Summary
Her presenterer vi en protokoll for å indusere øye hypertensjon og glaucomatous neurodegeneration i muse øyne ved intracameral injeksjon av silikon olje og prosedyren for silikon olje fjerning fra fremre kammer for å returnere forhøyet intraokulært Trykk for å Normal.
Abstract
Forhøyet intraokulært trykk (IOP) er en godt dokumentert risikofaktor for glaukom. Her beskriver vi en ny, effektiv metode for konsekvent å indusere stabil IOP-høyde i mus som etterligner postoperativ komplikasjon til bruk av silikon (SO) som en tamponade agent i humant vitreoretinal kirurgi. I denne protokollen, SO injiseres inn i fremre kammer av musen øyet å blokkere eleven og hindre tilsig av vandig humor. Den bakre kammer akkumuleres vandig humor og dette i sin tur øker IOP av bakre segmentet. En enkelt SO-injeksjon gir pålitelig, tilstrekkelig og stabil IOP-høyde, noe som medfører betydelige glaucomatous neurodegeneration. Denne modellen er en sann replikere av sekundær glaukom i øye klinikken. For ytterligere å etterligne den kliniske innstillingen, så kan fjernes fra fremre kammer for å gjenåpne drenerings veien og tillate tilsig av vandig humor, som er drenert gjennom trabekulær meshwork (TM) i vinkelen av fremre kammer. Fordi IOP går raskt tilbake til normal, kan modellen brukes til å teste effekten av å senke IOP på glaucomatous retinal Ganglion celler. Denne metoden er grei, krever ikke spesialutstyr eller gjenta prosedyrer, tett simulerer kliniske situasjoner, og kan være aktuelt for ulike dyrearter. Det kan imidlertid være nødvendig med mindre endringer.
Introduction
Den progressive tap av retinal Ganglion celler (RGCs) og deres axons er kjennetegn på glaukom, en vanlig nevrodegenerative sykdom i Retina1. Det vil påvirke mer enn 100 000 000 individer 40 − 80 år gammel av 20402. IOP er fortsatt den eneste risikofaktoren som påvirkes i utviklingen og utviklingen av glaukom. For å utforske den patogenesen, progresjon, og potensielle behandlinger av glaukom, en pålitelig, reproduserbar, og induserbart eksperimentell øye hypertensjon/glaukom modell som replikerer viktige funksjoner av menneskelige pasienter er avgjørende.
IOP avhenger av vandig humor tilsig til fremre kammer fra ciliary kroppen i bakre kammer og utløp gjennom trabekulær meshwork (TM) i vinkelen av fremre kammer. Når en steady state er nådd, opprettholdes IOP. Når tilsig overstiger eller er mindre enn strøm, øker IOP eller faller hhv. Ved å redusere den vandige strømmen enten ved å okkluderer vinkelen til fremre kammer eller ved å skade TM, har flere glaukom-modeller blitt etablert3,4,5,6,7,8,9,10. Disse modellene er vanligvis forbundet med irreversible øye vevsskade, og den høye IOP i fremre kammeret fører også til uønskede komplikasjoner som hornhinnen ødem og intraokulært betennelse, som gjør Retinal Imaging og visuell funksjon analyser vanskelig å utføre og tolke.
Å utvikle en modell som overvinner disse svakhetene, fokuserte vi på den sudocumented sekundære glaukom forårsaket av silikon olje (så) som oppstår som en postoperativ komplikasjon av menneskelig vitreoretinal kirurgi11,12. SO brukes som en tamponade i Netthinne operasjoner på grunn av sin høye overflatespenning. Men så kan fysisk tette eleven fordi det er lettere enn den vandige og glasslegemet væsker, som hindrer vandig strømme inn i fremre kammeret. Hindringen forårsaker IOP-høyden i bakre kammer på grunn av den vandige humor akkumulering. Dette motiverte oss til å utvikle og karakterisere en roman øye hypertensjon mus modell basert på intracameral så injeksjon og Pupillary blokk13, med viktige funksjoner i sekundær glaukom: effektiv Pupillary blokk, betydelig IOP-høyde som kan gå tilbake til normal etter so fjerning, og glaucomatous neurodegeneration.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for så-indusert øye hypertensjon i musen øyet, inkludert så injeksjon og fjerning og IOP-måling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Stanford University.
1. øye hypertensjon induksjon ved intracameral injeksjon av SO
- Forbered et glass micropipette for intracameral SO injeksjon ved å trekke en glass kapillær med en pipette avtrekker å generere en micropipette. Skjær en åpning på tuppen av micropipette og gjør spissen enda skarpere med en microgrinder-beveling maskin for å lage en 35 ° − 40 ° skråkant.
- Polish kantene av skråkant og fjerne alt rusk ved å vaske med vann. Autoklav micropipette før bruk.
- Forbered paracentesis nålen for hornhinnen oppføringen. For å gjøre dette, fest en 32 G nål til en 5 mL sprøyte på en luer lås, og fest den deretter med tape. Bøy nålespissen med forsiden opp ved 30 °.
- Klargjør SO-injeksjons sprøyten ved å feste og sikre en stump ende 18 G nål på en 10 mL sprøyte først. Deretter festes et plastrør med 18 G nålen på den ene enden og fylle opp med så som nødvendig gjennom den andre enden.
- Fest de sterilisert micropipette til plastrør og skyv sprøyte stempelet for å fylle hele micropipette med SO.
2. Intracameral SO injeksjon for ett øye
- Plasser en 9 − 10-ukers-gammel mannlig C57B6/J-mus i et induksjon kammer med 3% isoflurane blandet med oksygen ved 2 L/min i 3 min.
- Intraperitonealt Injiser 2, 2, 2-tribromoethanol ved 0,3 mg/g kroppsvekt.
Merk: i motsetning til ketamin/xylazine, 2, 2, 2-tribromoethanol forårsaker ikke åpenbare elev utvidelse. - Sjekk for mangelen på respons på en tå knipe og mangelen på bevegelse av kinnskjegg eller halen for å bestemme bedøvelse styrke.
- Plasser musen i en lateral posisjon på en kirurgi plattform. For å redusere sin følsomhet under prosedyren, Påfør en dråpe 0,5% proparacaine hydrochloride til hornhinnen før injeksjon.
- Lag en oppføring snitt med 32 G paracentesis nål på superotemporal kvadrant, ca 0,5 mm fra limbus.
- Tunnel gjennom lagene av hornhinnen i ca 0,3 mm før du piercing inn i fremre kammeret. Vær forsiktig så du ikke berører linsen eller Iris.
- Trekk nålen langsomt ut for å frigi litt vandig humor (ca. 1 − 2 μL) fra fremre kammer gjennom tunnelen (paracentesis).
- Vent ~ 8 min for å redusere IOP ytterligere. Dette kan bestemmes ved å måle kontralateral, kontroll øyet.
- Sett glasset micropipette forhåndslastet med SO gjennom hornhinnen tunnelen inn i fremre kammer, med skråkant vendt ned til Iris overflaten.
- Skyv sprøytestempelet langsomt for å injisere så inn i fremre kammer til SO dråpe dekker det meste av Iris overflaten, ~ 2.3 − 2,4 mm i diameter.
- La micropipette i fremre kammer i 10 s mer før du trekker det langsomt ut.
- Trykk forsiktig på øvre øyelokk for å lukke hornhinnen snitt for å minimere SO lekkasje.
- Påfør antibiotika salve (bacitracin-Neomycin-polymyxin) til øyeoverflaten.
- Gjennom hele prosedyren, ofte fukte hornhinnen med kunstige tårer.
- Hold musen på varmeputen til helt utvinnes fra anestesi.
3. SO fjerning
- Forbered vanning systemet.
- Forbered vanner løsningen i henhold til produsentens instruksjoner og legg den i vanning flasken. Løft flasken med vanner oppløsning til 110 − 120 cm (81 − 88 mmHg) over operasjons plattformen.
- Fest et IV-Administrasjonssett til den vanner løsnings flasken. Fjern luftbobler fra IV-slangen. Koble en 33 G nål bøyd til 20 ° med forsiden opp til IV-slangen.
- For å klargjøre dreneringssystemet, Fjern stempelet fra en 1 mL sprøyte. Fest en 33 G nål til sprøyten og bøy nålen til 20 °.
- Fjern SO fra fremre kammer.
- Intraperitonealt Injiser 2, 2, 2-tribromoethanol (0,3 mg/g kroppsvekt). Sjekk for mangelen på respons på tå knipe for å bestemme anestesi styrke og mangel på bevegelse av kinnskjegg eller halen.
- Plasser musen på en operasjon plattform og sikre den i lateral posisjon med tape. Påfør en dråpe 0,5% proparacaine hydrochloride til hornhinnen for å redusere følsomheten.
- Lag to snitt i den timelige kvadrant av hornhinnen mellom ~ 2 og 5 o ' Clock på kanten av SO dråpe ved hjelp av forhåndslagde 32 G paracentesis nål.
- Sett inn en 33 G vanning nål koblet til vanner løsning gjennom en hornhinne snitt, maksimal hastighet.
- Sett inn en annen 33 G drenerings nål festet til sprøyten uten et stempel gjennom den andre hornhinnen snitt slik at SO dråpe å gå ut av fremre kammer mens vanner med vanner løsning.
- Trekk ut drenerings nålen, deretter vanning nålen.
- Injiser en luftboble i fremre kammeret for å opprettholde normal dybde og trykk for å lukke hornhinnen snittet.
- Påfør antibiotika salve på begge øyne.
- Hold musen på oppvarming gjenopprettings puten til helt utvinnes fra anestesi.
4. IOP-måling én gang i uken
- Plasser musen i en induksjon kammer perfusert med 3% isoflurane blandet med oksygen ved 2L/min for 3 min.
- Intraperitonealt injisere xylazine og ketamin (0,01 mg xylazine/g, 0,08 mg ketamin/g).
- Hold hornhinnen fuktig ved å bruke kunstige tårer gjennom hele prosedyren.
- Vent ca 15 min for å la eleven få fullt dilate.
- Mål IOP i begge øynene ved hjelp av en tonometeret i henhold til produktinstruksjonene. Bring tonometeret nær muse øyet. Hold avstanden fra spissen av sonden til musen hornhinnen på ca 3 − 4 mm. Trykk på måleknappen 6 ganger for å generere en avlesning. Tre maskin gener ert avlesning er innhentet fra hvert øye for å tilegne seg gjennomsnittlig IOP.
- Ofring dyrene for 8 ukens etter så injeksjon og utføre immunhistokjemi av hele-montere Retina, RGC opptellingen, optisk nerve (opp på) halv--spinkle avdelinger, og kvantifisering av overlevende axons, hvilke ha blitt beskrevet tidligere13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kort tid etter injeksjonen kan vi lett identifisere mus som ikke produserer stabilt øye hypertensjon på grunn av at dråpene er for liten (≤ 1,5 mm)13. Disse dyrene er ekskludert fra senere eksperimenter. Etter injeksjon prosedyrene, mer enn 80% av så injisert mus ende opp med dråper større enn 1,6 mm. Vi målte IOP av disse muse øynene en gang i uken i 8 uker etter en enkelt så injeksjon. IOP i øyet som får så forble høy, generelt doble IOP av kontralateral kontroll øye, noe som indikerer effektiv elev blokkering (figur 1). Ødem i musen hornhinnen kan kontrolleres under et lett disseksjon mikroskop etter en intracameral injeksjon som normalt tar 2 − 3 dager for utvinning. Elev utvidelse tar tid, og man må vente på å bli elev utvidelse før de tar IOP-målingen. Derfor prøver vi å ikke måle IOP for tidlig etter en injeksjon. Av samme grunn anbefaler vi ikke å måle IOP for ofte. Med en annen gruppe mus, spyles vi ut SO fra fremre kammer 2 uker etter så injeksjon, og vi ventet på en annen uke for å la hornhinnen å komme seg før måling av IOP, som stabilt returnerte IOP til normal (figur 1).
For å fastslå effekten av øye hypertensjon indusert av så injeksjon på RGCs, kvantifisert vi de overlevende RGC somata i perifere regioner av retinal wholemounts av RBPMS farging14,15 og de overlevende axons i på semithin tverrsnitt av PPD farging16 på 8 uker etter så injeksjon. Glaucomatous RGC død og axon degenerasjon var dramatiske i så-indusert øye hypertensjon under oppdaget øyne (SOHU) (figur 2). Du finner mer informasjon om dette i diskusjons delen.
Figur 1: IOP-målinger i så øyne og kontralateral kontroll øyne, med eller uten so-fjerning. SO = så injisert øyne; CL = kontralateral kontroll øyne. Data presenteres som betyr ± S. E. M, n = 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Glaucomatous RGC Soma og axon degenerasjon i Sohu. (A) øvre panel viser den perifere regionen viser RGCs (RBPMS +, rød) ved 8 uker etter så injeksjon av hel-montert netthinne. Scale bar = 20 μm. nedre panel viser halv tynne bilder av tverrsnitt av ON beiset med PPD på 8 uker etter SO injeksjon. Scale bar = 10 μm. (B) kvantifisering data for gjenlevende RGCs i den perifere Retina (n = 12) og AXONS i on (n = 10) ved 8 UKER etter så injeksjon i forhold til kontralateral kontroll (CL) øyne. Data presenteres som betyr ± S.E.M. * * * *: P < 0,0001; Studenten er sammenkoblet t test. RGC = Netthinne Ganglion celle; PÅ = optisk nerve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en enkel, men effektiv prosedyre for å indusere vedvarende IOP-høyde i musen øyet ved intracameral injeksjon av SO. Denne prosedyren kan læres raskt av alle som har erfaring i microdissection under et mikroskop. Den primære potensielle risikoen for svikt er lekkasje av SO fra hornhinnen snitt. Men en av fordelene med å bruke SO er at fordi olje dråpe er synlig og målbar, kan vi lett identifisere mus som fikk dråper for liten til å indusere stabilt øye hypertensjon kort tid etter injeksjon og utelukke dem fra senere eksperimenter. Vi har rutinemessig oppnådd en 80% suksess rate og ekskludert ca 20% av mus på grunn av en liten SO dråpe (≤ 1,5 mm)13. Men en erfaren kirurg som kan gjøre en relativt lang tunnel (0,3 mm) i lag av hornhinnen før du penetrerer hornhinnen inn i fremre kammer med skrå spissen kan nesten hindre noen SO lekkasje ved å gjøre den indre åpningen av hornhinnen tunnelen mye mindre enn den ytre åpningen. Derfor ble nesten alle musene injisert med en så dråpe større enn 1,8 mm. I tillegg til lengden av tunnelen, noen andre kritiske punkter er verdt å understreke. For det første er det viktig å holde IOP lav i injisert øye for å unngå å skyve så ut av fremre kammer. En vanlig feil er å injisere for mye, noe som gjør lekkasje enklere. Vi begrenser volumet av SO i fremre kammeret slik at det nesten, men ikke helt, dekker Iris overflaten. Diameteren på denne SO dråpe er ~ 2.3 − 2.4 mm. Sekund, hornhinnen tunnelen innsnitt er gjort så nær som mulig til limbus å la snittet for å komme nær Iris, men ikke skade den, slik at Iris kan lett ta snittet. For det tredje bør injeksjon hastigheten være så langsom som mulig for å unngå overdreven overløp av SO inn i fremre kammeret. Fjerde, den øvre øyelokk massasje etter injeksjon hjelper hornhinnen snitt for å lukke og noen ganger bistår den fremre synechiae av perifere Iris å lukke hornhinnen snitt, og derfor for å unngå oljelekkasje.
Det er en økning i IOP bare i bakre del av øyet, men ikke i fremre kammer, noe som gjør det til en unik funksjon i denne modellen. Elev blokkering hindrer vandig humor tilsig inn i fremre kammeret, og derfor øker IOP bare i bakre del. Den fysiske barrieren dannet av SO sammen med Iris og store øye linse kan koble fremre kammer fra bakre segmentet, som kan begrense IOP-høyden bare i bakre segmentet, der det vandige materialet akkumuleres. Når musen Eleven er større enn SO dråpe etter utvidelse, de fremre og bakre kamre er koblet, slik at en rask økning av IOP i fremre kammeret ved vandig flom inn i den. Derfor kan en tonometeret bare oppdage den økte IOP-en etter å ha fjernet den Pupillary blokken, så den sanne IOP i det bakre segmentet er utvilsomt undervurdert. Derfor har vi kalt denne modellen så-indusert øye hypertensjon under oppdaget modell (SOHU), som mer nøyaktig og nyttig reflekterer denne viktige funksjonen i modellen. Det ville være best å kunne måle IOP i bakre segmentet direkte, men så langt er det ikke mulig. Denne unike patogenesen av SOHU-modellen har to fordelaktige egenskaper: for det første har de eksperimentelle øynene klare øye elementer som tillater in vivo vurdering av visuell funksjon og morfologi og andre, den alvorlige glaucomatous neurodegeneration mulig å teste neuroprotectants som skal oppdages.
SÅ injeksjon kan føre til hevelse i hornhinnen midlertidig, og vi anbefaler at du ikke utfører IOP-målinger for tidlig eller for ofte. Vi fant ikke noen betennelse i fremre kammeret eller hornhinnen i SOHU øyne, selv om vi møtte to forekomster av hornhinnen neovascularization i mer enn 100 mus mottar SO injeksjoner.
Fordi SO forårsaker øye hypertensjon hos både menneskelige pasienter og mus, er det rimelig å postulatet at denne konseptuelt romanen og praktisk talt signifikant glaukom modell kan tilpasses for større dyr som er mer egnet for prekliniske anvendelser. Karakterisering av underskudd i nevrale funksjon og morfologi av denne modellen vil sikkert oppfordre andre etterforskere til å dra nytte av det å forfølge viktige spørsmål om glaukom og, enda mer generelt, sykdommer som induserer RGC og ON Degenerasjon.
Oppsummert er dette en grei dyr glaukom modell som ikke krever spesialutstyr eller gjenta skader og kan være gjeldende for andre dyrearter. I intriguingly kan IOP-høyden til SOHU-modellen reverseres ved å fjerne oljen fra fremre kammer, og derfor er det nyttig for screening av nervecellene behandling kombinert med IOP senke behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av NIH tilskudd EY024932, EY023295, og EY028106 til YH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% proparacaine hydrochloride | Akorn, Somerset | ||
| 10mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| 18G needle | BD | with Regular Bevel, Needle Length:25.4 mm | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Fisher Scientific | CAS# 75-80-9 | 50g |
| 32G nano | BD | 320122 | BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm |
| 33G ophalmology needle | TSK/ VWR | TSK3313/ 10147-200 | |
| 5mL syinge | BD | Luer-Lok Tip | |
| AnaSed Injection (xylazine) | Butler Schein | 100 mg/ml, 50 ml | |
| artificial tears | Alcon Laboratories | 300651431414 | Systane Ultra Lubricant Eye Drops |
| BSS PLUS Irrigating solution | Alcon Laboratories | 65080050 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | NARISHIGE | PC-10 | |
| EZ-7000 Classic System | EZ system | ||
| Isoflurane | VetOne | 502017 | isoflurane, USP, 250ml/bottle |
| IV Administration sets | EXELint/ Fisher | 29081 | |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | VEDCO | 50989-996-06 | KETAVED 100mg/ml * 10ml |
| microgrind bevelling machine | NARISHIGE | EG-401 | |
| Miniature EVA Tubing | McMaster-Carr | 1883T4 | 0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Length |
| silicon oil (SILIKON) | Alcon Laboratories | 8065601185 | 1,000 mPa.s |
| Standard Glass Capillaries | WPI/ Fisher | 1B150-4 | 4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm |
| TonoLab tonometer | Colonial Medical Supply, Finland | ||
| veterinary antibiotic ointment | Dechra Veterinary | 1223RX | BNP ophthalmic ointment, Vetropolycin |
References
- Chang, E. E., Goldberg, J. L. Glaucoma 2.0: neuroprotection, neuroregeneration, neuroenhancement. Ophthalmology. 119 (5), 979-986 (2012).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. Journal of Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).
- Morrison, J. C., Johnson, E., Cepurna, W. O. Rat models for glaucoma research. Progress in Brain Research. 173, 285-301 (2008).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia Pacific Journal of Ophthalmology (Philadelphia). 4 (4), 236-241 (2015).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (1), 207-216 (2010).
- Chen, H., et al. Optic neuropathy due to microbead-induced elevated intraocular pressure in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (1), 36-44 (2011).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Ichhpujani, P., Jindal, A., Jay Katz, L. Silicone oil induced glaucoma: a review. Graefes Archieves for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (12), 1585-1593 (2009).
- Kornmann, H. L., Gedde, S. J. Glaucoma management after vitreoretinal surgeries. Current Opinion in Ophthalmology. 27 (2), 125-131 (2016).
- Zhang, J., et al. Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse. Elife. 8, (2019).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Rodriguez, A. R., de Sevilla Muller, L. P., Brecha, N. C. The RNA binding protein RBPMS is a selective marker of ganglion cells in the mammalian retina. Journal of Comparative Neurology. 522 (6), 1411-1443 (2014).
- Smith, R. S. Systematic evaluation of the mouse eye : anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. (2002).
