Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att inducera okulär hypertension och glaukomatös neurodegeneration i mus ögon genom intracameral injektion av silikon olja och förfarandet för silikon olja bort från den främre kammaren för att returnera förhöjt intraokulärt tryck för att Normal.
Abstract
Förhöjt intraokulärt tryck (IOP) är en väldokumenterad riskfaktor för glaukom. Här beskriver vi en ny, effektiv metod för att konsekvent inducera stabil IOP-förhöjning hos möss som efterliknar den postoperativa komplikationen med att använda silikon olja (so) som en hjärttamponad-agent i human vitreoretinal kirurgi. I detta protokoll, så injiceras i den främre kammaren av musen öga för att blockera eleven och förhindra inflöde av kammarvatten. Den bakre kammaren ackumulerar kammarvatten och detta i sin tur ökar IOP av den bakre segmentet. En enda så injektion ger tillförlitlig, tillräcklig, och stabil IOP höjd, som inducerar betydande glaukomatös neurodegeneration. Denna modell är en sann replikat av sekundär glaukom i ögat kliniken. För att ytterligare efterlikna den kliniska inställningen, så kan avlägsnas från den främre kammaren för att återuppta dränering vägen och tillåta inflöde av kammarvatten, som dräneras genom trabekelverket (TM) vid vinkeln på den främre kammaren. Eftersom IOP snabbt återgår till det normala, modellen kan användas för att testa effekten av att sänka IOP på glaukomatösa retinala ganglionceller. Denna metod är enkel, kräver inte särskild utrustning eller upprepa förfaranden, nära simulerar kliniska situationer, och kan tillämpas på olika djurarter. Mindre ändringar kan dock krävas.
Introduction
Den progressiva förlusten av retinala ganglionceller (RGCs) och deras axoner är kännetecknande för glaukom, en vanlig neurodegenerativ sjukdom i näthinnan1. Det kommer att påverka mer än 100 000 000 individer 40 − 80 år gamla av 20402. IOP förblir den enda modifierbara riskfaktorn i utvecklingen och progression av glaukom. För att utforska patogenesen, progression, och potentiella behandlingar av glaukom, en tillförlitlig, reproducerbara, och inducerbara experimentell okulär hypertension/glaukom modell som replikerar viktiga funktioner hos mänskliga patienter är absolut nödvändigt.
IOP beror på kammarvatten tillströmning till den främre kammaren från ciliär kroppen i den bakre kammaren och utflöde genom trabekelverket (TM) vid vinkeln på den främre kammaren. Vid uppnående av steady-state bibehålls IOP. När inflödet överskrider eller är mindre än utflödet, stiger eller sjunker IOP respektive. Genom att minska vattenflödet antingen genom att ockludera vinkeln på den främre kammaren eller genom att skada TM, har flera glaukom modeller fastställts3,4,5,6,7,8,9,10. Dessa modeller är normalt förknippas med oåterkalleliga ögonvävnad skador, och den höga IOP i den främre kammaren orsakar också oönskade komplikationer såsom korneal ödem och intraokulär inflammation, som gör retinal Imaging och visuell funktion analyser svårt att utföra och tolka.
För att utveckla en modell som övervinner dessa brister, fokuserade vi på den väl sudokumenterade sekundära glaukom orsakad av silikon olja (så) som uppstår som en postoperativ komplikation av mänskliga vitreoretinal kirurgi11,12. SÅ används som en tamponad i retinal operationer på grund av dess höga ytspänning. Emellertid, så kan fysiskt ockludera eleven eftersom det är lättare än vatten-och glaskroppen vätskor, som förhindrar vattenhaltiga flödet i den främre kammaren. Hindret orsakar IOP höjd i den bakre kammaren på grund av kammarvattnet ansamling. Detta motiverade oss att utveckla och karakterisera en ny okulär hypertoni musmodell baserat på intracameral så injektion och pupill block13, med viktiga funktioner i den sekundära glaukom: effektiv pupill block, betydande IOP höjd som kan återgå till det normala efter så avlägsnande, och glaukomatös neurodegeneration.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för så inducerad okulär hypertension i mus ögat, inklusive så injektion och avlägsnande och IOP mätning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid Stanford University.
1. okulär hypertension induktion genom intracameral injektion av SO
- Förbered en glasmikropipett för intracameral så injektion genom att dra ett glas kapillär med pipett avdragare för att generera en mikropipett. Skär en öppning på spetsen av micropipetten och ytterligare skärpa spetsen med en microgrinder-avfasning maskin för att göra en 35 ° − 40 ° avfasa.
- Polera kanterna av avfasningen och ta bort allt skräp genom att tvätta med vatten. Autoklav mikropipetten före användning.
- Förbered paracentes nål för hornhinnan posten. För att göra detta, bifoga en 32 G nål till en 5 mL spruta på ett Luer lås, och ytterligare säkra den med tejp. Böj nålfasspetsen uppåt vid 30 °.
- Förbered så injektorn genom att fästa och säkra en trubbig ände 18 G nål på en 10 mL spruta först. Fäst sedan ett plaströr med 18 G nål i ena änden och fyll upp med så som behövs genom den andra änden.
- Fäst den steriliserade mikropipetten i plaströr och tryck in sprutkolven för att fylla hela mikropipetten med så.
2. intracameral så injektion för ett öga
- Placera en 9 − 10-veckors gammal hane C57B6/J-mus i en induktions kammare med 3% isofluran blandat med syre vid 2 L/min under 3 min.
- Intraperitonealt injicera 2, 2, 2-tribromoethanol vid 0,3 mg/g kroppsvikt.
Anmärkning: till skillnad från ketamin/xylazin, 2, 2, 2-tribromoethanol orsakar inte uppenbara elev dilatation. - Kontrollera om bristen på svar på en tå nypa och avsaknaden av förflyttning av morrare eller svansen för att bestämma anestesi styrka.
- Placera musen i en lateral position på en kirurgi plattform. För att minska dess känslighet under förfarandet, applicera en droppe av 0,5% proparacaine hydroklorid till hornhinnan före injektionen.
- Gör en Entry snitt med 32 G paracentes nål vid superotemporal kvadrant, ca 0,5 mm från limbus.
- Tunnel genom lagren av hornhinnan för ca 0,3 mm innan piercing i den främre kammaren. Var försiktig så att du inte vidrör linsen eller iris.
- Dra ut nålen långsamt att släppa några kammarvatten (ca 1 − 2 μL) från den främre kammaren genom tunneln (paracentes).
- Vänta ~ 8 min för att ytterligare minska IOP. Detta kan bestämmas genom att mäta kontralaterala, kontroll ögat.
- Sätt i glaset micropipett förladdad med så genom hornhinnan tunneln i den främre kammaren, med avfasning vänd nedåt till Iris yta.
- Skjut in sprutkolven långsamt för att injicera så i den främre kammaren tills den så att dropp locket täcker det mesta av irisytan, ~ 2,3 − 2,4 mm i diameter.
- Lämna mikropipetten i den främre kammaren för 10 s mer innan du drar ut den långsamt.
- Tryck försiktigt övre ögonlocket för att stänga hornhinnan snittet för att minimera så läckage.
- Applicera antibiotikum salva (bacitracin-neomycin-polymyxin) till ögats yta.
- Under hela förfarandet, ofta Fukta hornhinnan med konstgjorda tårar.
- Håll musen på värmeplattan tills helt återhämtat sig från anestesi.
3. så avlägsnande
- Förbered bevattningssystemet.
- Förbered bevattnings lösningen enligt tillverkarens anvisningar och placera den i bevattnings flaskan. Höj bevattnings lösningens flaska till 110 − 120 cm (81 − 88 mmHg) ovanför Operations plattformen.
- Fäst en IV-administrationsinställd på bevattnings lösningens flaska. Avlägsna luftbubblor från dropp slangen. Anslut en 33 G nål böjd till 20 ° vänd upp till IV slangen.
- För att förbereda dräneringssystemet, ta bort kolven från en 1 mL spruta. Fäst en 33 G nål i sprutan och böj nålen till 20 °.
- Ta bort så från den främre kammaren.
- Intraperitonealt injicera 2, 2, 2-tribromöthanol (0,3 mg/g kroppsvikt). Kontrollera om bristen på svar på tå nypa för att bestämma anestesi styrka och avsaknaden av förflyttning av morrpiskare eller svansen.
- Placera musen på en kirurgi plattform och säkra den i sidled position med tejp. Applicera en droppe av 0,5% proparacaine hydroklorid till hornhinnan för att minska dess känslighet.
- Gör två snitt i den temporala kvadranten av hornhinnan mellan ~ 2 och 5 klockan vid kanten av så dropp med premade 32 G paracentes nål.
- Sätt i en 33 G bevattning nål ansluten till bevattnings lösning genom en korneal snitt, maximal hastighet.
- Sätt i en annan 33 G dränering nål fäst på sprutan utan en kolv genom den andra hornhinnan snitt för att låta så dropp att lämna den främre kammaren medan bevattning med bevattnings lösning.
- Dra ut dräneringskanylen, sedan bevattning nål.
- Injicera en luftbubbla i den främre kammaren för att bibehålla sitt normala djup och tryck för att stänga hornhinnan snittet.
- Applicera antibiotika salva på båda ögonen.
- Håll musen på värme återställnings plattan tills helt återhämtat sig från anestesi.
4. IOP-mätning en gång i veckan
- Placera musen i en induktions kammare parfymera med 3% isofluran blandat med syre vid 2L/min i 3 min.
- Intraperitonealt injicera xylazin och ketamin (0,01 mg xylazin/g, 0,08 mg ketamin/g).
- Håll hornhinnan fuktig genom att tillämpa konstgjorda tårar under hela proceduren.
- Vänta ca 15 min för att låta eleven till fullo vidga.
- Mät IOP för båda ögonen med hjälp av en tonometern enligt produktens anvisningar. Ta tonometern nära mus ögat. Håll avståndet från spetsen av sonden till musen hornhinnan på ca 3 − 4 mm. Tryck på mätknappen 6x för att generera en avläsning. Tre maskingenererade avläsningar erhålls från varje öga för att förvärva medelvärdet av IOP.
- Offra djuren vid 8 veckor efter så injektion och utföra immunohistokemi av hela berget näthinnan, RGC räkna, optisk nerv (på) semi-tunna sektioner, och kvantifiering av överlevande axoner, som har beskrivits före13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strax efter injektionen kan vi lätt identifiera möss som inte producerar stabil okulär hypertension på grund av att dropparna är för små (≤ 1,5 mm)13. Dessa djur är undantagna från efterföljande experiment. Efter injektionsproceduren hamnar mer än 80% av så injicerade möss med droppar som är större än 1,6 mm. Vi mätt IOP av dessa mus ögon en gång i veckan för 8 veckor efter en enda så injektion. Den IOP av ögat emot så förblev hög, i allmänhet dubbla IOP av kontralaterala kontroll ögat, vilket indikerar effektiv elev blockering (figur 1). Ödem i mus hornhinnan kan kontrolleras under en ljus dissektion Mikroskop efter en intracameral injektion som normalt tar 2 − 3 dagar för återhämtning. Elev dilatation tar tid, och man måste vänta på elev dilatation innan du tar IOP mätningen. Därför försöker vi inte mäta IOP för tidigt efter en injektion. Av samma anledning rekommenderar vi inte att mäta IOP alltför ofta. Med en annan grupp av möss, spolas vi ut så från den främre kammaren 2 veckor efter så injektion, och vi väntade på en vecka för att låta hornhinnan att återhämta sig innan du mäter IOP, som stabilt återvände IOP till det normala (figur 1).
För att bestämma effekterna av okulär hypertension induceras av så injektion på rgcs, kvantifierades de överlevande RGC Somata i perifera regioner av näthinnans wholemounts av rbpms färgning14,15 och de överlevande axoner i på semithin tvärsnitt av PPD färgning16 vid 8 veckor efter så injektion. Glaukomatös RGC död och Axon degeneration var dramatiska i så inducerad okulär hypertension under-upptäckta ögon (SOHU) (figur 2). Mer information om detta finns i diskussionsavsnittet.
Figur 1: IOP mätningar i så ögon och kontralaterala kontroll ögon, med eller utan så avlägsnande. SÅ = så injicerade ögon; CL = kontralaterala kontroll ögon. Data presenteras som medel ± S. E. M, n = 12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: glaukomatös RGC Soma och Axon degeneration i Sohu. (a) övre panelen skildrar perifera regionen visar rgcs (rbpms +, röd) vid 8 veckor efter så injektion av helmonterade retinas. Skalstapel = 20 μm. den nedre panelen visar halv tunna bilder av tvärsnitt av den färgade med PPD vid 8 veckor efter injektion. Skalstapel = 10 μm. (B) kvantifieringsdata för överlevande rgcs i den perifera näthinnan (n = 12) och AXONER i on (n = 10) vid 8 veckor efter injektion jämfört med kontralaterala kontroll (cl) ögon. Data presenteras som medel ± S.E.M. * * * *: P < 0,0001; Elevens parade t-test. RGC = retinala ganglionceller; PÅ = synnerven. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi ett enkelt men effektivt förfarande för att inducera ihållande IOP förhöjning i mus ögat genom intracameral injektion av SO. Denna procedur kan läras snabbt av alla som har erfarenhet av microdissection under ett mikroskop. Den primära potentiella risken för misslyckande är läckage av så från hornhinnan snittet. Men en av fördelarna med att använda så är att eftersom oljedropparna är synlig och mätbara, kan vi enkelt identifiera möss som fick droppar för liten för att inducera stabil okulär hypertoni strax efter injektion och utesluta dem från efterföljande experiment. Vi har rutinmässigt uppnått en 80% framgång och exkluderat cirka 20% av möss på grund av en liten så DROPP (≤ 1,5 mm)13. Men en erfaren kirurg som kan göra en relativt lång tunnel (0,3 mm) inom lagren av hornhinnan innan penetrerande hornhinnan i den främre kammaren med den avfasade spetsen kan nästan förhindra någon så läckage genom att göra den inre öppningen av hornhinnans tunneln mycket mindre än den yttre öppningen. Därför injicerades nästan alla möss med en så liten droppe som var större än 1,8 mm. Förutom tunnelns längd är några andra kritiska punkter värda att betona. Först, det är viktigt att hålla IOP låg i det injicerade ögat för att undvika att skjuta så ut ur den främre kammaren. Ett vanligt misstag är att injicera för mycket så, vilket underlättar läckage. Vi begränsar volymen av så i den främre kammaren så att den nästan, men inte helt, täcker irisytan. Diametern på denna så dropp är ~ 2.3 − 2.4 mm. För det andra är hornhinnan tunnel snitt görs så nära som möjligt till limbus att tillåta snittet för att komma nära Iris men inte skada den, så att Iris lätt kan ta snittet. För det tredje bör insprutnings hastigheten vara så långsam som möjligt för att undvika överdriven spill av så i den främre kammaren. För det fjärde, den övre ögonlocket massage efter injektionen hjälper hornhinnan snittet att stänga och ibland bistår främre synechiae av perifera Iris att stänga hornhinnan snittet, och därför för att undvika oljeläckage.
Det finns en ökning i IOP endast i den bakre delen av ögat, men inte i den främre kammaren, vilket gör det till ett unikt inslag i denna modell. Elev blockering förhindrar kammarvatten inflöde i den främre kammaren och ökar därför IOP endast i den bakre delen. Den fysiska barriären som bildas av så tillsammans med Iris och stora ögat linsen kan koppla den främre kammaren från det bakre segmentet, som kan begränsa IOP höjd endast i det bakre segmentet, där vatten materialet ackumuleras. När musen eleven är större än så dropp efter dilatation, främre och bakre kamrarna återansluts, vilket gör att en snabb ökning av IOP i den främre kammaren genom vattenhaltiga översvämningar i den. Därför kan en tonometern bara upptäcka den ökade IOP efter avlägsnande av pupill blocket, så den sanna IOP i det bakre segmentet är utan tvekan underskattas. Därför, vi heter denna modell den så inducerade okulär hypertoni under-detekterad modell (SOHU), som mer exakt och med fördel återspeglar denna viktiga funktion i modellen. Det skulle vara bäst att kunna mäta IOP i det bakre segmentet direkt, men hittills är det inte möjligt. Denna unika patogenes av SOHU modellen har två fördelaktiga egenskaper: för det första, de experimentella ögon har tydliga okulära element som möjliggör in vivo bedömning av visuell funktion och morfologi och andra, den allvarliga glaukomatös neurodegeneration gör att alla fördelar med att testa och upptäcks.
SÅ injektion kan orsaka korneal ödem tillfälligt och vi rekommenderar att inte utföra IOP mätningar för tidigt eller för ofta. Vi har inte upptäcka någon inflammation i den främre kammaren eller hornhinnan i SOHU ögon, även om vi stött på två fall av hornhinnan kärlnybildning i mer än 100 möss som får så injektioner.
Eftersom så orsakar okulär hypertension hos både mänskliga patienter och möss, det är rimligt att postulera att denna begreppsmässigt roman och praktiskt taget signifikant glaukom modell kan anpassas för större djur som är mer lämpade för prekliniska tillämpningar. Karakteriseringen av underskotten i neural funktion och morfologi av denna modell kommer säkerligen att uppmuntra andra utredare att dra nytta av det för att fullfölja viktiga frågor om glaukom och, ännu mer allmänt, sjukdomar som inducerar RGC och på Degeneration.
Sammanfattnings, detta är en enkel djurglaukom modell som inte kräver särskild utrustning eller upprepa skador och kan tillämpas på andra djurarter. Spännande, den IOP förhöjning av SOHU modellen kan vändas genom att ta bort oljan från den främre kammaren, därför är det användbart för screening av nervskyddande behandling i kombination med IOP sänka terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH Grants EY024932, EY023295, och EY028106 till YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
References
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
