Summary
Her præsenterer vi en protokol til at inducere okulær hypertension og og neurodegeneration i muse øjne ved intracameral injektion af silikoneolie og proceduren for fjernelse af silikoneolie fra det forreste kammer for at returnere forhøjet intraokulært tryk til Normal.
Abstract
Forhøjet intraokulært tryk (IOP) er en veldokumenteret risikofaktor for glaukom. Her beskriver vi en roman, effektiv metode til konsekvent inducerende stabil IOP elevation i mus, der efterligner postoperative komplikation ved at bruge silikoneolie (så) som en tamponade agent i menneskelig vitreoretinal kirurgi. I denne protokol, så injiceres i det forreste kammer af muse øjet for at blokere eleven og forhindre tilstrømning af vandig humor. Det bageste kammer akkumulerer vandig humor, og dette øger igen IOP af det bageste segment. En enkelt so injektion producerer pålidelig, tilstrækkelig og stabil IOP elevation, som inducerer signifikant og neurodegeneration. Denne model er en sand replikat af sekundær glaukom i Øjenklinikken. For yderligere at efterligne den kliniske indstilling, så kan fjernes fra det forreste kammer for at genåbne afløbs vejen og tillade tilstrømning af vandig humor, som er drænet gennem trabekulær meshwork (TM) i vinklen af det forreste kammer. Fordi IOP hurtigt vender tilbage til normal, kan modellen bruges til at teste effekten af sænkning af IOP på og retinale ganglion celler. Denne metode er ligetil, kræver ikke særligt udstyr eller gentagne procedurer, nøje simulerer kliniske situationer, og kan gælde for forskellige dyrearter. Der kan dog være behov for mindre ændringer.
Introduction
Det progressive tab af retinale ganglion celler (Rgc'er) og deres axoner er kendetegnende for glaukom, en fælles neurodegenerative sygdom i nethinden1. Det vil påvirke mere end 100.000.000 personer 40 − 80 år gammel af 20402. IOP er den eneste modificerbare risikofaktor i udviklingen og progressionen af glaukom. For at udforske patogenesen, progression, og potentielle behandlinger af glaukom, en pålidelig, reproducerbar, og inducerbar eksperimentel hypertension/glaukom model, der replikater centrale elementer af humane patienter er bydende nødvendigt.
IOP afhænger af vandig humor tilstrømningen til det forreste kammer fra det ciliære legeme i det bageste kammer og udstrømning gennem trabekulær meshwork (TM) i vinklen af det forreste kammer. Når en steady state er nået, opretholdes IOP. Når tilstrømning overstiger eller er mindre end udstrømningen, IOP stiger eller falder hhv. Ved at nedsætte den vandige udstrømning enten ved at vælge vinklen på det forreste kammer eller ved at beskadige TM, er der etableret flere glaukom-modeller3,4,5,6,7,8,9,10. Disse modeller er normalt forbundet med irreversibelt okulær vævsskade, og den høje IOP i det forreste kammer forårsager også uønskede komplikationer såsom hornhinde ødem og intraokulær inflammation, som gør nethinde dannelse og visuelle funktionsanalyser svære at udføre og fortolke.
For at udvikle en model, der overvinder disse mangler, fokuserede vi på den godt sudocumented sekundær glaukom forårsaget af silikoneolie (så), der opstår som en postoperative komplikation af humane vitreoretinal kirurgi11,12. SÅ bruges som en tamponade i retinale operationer på grund af sin høje overflade spændinger. Men, så kan fysisk tilflyde eleven, fordi det er lysere end de vandige og glasholdige væsker, som forhindrer vandig strømning i det forreste kammer. Forhindringen forårsager IOP elevation i det bageste kammer på grund af den vandige humor ophobning. Dette motiverede os til at udvikle og karakterisere en roman okulær hypertension musemodel baseret på intracameral så injektion og pupil blok13, med nøglefunktioner i den sekundære glaukom: effektiv pupil blok, signifikant IOP elevation, der kan vende tilbage til normal efter så fjernelse, og og neurodegeneration.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for så-induceret okulær hypertension i muse øjet, herunder så injektion og fjernelse og IOP måling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-anvendelse (IACUC) på Stanford University.
1. induktion af okulær hypertension ved intracameral injektion af SO
- Forbered en glas mikropipette til intracameral så injektion ved at trække et glas kapillær med en pipette aftrækker for at generere en mikropipette. Skær en åbning på spidsen af mikropipetten og yderligere skærpe spidsen med en Micro Grinder-beveling maskine til at lave en 35 ° − 40 ° facet.
- Polere kanterne af facet og fjerne alt snavs ved vask med vand. Autoklave mikropipetten før brug.
- Forbered paracentese-nålen til cornea-indgangen. For at gøre dette, vedhæfte en 32 G nål til en 5 mL sprøjte på en luer lås, og yderligere sikre det med tape. Bøj nålens facet spids opad ved 30 °.
- Forbered så injektoren ved at montere og sikre en stump ende 18 G nål på en 10 mL sprøjte først. Derefter monteres en plastikslange med 18 G nål i den ene ende og fyldes op med så efter behov gennem den anden ende.
- Fastgør den steriliserede mikropipette til plastik røret og skub sprøjtestemplet for at fylde hele mikropipetten med SO.
2. intracameral så injektion for det ene øje
- Placer en 9 − 10-ugers gammel mandlig C57B6/J-mus i et induktions kammer med 3% isofluran blandet med ilt ved 2 L/min i 3 min.
- Intraperitonealt injicerer 2, 2, 2-tribromoethanol ved 0,3 mg/g legemsvægt.
Bemærk: i modsætning til ketamin/xylazin, 2, 2, 2-tribromoethanol ikke forårsager indlysende pupil dilatation. - Check for den manglende reaktion på en tå knivspids og manglende bevægelse af whiskers eller halen til at bestemme bedøvelses styrke.
- Placer musen i en lateral position på en kirurgi platform. For at reducere følsomheden under proceduren, påføres en dråbe på 0,5% proparacainhydrochlorid til hornhinden før injektionen.
- Lav en indgang indsnit med 32 G paracentese nål på superotemporal kvadrant, omkring 0,5 mm fra limbus.
- Tunnel gennem lag af hornhinden for omkring 0,3 mm før piercing i den forreste kammer. Pas på ikke at røre ved linsen eller iris.
- Træk nålen langsomt ud for at frigive noget vandig humor (ca. 1 − 2 μL) fra det forreste kammer gennem tunnelen (paracentesis).
- Vent ~ 8 min for yderligere at reducere IOP. Dette kan bestemmes ved at måle den kontralaterale, kontrol øjet.
- Sæt glas mikropipetten forudindlæst med så gennem cornea-tunnelen i det forreste kammer, med facet vendt ned til iris overfladen.
- Skub sprøjtens stempel langsomt for at injicere så ind i det forreste kammer, indtil den så dråbe dækker det meste af iris overfladen, ~ 2,3 − 2,4 mm i diameter.
- Efterlad mikropipetten i det forreste kammer i 10 s mere, før du trækker den langsomt ud.
- Skub forsigtigt det øvre øjenlåg for at lukke cornea indsnit for at minimere lækage.
- Påfør antibiotika salve (bacitracin-neomycin-polymyxin) til øjets overflade.
- Under hele proceduren, ofte fugte hornhinden med kunstige tårer.
- Hold musen på varmepuden indtil fuldt genvundet fra anæstesi.
3. så fjernelse
- Forbered vandingssystemet.
- Klargør vandings opløsningen i henhold til producentens anvisninger, og anbring den i vandings flasken. Løft den vandende opløsningens flaske op til 110 − 120 cm (81 − 88 mmHg) over Operations platformen.
- Fastgør en I.V.-administration til den vandvandings opløsningens flaske. Fjern luftbobler fra IV slangen. Forbind en 33 G nål bøjet til 20 ° med forsiden opad til IV slangen.
- Fjern stemplet fra en 1 mL sprøjte for at forberede afløbssystemet. Fastgør en 33 G nål til sprøjten og bøj nålen til 20 °.
- Fjern det fra det forreste kammer.
- Intraperitonealt injicerer 2, 2, 2-tribromoethanol (0,3 mg/g legemsvægt). Tjek for den manglende respons på tåen knivspids for at bestemme bedøvelses styrken og den manglende bevægelse af whiskers eller halen.
- Placer musen på en kirurgi platform og fastgør den i lateral position med tape. Påfør en dråbe af 0,5% proparacainhydrochlorid til hornhinden for at reducere dens følsomhed.
- Lav to incisioner i den tidsmæssige kvadrant af hornhinden mellem ~ 2 og 5 klokken ved kanten af den så dråbe ved hjælp af premade 32 G paracentese nål.
- Indsæt en 33 G vandings kanyle forbundet til vanding løsning gennem en cornea Incision, maksimal hastighed.
- Indsæt en anden 33 G dræning nål fastgjort til sprøjten uden et stempel gennem den anden cornea indsnit at tillade så dråbe at forlade den forreste kammer mens vanding med vanding løsning.
- Træk afløbs nålen, derefter vandings nålen.
- Injicer en luftboble i det forreste kammer for at opretholde sin normale dybde og tryk for at lukke cornea-snittet.
- Påfør antibiotika salve til begge øjne.
- Hold musen på opvarmning opsving pad indtil fuldt genvundet fra anæstesi.
4. IOP-måling en gang om ugen
- Placer musen i en induktions kammer perfanvendes med 3% isofluran blandet med ilt ved 2L/min i 3 min.
- Intraperitonealt injicerer xylazin og ketamin (0,01 mg xylazin/g, 0,08 mg ketamin/g).
- Hold hornhinden fugtig ved at anvende kunstige tårer under hele proceduren.
- Vent ca. 15 minutter for at give eleven mulighed for at blive helt disent.
- Mål IOP af begge øjne ved hjælp af et tonometeret i henhold til produktets anvisninger. Placer tonometeret nær muse øjet. Hold afstanden fra spidsen af sonden til mus hornhinden på omkring 3 − 4 mm. Tryk på måleknappen 6x for at generere en aflæsning. Der opnås tre maskingenererede aflæsninger fra hvert øje for at erhverve den gennemsnitlige IOP.
- Ofrer dyrene på 8 uger efter så injektion og udføre Immunhistokemi af hele Mount Retina, RGC optælling, synsnerven (på) semi-tynde sektioner, og kvantificering af overlevende axoner, som er blevet beskrevet før13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort efter injektionen kan vi nemt identificere mus, der ikke producerer stabil okulær hypertension på grund af de så små dråber er for lille (≤ 1,5 mm)13. Disse dyr er udelukket fra efterfølgende eksperimenter. Efter injektion procedurer, mere end 80% af så injicerede mus ender med dråber større end 1,6 mm. Vi målte IOP af disse mus øjne en gang om ugen i 8 uger efter en enkelt så injektion. Den IOP af øjet, der fik så forblev høj, generelt fordoble IOP af den kontralaterale kontrol øjet, hvilket indikerer effektiv elev blokering (figur 1). Ødem i mus hornhinden kan kontrolleres under en lys dissektion mikroskop efter en intracameral injektion, der normalt tager 2 − 3 dage til nyttiggørelse. Elev dilatationen tager tid, og man skal vente på elev dilatation, før man tager IOP-målingen. Således forsøger vi ikke at måle IOP for tidligt efter en injektion. Af samme grund anbefaler vi ikke at måle IOP for ofte. Med en anden gruppe af mus, skyllet vi ud fra den forreste kammer 2 uger efter så injektion, og vi ventede i en anden uge for at tillade hornhinden at komme sig før måling IOP, som stabilt returnerede IOP til normal (figur 1).
For at bestemme virkningerne af okulær hypertension induceret ved så injektion på rgc'er, kvantificerede vi den overlevende RGC somata i de perifere områder af retinale wholemounts ved rbpms farvning14,15 og de overlevende axoner i på semi tynde tværsnit af PPD farvning16 ved 8 uger efter så injektion. Glaucomatous RGC død og Axon degeneration var dramatisk i så-induceret okulær hypertension under detekterede øjne (SOHU) (figur 2). Yderligere oplysninger om dette findes i diskussionsafsnittet.
Figur 1: IOP-målinger i så øjne og kontralaterale kontrol øjne, med eller uden så fjernelse. SÅ = så injicerede øjne; CL = kontralaterale kontrol øjne. Data præsenteres som middel ± S. E. M, n = 12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: glaucomatous RGC Soma og Axon degeneration i Sohu. (A) øvre panel skildrer den perifere region viser rgc'er (rbpms +, rød) 8 uger efter så injektion af hele monterede Retinas. Scale bar = 20 μm. nederste panel skildrer semi-tynde billeder af tværsnit af den farvede med PPD på 8 uger efter så injektion. Scale bar = 10 μm.B) kvantificerings data for overlevende Rgc'er i den perifere nethinden (n = 12) og AXONER i on (n = 10) ved 8 uger efter injektion sammenlignet med kontralaterale kontrol (CL) øjne. Data præsenteres som: ± S.E.M. * * * *: P < 0,0001; Elevens parrede t-test. RGC = retinal ganglion celle; ON = synsnerven. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en enkel, men effektiv procedure for inducerende vedvarende IOP elevation i muse øjet ved intracameral injektion af SO. Denne procedure kan læres hurtigt af alle med erfaring i microdissection under et mikroskop. Den primære potentielle risiko for fiasko er lækage af så fra cornea incision. Men en af fordelene ved at bruge så er, at fordi olien dråbe er synlig og målbar, kan vi nemt identificere mus, der har modtaget dråber for lille til at fremkalde stabil okulær hypertension kort efter injektion og udelukke dem fra efterfølgende eksperimenter. Vi har rutinemæssigt opnået en 80% succesrate og udelukket omkring 20% af mus på grund af en lille så dråbe (≤ 1,5 mm)13. Men en erfaren kirurg, der kan lave en relativt lang tunnel (0,3 mm) inden for lagene af hornhinden, før du trænger cornea ind i det forreste kammer med affedtet spids kan næsten forhindre enhver så lækage ved at gøre den indre åbning af hornhinden tunnel meget mindre end den ydre åbning. Derfor blev næsten alle musene injiceret med en så dråbe større end 1,8 mm. Ud over tunnelens længde er nogle andre kritiske punkter værd at understrege. For det første er det vigtigt at holde IOP lav i det injicerede øje for at undgå at skubbe så ud af det forreste kammer. En almindelig fejltagelse er at injicere for meget, hvilket gør lækage lettere. Vi begrænser mængden af så i den forreste kammer, så det næsten, men ikke helt, dækker iris overflade. Diameteren af dette så dråbe er ~ 2.3 − 2,4 mm. For det andet, den hornhinde tunnel indsnit er lavet så tæt som muligt på limbus at tillade indsnit at komme tæt på iris, men ikke såre det, således at iris nemt kan tage snittet. For det tredje bør Indsprøjtnings hastigheden være så langsom som muligt for at undgå overdreven overløb i det forreste kammer. For det fjerde, det øvre øjenlåg massage efter injektionen hjælper cornea indsnit til at lukke og undertiden hjælper den forreste synechiae af den perifere iris til at lukke cornea indsnit, og derfor for at undgå olielækage.
Der er en stigning i IOP kun i den bageste del af øjet, men ikke i det forreste kammer, hvilket gør det til et unikt træk ved denne model. Elev blokering forhindrer vandig humor i det forreste kammer og øger derfor kun IOP i den bageste del. Den fysiske barriere, der dannes af så sammen med iris og storøjet linse kan afbryde det forreste kammer fra det bageste segment, som kan begrænse IOP elevation kun i det bageste segment, hvor det vandige materiale ophobes. Når musen pupil er større end den så dråbe efter dilatation, de forreste og bageste kamre er tilsluttet igen, så en hurtig stigning af IOP i det forreste kammer ved vandig oversvømmelse i det. Derfor kan en tonometeret kun detektere den øgede IOP efter fjernelse af pupil blokken, så den sande IOP i det bageste segment er utvivlsomt undervurderet. Derfor, vi kaldte denne model den såkaldte okulær hypertension under detekteret model (SOHU), som mere præcist og nyttigt afspejler dette centrale element i modellen. Det ville være bedst at kunne måle IOP i det bageste segment direkte, men indtil videre er det ikke muligt. Denne unikke patogenese af SOHU-modellen har to fordelagtige egenskaber: for det første har de eksperimentelle øjne klare øjen elementer, der muliggør in vivo-vurdering af visuel funktion og morfologi, og for det andet den svære glaukomatøse neurodegeneration giver nogen fordel ved at teste neuroprotectanter, der skal påvises.
SÅ injektion kan forårsage cornea ødem midlertidigt, og vi anbefaler ikke at udføre IOP målinger for tidligt eller for ofte. Vi har ikke detektere nogen betændelse i det forreste kammer eller hornhinden i SOHU øjne, selv om vi stødte på to forekomster af cornea neovascularization i mere end 100 mus, der modtager så injektioner.
Fordi så forårsager okulær hypertension hos både humane patienter og mus, er det rimeligt at postulere, at denne konceptuelt roman og praktisk betydningsfulde glaukom model kan tilpasses til større dyr, der er mere egnet til prækliniske anvendelser. Karakteriseringen af underskuddet i neurale funktion og morfologi af denne model vil helt sikkert tilskynde andre efterforskere til at drage fordel af det til at forfølge vigtige spørgsmål vedrørende glaukom og, endnu mere bredt, sygdomme, der inducerer RGC og på Degeneration.
Sammenfattende er dette en ligetil model for dyre glaukom, som ikke kræver særligt udstyr eller gentagne skader og kan gælde for andre dyrearter. Intriguingly, IOP elevation af SOHU model kan vendes ved at fjerne olien fra den forreste kammer, derfor er det nyttigt for screening af neuroprotektive behandling kombineret med IOP sænke terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde understøttes af NIH Grants EY024932, EY023295 og EY028106 til YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
References
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
