Summary
Здесь мы представляем протокол, чтобы вызвать глазной гипертензии и глаукоматического нейродегенерации в глазах мыши путем внутрикамерной инъекции силиконового масла и процедуры для удаления силиконового масла из передней камеры, чтобы вернуть повышенное внутриглазное давление Нормальной.
Abstract
Повышенное внутриглазное давление (IOP) является хорошо документированным фактором риска развития глаукомы. Здесь мы описываем новый, эффективный метод для последовательного индуцирования стабильной высоты IOP у мышей, который имитирует послеоперационное осложнение использования силиконового масла (SO) в качестве тампонада агента в хирургии витреоретина человека. В этом протоколе, SO вводится в переднюю камеру мыши глаз, чтобы блокировать зрачок и предотвратить приток вавливый юмор. Задняя камера аккумулирует aqueous юмор и это в свою очередь увеличивает IOP заднего сегмента. Одна инъекция SO производит надежную, достаточную и стабильную высоту IOP, которая вызывает значительную глаукоматозную нейродегенерацию. Эта модель является истинным репликации вторичной глаукомы в глазной клинике. Для дальнейшей имитации клинической настройки, SO может быть удален из передней камеры, чтобы вновь открыть дренажный путь и позволить притокa вака ююмор, который сливается через трабекулярной сетки (TM) под углом передней камеры. Поскольку IOP быстро возвращается в нормальное русло, модель может быть использована для проверки влияния снижения IOP на клетки ганглия в слюне глявки. Этот метод прост, не требует специального оборудования или повторных процедур, тщательно имитирует клинические ситуации и может быть применим к различным видам животных. Тем не менее, незначительные изменения могут потребоваться.
Introduction
Прогрессивная потеря клеток ганглия сетчатки (RGCs) и их аксонов является отличительной чертой глаукомы, распространенного нейродегенеративного заболевания в сетчатке1. К 2040 году она затронет более 100 миллионовчеловек в возрасте 40-80 лет. IOP остается единственным изменяемым фактором риска в развитии и прогрессировании глаукомы. Для того, чтобы исследовать патогенез, прогрессирование и потенциальные методы лечения глаукомы, надежная, воспроизводимая и индуируемая экспериментальная глазная гипертензия/глаукома модель, которая повторяет ключевые черты человеческих пациентов является обязательным.
IOP зависит от ваковатого притока юмора в переднюю камеру из цилиарного тела в задней камере и оттока через трабекулярную сетку (ТМ) под углом передней камеры. По достижении стабильного состояния, IOP поддерживается. Когда приток превышает или меньше оттока, IOP растет или падает соответственно. Путем уменьшения водного оттока либо за счет окклюи ракурса передней камеры или путем повреждения ТМ, было установленонесколькомоделей глаукомы3,4,5,6,7,9,10. Эти модели, как правило, связаны с необратимым повреждением глазной ткани, и высокий IOP в передней камере также вызывает нежелательные осложнения, такие как отек роговицы и внутриглазного воспаления, которые делают визуализации и зрительной функции репродукции трудно выполнять и интерпретировать.
Чтобы разработать модель, которая преодолевает эти недостатки, мы сосредоточились на хорошо задокументированной вторичной глаукомы, вызванной силиконовым маслом (SO), которая происходит как послеоперационное осложнение витреоретинальной хирургии человека11,12. SO используется в качестве тампонады в операциях на стриты из-за его высокого поверхностного натяжения. Тем не менее, SO может физически окклюзии зрачка, потому что это легче, чем ваквистые и стекловидные жидкости, что предотвращает вакообразуемый поток в переднюю камеру. Обструкция причинЫ высота IOP в задней камере из-за aqueous накопления юмора. Это побудило нас разработать и охарактеризовать новую модель глазной гипертензии мыши на основе внутрикамерной инъекции SO и зрачкового блока13, с ключевыми особенностями вторичной глаукомы: эффективный зрачковый блок, значительная высота IOP, который может вернуться к нормальной после удаления SO, и глаукоматозное нейродегенерации.
Здесь мы представляем подробный протокол для SO-индуцированной глазной гипертензии в глазах мыши, в том числе SO инъекций и удаления и IOP измерения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Стэнфордского университета.
1. Индукция глазной гипертензии путем внутрикамерной инъекции SO
- Подготовьте стеклянный микропипетт для внутрикамерной инъекции SO, потянув стеклянный капилляр с помощью шкива пипетки для создания микропипетика. Вырежьте отверстие на кончике микропайпета и далее заточить кончик с микрогриндер-beveling машины, чтобы сделать 35 "40" bevel.
- Польский края скобы и удалить все мусора путем мытья водой. Автоклав микропайпет перед использованием.
- Подготовьте иглу парацентеза для входа роговицы. Для этого прикрепите иглу 32 G к шприцу 5 мл на замке Luer и закрепите его лентой. Согните наконечник иглы bevel лицом вверх на 30 ".
- Подготовка SO инжектор путем крепления и обеспечения тупой конец 18 G иглы на 10 мл шприц в первую очередь. Затем приложите пластиковую трубку с 18 G иглы на одном конце и заполнить с SO по мере необходимости через другой конец.
- Прикрепите стерилизованный микропипетик к пластиковой трубке и нажмите шприц поршень, чтобы заполнить весь микропайпет с SO.
2. Внутрикамерная инъекция SO для одного глаза
- Поместите мышь C57B6/J в индукционную камеру на 9-10 недель в индукционную камеру с 3% изофлюраном, смешанным с кислородом при 2 л/мин в течение 3 мин.
- Интраперитонеально вводят 2,2,2-трибромоэтанола при массе 0,3 мг/г.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от кетамина / ксилазина, 2,2,2-трибромотанол не вызывает очевидного расширения зрачка. - Проверьте отсутствие реакции на щепотку ног и отсутствие движения усов или хвоста, чтобы определить силу анестезии.
- Поместите мышь в боковое положение на хирургической платформе. Чтобы уменьшить его чувствительность во время процедуры, нанесите одну каплю 0,5% гидрохлорид пропаракаина к роговице перед инъекцией.
- Сделайте входный разрез с иглой 32 G парацентеза в суперовременном квадранте, около 0,5 мм от лимба.
- Туннель через слои роговицы около 0,3 мм, прежде чем прокалывая в передней камере. Будьте осторожны, чтобы не коснуться объектива или радужной оболочки глаза.
- Медленно снимите иглу, чтобы выпустить некоторый вакузный юмор (около 1 х 2 л) из передней камеры через туннель (парацентезис).
- Подождите 8 минут, чтобы еще больше уменьшить IOP. Это может быть определено путем измерения контралатерального, контрольного глаза.
- Вставьте стеклянный микропайпет, предварительно загруженный SO через туннель роговицы в переднюю камеру, с скотом, обращенным к поверхности радужной оболочки.
- Нажмите шприц поршень медленно вводить SO в передней камере, пока капля SO охватывает большую часть поверхности радужной оболочки, 2,3 -2,4 мм в диаметре.
- Оставьте микропайпет в передней камере еще на 10 с, прежде чем медленно снять ее.
- Аккуратно нажмите верхнее веко, чтобы закрыть разрез роговицы, чтобы свести к минимуму SO утечки.
- Нанесите на поверхность глаза антибиотико-мазь (бацитрацин-неомицин-полимиксин).
- На протяжении всей процедуры часто увлажняйте роговицу искусственными слезами.
- Держите мышь на грелке до полного восстановления после анестезии.
3. Удаление SO
- Подготовьте ирригационную систему.
- Приготовьте орошаемый раствор в соответствии с инструкциями производителя и поместите его в орошаемую бутылку. Поднимите бутылку раствора орошения до 110-120 см (81-88 мм рт. ст.) над хирургической платформой.
- Прикрепите IV-администрацию, установленную на бутылку раствора для орошения. Удалите пузырьки воздуха из IV трубки. Соедините 33 G иглы согнуты до 20 "лицом до IV труб.
- Чтобы подготовить дренажную систему, снимите поршень из шприца 1 мл. Прикрепите иглу 33 G к шприцу и согните иглу до 20 градусов.
- Удалить SO из передней камеры.
- Интраперитонатически вводят 2,2,2-трибромоэтанола (0,3 мг/г массы тела). Проверьте отсутствие реакции на щепотку ног, чтобы определить силу анестезии и отсутствие движения усов или хвоста.
- Поместите мышь на хирургической платформе и закрепите ее в боковом положении с помощью ленты. Нанесите одну каплю 0,5% пропаракаина гидрохлорид на роговицу, чтобы уменьшить его чувствительность.
- Сделайте два разреза в височном квадранте роговицы между 2 и 5 часами на краю капли SO, используя готовую иглу 32 G парацентеза.
- Вставьте иглу 33 G, подключенную к орошаемому раствору через один разрез роговицы, максимальную скорость.
- Вставьте еще 33 G дренажной иглы прилагается к шприцу без поршение через другой разрез роговицы, чтобы позволить SO капли, чтобы выйти из передней камеры при орошении с орошаемым раствором.
- Снимите дренажную иглу, затем ирригационную иглу.
- Введите пузырь воздуха в переднюю камеру, чтобы сохранить свою нормальную глубину и нажмите, чтобы закрыть разрез роговицы.
- Нанесите антибиотикмазину на оба глаза.
- Держите мышь на грелке восстановления площадку до полного восстановления после анестезии.
4. Измерение IOP раз в неделю
- Поместите мышь в индукционную камеру, проникнутую 3% изофлураном, смешанным с кислородом при 2Л/мин в течение 3 мин.
- Интраперитонеально вводят ксилазин и кетамин (0,01 мг ксилазин/г, 0,08 мг кетамина/г).
- Держите роговицу влажной, применяя искусственные слезы на протяжении всей процедуры.
- Подождите около 15 минут, чтобы позволить ученику полностью расползаться.
- Измерьте IOP обоих глаз с помощью тонометра в соответствии с инструкциями по продукту. Принесите тонометр возле глаза мыши. Держите расстояние от кончика зонда до роговицы мыши на уровне около 3-4 мм. Нажмите на измерительную кнопку 6x, чтобы создать одно чтение. Три машинных показания получены от каждого глаза, чтобы приобрести среднее IOP.
- Пожертвуйте животными в 8 недель после инъекции SO и выполняют иммуногистохимию цельномонтажной сетчатки, подсчет RGC, оптоволоконный нерв (ON) полутонкие секции, а также количественную оценку сохранившихся аксонов, которые были описаны до13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Вскоре после инъекции мы можем легко определить мышей, которые не производят стабильную глазную гипертензию из-за SO капель слишком мала (1,5 мм)13. Эти животные исключены из последующих экспериментов. После процедур инъекций, более 80% SO вводили мышей в конечном итоге с каплями больше, чем 1,6 мм. Мы измерили IOP этих мышей глаза один раз в неделю в течение 8 недель после одного SO инъекции. IOP глаза, получающие SO остается высоким, как правило, в два раза IOP контралатерального контроля глаза, что свидетельствует об эффективной блокировки зрачка (Рисунок 1). Отек в роговице мыши можно проверить под легким микроскопом вскрытия после внутрикамерной инъекции, которая обычно занимает 2-3 дня для восстановления. Расширение зрачка занимает время, и нужно дождаться расширения зрачка, прежде чем принимать измерения IOP. Таким образом, мы стараемся не измерять IOP слишком скоро после инъекции. По этой же причине мы не рекомендуем измерять IOP слишком часто. С другой группой мышей, мы промыли SO из передней камеры 2 недели после инъекции SO, и мы ждали еще неделю, чтобы роговица, чтобы восстановить сядо как измерять IOP, который stably вернулся IOP в нормальное русло (Рисунок 1).
Для определения влияния глазной гипертензии, вызванной инъекцией SO на RGCs, мы количественно выживших RGC somata в периферических областях глаза бритвы по RBPMS окрашивания14,15 и выживших аксонов в ON полутонких поперечных сечениях PPD окрашивания16 на 8 недель после инъекции SO. Глаукоматозные смерти RGC и аксон дегенерации были драматические в SO-индуцированной глазной гипертензии недостаточно обнаруженных глаз (SOHU) (Рисунок 2). Более подробная информация об этом представлена в разделе обсуждения.
Рисунок 1: Измерения IOP в SO глазах и контралатеральных контрольных глазах, с удалением SO или без него. SO - SO вводили глаза; CL - контрлатеральные контрольные глаза. Данные представлены в качестве средств s.E.M, n No 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Глаукоматозная сома RGC и аксон дегенерация в SOHU. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Шкала бар 20 мкм. Нижняя панель изображает полутонкие изображения поперечных сечений ON окрашенных PPD на 8 недель после инъекции SO. Шкала бар No 10 мкм. (B) Количественные данные выживших RGCs в периферической сетчатке (n No 12) и аксонов в ON (n No 10) в 8 недель после инъекции SO по сравнению с контралатеральным контролем (CL) глаза. Данные представлены в качестве средств : S.E.M. (S.E.M.) : P slt; 0.0001; Студенческий парный тест. RGC - клетка ганглия для стинальной клетки; ON й зрительный нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем простую, но эффективную процедуру индуцирования устойчивого подъема IOP в глазах мыши путем внутрикамерной инъекции SO. Эту процедуру быстро может узнать любой человек с опытом работы в области микродиссекции под микроскопом. Основным потенциальным риском отказа является утечка SO из разреза роговицы. Однако, одно из преимуществ использования SO является то, что, поскольку капли масла видны и измеримы, мы можем легко определить мышей, которые получили капли слишком малы, чтобы вызвать стабильную глазную гипертензию вскоре после инъекции и исключить их из последующих экспериментов. Мы регулярно достигли 80% успеха и исключили около 20% мышей из-за небольшой капли SO (1,5 мм)13. Тем не менее, опытный хирург, который может сделать относительно длинный туннель (0,3 мм) в слоях роговицы, прежде чем проникать в переднюю камеру с скошенным кончиком может почти предотвратить любую утечку SO, сделав внутреннее отверстие роговицы туннель гораздо меньше, чем внешнее отверстие. Таким образом, почти все мыши были введены с SO капли больше, чем 1,8 мм. Помимо длины туннеля, следует подчеркнуть и некоторые другие критические моменты. Во-первых, важно держать IOP низким в впрыскиваемом глазе, чтобы избежать нажатия SO из передней камеры. Одна из распространенных ошибок заключается в том, чтобы ввести слишком много SO, что делает утечку легче. Мы ограничиваем объем SO в передней камере так, чтобы он почти, но не полностью, покрывал поверхность радужной оболочки. Диаметр этой капли SO составляет 2,3-2,4 мм. Во-вторых, разрез туннеля роговицы делается как можно ближе к лимбу, чтобы разрез, чтобы получить близко к радужной оболочке, но не повредить его, так что радужная оболочка может легко принять разрез. В-третьих, скорость впрыска должна быть как можно медленнее, чтобы избежать чрезмерного переполнения SO в переднюю камеру. В-четвертых, верхний массаж век после инъекции помогает разрез роговицы, чтобы закрыть, а иногда и помогает передней синехи периферии периферии, чтобы закрыть разрез роговицы, и, следовательно, чтобы избежать утечки масла.
Существует увеличение IOP только в задней части глаза, но не в передней камере, что делает его уникальной особенностью этой модели. Блокирование ученика предотвращает ваканый юмор в переднюю камеру и, следовательно, увеличивает IOP только в задней части. Физический барьер, образованный SO вместе с радужной оболочкой глаза и большой хрусталик глаза может отключить переднюю камеру от заднего сегмента, который может ограничить высоту IOP только в задней части, где aqueous материал накапливается. Когда ученик мыши больше, чем капля SO после расширения, передние и задние камеры воссоединяются, что позволяет быстро увеличить IOP в передней камере путем вакантного затопления в нее. Таким образом, тонометр может обнаружить повышенный IOP только после удаления зрачкового блока, так что истинный IOP в задней части, несомненно, недооценивается. Поэтому мы назвали эту модель SO-индуцированной глазной гипертензией недостаточно обнаруженной модели (SOHU), которая более точно и с пользой отражает эту ключевую особенность модели. Было бы лучше, чтобы иметь возможность измерить IOP в задней сегменте непосредственно, но до сих пор это невозможно. Этот уникальный патогенез модели SOHU имеет две выгодные характеристики: во-первых, экспериментальные глаза имеют четкие глазные элементы, которые позволяют in vivo оценить зрительную функцию и морфологию, а во-вторых, тяжелые глаукоматозные нейродегенерации позволяет обнаружить любую пользу тестирования нейропротектор.
SO инъекции могут вызвать отек роговицы временно, и мы рекомендуем не выполнять измерения IOP слишком рано или слишком часто. Мы не обнаружили никакого воспаления в передней камере или роговицы в глазах SOHU, хотя мы столкнулись с двумя случаями неоваскуляризации роговицы у более чем 100 мышей, получающих инъекции SO.
Потому что SO вызывает глазной гипертензии у пациентов и мышей, разумно постулировать, что это концептуально новый и практически значительные модели глаукомы могут быть адаптированы для крупных животных, которые больше подходят для доклинических приложений. Характеристика дефицита нервной функции и морфологии этой модели, безусловно, будет стимулировать других исследователей, чтобы воспользоваться его, чтобы продолжить важные вопросы, касающиеся глаукомы и, что еще более широко, заболеваний, которые вызывают RGC и ON Дегенерации.
Таким образом, это простая модель глаукомы животных, которая не требует специального оборудования или повторных травм и может быть применима к другим видам животных. Intriguingly, высота IOP модели SOHU может быть обращена вспять путем удаления масла из передней камеры, таким образом, это полезно для скрининга нейропротекторного лечения в сочетании с IOP снижение терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается NIH гранты EY024932, EY023295, и EY028106 в YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
References
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
