Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para induzir hipertensão ocular e neurodegeneração glaucomatous nos olhos do rato por injeção intracameral de óleo de silicone e o procedimento para a remoção de óleo de silicone da câmara anterior para retornar pressão intraocular elevada para Normal.
Abstract
A pressão intraocular elevada (OPP) é um fator de risco bem documentado para glaucoma. Aqui descrevemos um novo método eficaz para induzir consistentemente a elevação estável de IOP em camundongos que imita a complicação pós-operatória do uso de óleo de silicone (SO) como um agente de tamponada na cirurgia de vitreoretinal humana. Neste protocolo, SO é injetado na câmara anterior do olho do rato para bloquear a pupila e evitar o fluxo de humor aquoso. A câmara posterior acumula humor aquoso e isso, por sua vez, aumenta o IOP do segmento posterior. Uma única injeção de SO produz elevação de IOP confiável, suficiente e estável, o que induz neurodegeneração glaucomatous significativa. Este modelo é uma verdadeira réplica do glaucoma secundário na clínica oftalmológica. Para imitar ainda mais o ambiente clínico, assim pode ser removido da câmara anterior para reabrir a via de drenagem e permitir o fluxo de humor aquoso, que é drenado através da malha trabecular (TM) no ângulo da câmara anterior. Como o IOP retorna rapidamente ao normal, o modelo pode ser usado para testar o efeito da redução do IOP nas células ganglionares da retina glaucomatous. Este método é simples, não requer equipamentos especiais ou procedimentos de repetição, simula de perto situações clínicas e pode ser aplicável a diversas espécies animais. No entanto, pequenas modificações podem ser necessárias.
Introduction
A perda progressiva de células ganglionares da retina (RGCs) e seus axônios é a marca registrada do glaucoma, uma doença neurodegenerativa comum na retina1. Afetará mais de 100 milhões de indivíduos de 40 a 80 anos até 20402. O IOP continua a ser o único fator de risco modificável no desenvolvimento e progressão do glaucoma. A fim de explorar a patogênese, progressão e tratamentos potenciais de glaucoma, um modelo de hipertensão ocular experimental/glaucoma confiável, reproduzível e indutor que reproduz as principais características dos pacientes humanos é imperativo.
O IOP depende da entrada aquosa do humor à câmara anterior do corpo ciliary na câmara posterior e da saída através do meshwork trabecular (TM) no ângulo da câmara anterior. Ao chegar a um estado estável, o IOP é mantido. Quando o fluxo excede ou é menor do que a saída, o IOP sobe ou cai respectivamente. Ao diminuir a saída aquosa, quer occluding o ângulo da câmara anterior ou por danificar o TM, vários modelos de glaucoma foram estabelecidos3,4,5,6,7,8,9,10. Esses modelos estão normalmente associados a danos irreversíveis do tecido ocular, e o alto OPE na câmara anterior também causa complicações indesejadas, como edema córnea e inflamação intraocular, que dificultam a realização e interpretação da imagem ocular da retina.
Para desenvolver um modelo que supere essas deficiências, nos concentramos no glaucoma secundário bem sudocumenta causado pelo óleo de silicone (SO) que ocorre como uma complicação pós-operatória da cirurgia vitreoretinal humana11,12. Assim é usado como um tamponade em cirurgias da retina por causa de sua tensão de superfície elevada. No entanto, Assim pode fisicamente ocluir a pupila, porque é mais leve do que os fluidos aquosos e vítreos, o que impede o fluxo aquoso para a câmara anterior. A obstrução causa elevação do IOP na câmara posterior devido à acumulação aquosa do humor. Isso nos motivou a desenvolver e caracterizar um novo modelo de camundongo hipertensão ocular baseado na injeção intracameral SO e no bloco pupilar13,com características-chave do glaucoma secundário: bloco pupillar eficaz, elevação significativa do IOP que pode retornar ao normal após a remoção de SO e neurodegeneração glaucomatous.
Aqui apresentamos um protocolo detalhado para hipertensão ocular induzida por SO no olho do rato, incluindo injeção e remoção de SO e medição de IOP.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Stanford.
1. Indução ocular da hipertensão pela injeção intracameral de SO
- Prepare uma micropipette de vidro para injeção intracameral SO puxando um capilar de vidro com um puxador de pipeta para gerar uma micropipette. Corte uma abertura na ponta da micropipette e afie ainda mais a ponta com uma máquina de micromoedor para fazer um bisumo de 35°e 40°.
- Polonês as bordas do bisume e remover todos os detritos, lavando com água. Autoclave a micropipette antes de usar.
- Prepare a agulha da paracentese para a entrada da córnea. Para fazer isso, anexar uma agulha de 32 G para uma seringa de 5 mL em um bloqueio Luer, e fixá-lo ainda mais com fita adesiva. Dobre a ponta do bisumo da agulha de bruços a 30°.
- Prepare o injetor SO, anexando e garantindo uma ponta contundente 18 G agulha em uma seringa de 10 mL em primeiro lugar. Em seguida, anexar um tubo de plástico com a agulha de 18 G em uma extremidade e encher-se com SO, conforme necessário através da outra extremidade.
- Anexar a micropipette esterilizada para o tubo de plástico e empurre o desentupidor de seringa para encher toda a micropipette com SO.
2. Injeção intracameral so para um olho
- Coloque um rato C57B6/J masculino de 9 a 10 semanas de idade em uma câmara de indução com 3% isoflurane misturado com oxigênio a 2 L/min por 3 min.
- Intraperitoneally injetar 2,2,2-tribromoetanol em 0,3 mg / g peso corporal.
NOTA: Ao contrário da cetamina/xilazine, 2,2,2-tribromoetanol não causa dilatação óbvia da pupila. - Verifique se há falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do pés e a falta de movimento dos bigodes ou da cauda para determinar a força anestésica.
- Coloque o mouse em uma posição lateral em uma plataforma de cirurgia. Para reduzir sua sensibilidade durante o procedimento, aplique uma gota de cloridrato de proparacaína de 0,5% à córnea antes da injeção.
- Faça uma incisão de entrada com a agulha de paracentese 32 G no quadrante superotemporal, cerca de 0,5 mm do limbus.
- Túnel através das camadas da córnea por cerca de 0,3 mm antes de perfurar na câmara anterior. Tenha cuidado para não tocar a lente ou íris.
- Retire a agulha lentamente para liberar algum humor aquoso (cerca de 1 a 2 μL) da câmara anterior através do túnel (paracentese).
- Espere ~ 8 min para diminuir ainda mais o IOP. Isso pode ser determinado medindo o olho de controle contralateral.
- Insira a micropipette de vidro pré-carregada com SO através do túnel da córnea na câmara anterior, com o bisumo voltado para a superfície da íris.
- Empurre o desentupidor de seringa lentamente para injetar SO na câmara anterior até que a gota SO cobre a maior parte da superfície da íris, ~ 2,3-2,4 mm de diâmetro.
- Deixe a micropipette na câmara anterior para mais 10 s antes de retirá-la lentamente.
- Empurre delicadamente a pálpebra superior para fechar a incisão da córnea para minimizar o escapamento assim.
- Aplique pomada antibiótica (bacitracin-neomicina-polimixixina) à superfície dos olhos.
- Durante todo o procedimento, umedeça freqüentemente a córnea com rasgos artificiais.
- Mantenha o rato na almofada de aquecimento até que seja recuperado inteiramente da anestesia.
3. Remoção so
- Prepare o sistema de irrigação.
- Prepare a solução de irrigação de acordo com as instruções do fabricante e coloque-a na garrafa de irrigação. Elevará a garrafa de solução irrigante para 110 a 120 cm acima da plataforma de cirurgia.
- Anexar uma administração IV definido para a garrafa de solução de irrigação. Retire as bolhas de ar da tubulação IV. Conecte uma agulha 33 G dobrada a 20° face até a tubulação IV.
- Para preparar o sistema de drenagem, retire o desentupidor de uma seringa de 1 mL. Anexe uma agulha de 33 G à seringa e dobre a agulha a 20°.
- Retire-se da câmara anterior.
- Intraperitoneally injetar 2,2,2-tribromoetanol (0,3 mg / g peso corporal). Check for the lack of response to the toe pinch to determine the anesthetic strength and the lack of movement of the whiskers or the tail.
- Coloque o mouse em uma plataforma de cirurgia e fixá-lo na posição lateral com fita adesiva. Aplique uma gota de cloridrato de proparacaína de 0,5% à córnea para reduzir sua sensibilidade.
- Faça duas incisões no quadrante temporal da córnea entre ~2 e 5 horas na borda da gota SO usando a agulha de paracentese de 32 G pré-feita.
- Insira uma agulha de irrigação 33 G conectada à solução irrigante através de uma incisão da córnea, velocidade máxima.
- Insira outra agulha de drenagem 33 G presa à seringa sem um desentupidor através da outra incisão da córnea para permitir que a gota SO saia da câmara anterior enquanto irriga com solução de irrigação.
- Retire a agulha de drenagem, em seguida, a agulha de irrigação.
- Injetar uma bolha de ar na câmara anterior para manter sua profundidade normal e pressione para fechar a incisão da córnea.
- Aplique pomada antibiótica em ambos os olhos.
- Mantenha o rato na almofada de recuperação do aquecimento até que seja recuperado inteiramente da anestesia.
4. Medição do IOP uma vez por semana
- Coloque o mouse em uma câmara de indução perfundida com 3% isoflurane misturado com oxigênio em 2L/min por 3 min.
- Intraperitoneally injetar xilazine e cetamina (0,01 mg xilazine/g, 0,08 mg quetamina/g).
- Mantenha a córnea úmida aplicando lágrimas artificiais durante todo o procedimento.
- Espere cerca de 15 min para permitir que a pupila para dilatar totalmente.
- Medir o OPP de ambos os olhos usando um tonomômetro de acordo com as instruções do produto. Leve o tononter perto do olho do rato. Mantenha a distância da ponta da sonda para a córnea do rato em cerca de 3-4 mm. Pressione o botão de medição 6x para gerar uma leitura. Três leituras geradas por máquina são obtidas de cada olho para adquirir o IOP médio.
- Sacrifique os animais em 8 semanas após a injeção de SO e realizar imunohistoquímica de toda a montagem retina, contagem RGC, nervo óptico (ON) seções semi-finas, e quantificação de axônios sobreviventes, que foram descritos antesde 13.
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Representative Results
Logo após a injeção, podemos identificar facilmente camundongos que não produzem hipertensão ocular estável por causa das gotículas SO sendo muito pequenas (≤1,5 mm)13. Estes animais são excluídos dos experimentos subsequentes. Após os procedimentos de injeção, mais de 80% dos camundongos injetados SO acabam com gotículas maiores do que 1,6 mm. Medimos o OPP desses olhos de rato uma vez por semana durante 8 semanas após uma única injeção de SO. O OPP do olho que recebe SO permaneceu elevado, geralmente o dobro do OPP do olho de controle contralateral, indicando o bloqueio eficaz da pupila(Figura 1). O edema na córnea do rato pode ser verificado um microscópio claro da dissecação após uma injeção intracameral que tome normalmente 2-3 dias para a recuperação. A dilatação da pupila leva tempo, e é preciso esperar pela dilatação da pupila antes de tomar a medida do IOP. Assim, tentamos não medir o IOP muito cedo após uma injeção. Pela mesma razão, não recomendamos medir o IOP com muita frequência. Com outro grupo de camundongos, nós liberamos o SO da câmara anterior 2 semanas após a injeção de SO, e esperamos por mais uma semana para permitir que a córnea se recuperasse antes de medir o IOP, que retornou de forma etona o IOP ao normal(Figura 1).
Para determinar os efeitos da hipertensão ocular induzida pela injeção de SO em RGCs, quantificamos os somatas rgc sobreviventes nas regiões periféricas do conjunto da retina por rbpmsmanchando 14,15 e os axônios sobreviventes nas seções transversais semithin ON por ppdmanchando 16 em 8 semanas após a injeção de so. Glaucomatous RGC morte e degeneração do axônio foram dramáticas na hipertensão ocular induzida por sos (SOHU) (Figura 2). Mais detalhes sobre isso são fornecidos na seção de discussão.
Figura 1: Medições de IOP em so olhos e olhos de controle contralateral, com ou sem remoção SO. Então = Então, olhos injetados; CL = olhos de controle contralateral. Os dados são apresentados como meios ± S.E.M, n = 12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Glaucomatous RGC soma e degeneração axon em SOHU. (A) Painel superior retrata a região periférica mostrando RGCs (RBPMS +, vermelho) em 8 semanas após a injeção de SO de retinas montadas inteiras. Barra de escala = 20 μm. Painel inferior retrata imagens semifinas de seções transversais do ON manchadas com PPD em 8 semanas após a injeção de SO. Barra de escala = 10 μm. (B) Dados de quantificação de RGCs sobreviventes na retina periférica (n = 12) e axônios no ON (n = 10) às 8 semanas após a injeção de SO em comparação com os olhos de controle contralateral (CL). Os dados são apresentados como meios ± S.E.M. ****: P < 0.0001; Teste de t emparelhado do estudante. RGC = célula ganglionar na retina; ON = nervo óptico. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Aqui demonstramos um procedimento simples, mas eficaz para induzir a elevação sustentada de OPP no olho do rato por injeção intracameral de SO. Este procedimento pode ser aprendido rapidamente por qualquer pessoa com experiência em microdissecção um microscópio. O principal risco potencial de falha é o vazamento de SO da incisão da córnea. No entanto, uma das vantagens do uso de SO é que, como a gota de óleo é visível e mensurável, podemos facilmente identificar camundongos que receberam gotículas pequenas demais para induzir hipertensão ocular estável logo após a injeção e excluí-las de experimentos subsequentes. Temos rotineiramente alcançado uma taxa de sucesso de 80% e excluídos cerca de 20% dos ratos devido a uma pequena gotícula SO (≤1,5 mm)13. No entanto, um cirurgião experiente que pode fazer um túnel relativamente longo (0,3 mm) dentro das camadas da córnea antes de penetrar a córnea na câmara anterior com a ponta beveled quase pode evitar qualquer vazamento SO, tornando a abertura interna do túnel da córnea muito menor do que a abertura exterior. Portanto, quase todos os camundongos foram injetados com uma gota SO maior do que 1,8 mm. Além do comprimento do túnel, alguns outros pontos críticos valem a pena enfatizar. Primeiro, é importante manter o IOP baixo no olho injetado para evitar empurrar o SO para fora da câmara anterior. Um erro comum é injetar muito Assim, o que torna o vazamento mais fácil. Limitamos o volume de SO na câmara anterior para que ele quase, mas não inteiramente, cobre a superfície da íris. O diâmetro desta gota SO é de ~2,3 a 2,4 mm. Em segundo lugar, a incisão do túnel da córnea é feita o mais próximo possível do limbus para permitir que a incisão se aproxime da íris, mas não machucá-la, para que a íris possa facilmente tomar a incisão. Em terceiro lugar, a velocidade de injeção deve ser o mais lento possível para evitar o excesso de so na câmara anterior. Em quarto lugar, a massagem da pálpebra superior após a injeção ajuda a incisão da córnea para fechar e às vezes auxilia a sinechiae anterior da íris periférica para fechar a incisão da córnea, e, portanto, para evitar vazamento de óleo.
Há um aumento no IOP apenas na parte posterior do olho, mas não na câmara anterior, tornando-se uma característica única deste modelo. O bloqueio de alunos impede o fluxo de humor aquoso para a câmara anterior e, portanto, aumenta o IOP apenas na parte posterior. A barreira física formada pelo SO junto com a íris e a lente grande do olho pode desconectar a câmara anterior do segmento posterior, que pode limitar a elevação do IOP somente no segmento posterior, onde o material aquoso se acumula. Quando a pupila do rato é maior do que a gota SO após a dilatação, as câmaras anteriores e posteriores são reconectadas, permitindo um rápido aumento de IOP na câmara anterior por inundações aquosas nela. Portanto, um tononômetro só pode detectar o aumento do OPP após a remoção do bloco pupillar, de modo que o verdadeiro OPP no segmento posterior é, sem dúvida, subestimado. Portanto, nomeamos este modelo o modelo de hipertensão ocular induzida por SO (SOHU), que reflete com mais precisão e utilidade essa característica fundamental do modelo. Seria melhor poder medir diretamente o OPP no segmento posterior, mas até agora não é possível. Esta patogênese única do modelo SOHU tem duas características vantajosas: Primeiro, os olhos experimentais têm elementos oculares claros que permitem a avaliação in vivo da função visual e morfologia e, em segundo lugar, a neurodegeneração glaucomatous grave permite que qualquer benefício de testar neuroprotectants seja detectado.
Assim, a injeção pode causar edema de córnea temporariamente e recomendamos não realizar medições de IOP muito cedo ou com muita freqüência. Nós não detectamos nenhuma inflamação na câmara anterior ou na córnea nos olhos de SOHU, embora nós encontramos dois exemplos do neovascularization da córnea nos mais de 100 ratos que recebem injeções do SO.
Porque assim causa a hipertensão ocular em pacientes humanos e em ratos, é razoável postular que este modelo conceptual novo e praticamente significativo do glaucoma pode ser adaptado para os animais maiores que são mais apropriados para aplicações pré-clínicas. A caracterização dos déficits na função neural e morfologia deste modelo certamente incentivará outros investigadores a aproveitá-lo para buscar questões importantes sobre glaucoma e, ainda mais amplamente, doenças que induzem RGC e ON Degeneração.
Em resumo, este é um modelo simples de glaucoma animal que não requer equipamentoespecial ou lesões repetidas e pode ser aplicável a outras espécies animais. Curiosamente, a elevação do IOP do modelo SOHU pode ser revertida através da remoção do óleo da câmara anterior, portanto, é útil para a triagem do tratamento neuroprotetor combinado com terapias de redução de OPP.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por nih concede EY024932, EY023295, e EY028106 para YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
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