglicht es, jeden Nutzen von Testen von Neuroprotektoren zu erkennen.
SO-Injektion kann vorübergehend Hornhautödeme verursachen und wir empfehlen, IOP-Messungen nicht zu früh oder zu oft durchzuführen. Wir haben keine Entzündungen in der vorderen Kammer oder Hornhaut in SOHU-Augen festgestellt, obwohl wir bei den mehr als 100 Mäusen, die SO-Injektionen erhielten, auf zwei Fälle von Hornhaut-Neovaskularisation gestoßen sind.
Da SO bei menschlichen Patienten und Mäusen eine okuläre Hypertonie verursacht, ist es sinnvoll zu postulieren, dass dieses konzeptionell neuartige und praktisch signifikante Glaukommodell für größere Tiere angepasst werden kann, die besser für präklinische Anwendungen geeignet sind. Die Charakterisierung der Defizite in der neuronalen Funktion und Morphologie dieses Modells wird sicherlich andere Forscher ermutigen, es zu nutzen, um wichtige Fragen in Bezug auf Glaukom und, noch allgemeiner, Krankheiten zu verfolgen, die RGC und ON induzieren. Degeneration.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich um ein einfaches Tierglaukommodell handelt, das keine spezielle Ausrüstung oder wiederholte Verletzungen erfordert und auf andere Tierarten anwendbar sein kann. Faszinierenderweise kann die IOP-Erhöhung des SOHU-Modells umgekehrt werden, indem das Öl aus der vorderen Kammer entfernt wird, daher ist es nützlich für das Screening der neuroprotektive Behandlung in Kombination mit IOP-senkenden Therapien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse EY024932, EY023295 und EY028106 an YH unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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