Summary
Denne protokol muliggør optimering og efterfølgende effektiv generation af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra primære kroniske lymfocytiske leukæmiceller. Disse prøver bruges til at bestemme protein lokalisering samt ændringer i protein handel, der finder sted mellem de nukleare og cytoplasmiske rum på celle stimulation og narkotikabehandling.
Abstract
Nuklear eksport af makromolekyler er ofte dereguleret i kræftceller. Tumor suppressor proteiner, såsom P53, kan gøres inaktive på grund af afvigende cellulære lokalisering forstyrre deres virkningsmekanisme. Overlevelsen af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) celler, blandt andre kræftceller, er bistået af deregulering af nukleare til cytoplasmisk fjer, i det mindste delvis gennem deregulering af transport receptor XPO1 og konstitutiv aktivering af PI3K-medierede signalering veje. Det er vigtigt at forstå den rolle, individuelle proteiner i forbindelse med deres intracellulære placering at få en dybere forståelse af rollen af sådanne proteiner i patogenbiologi af sygdommen. Desuden vil identificering af processer, der ligger til grund for celle stimulering og virkningsmekanismen for specifikke farmakologiske inhibitorer i forbindelse med subcellulær protein handel, give en mere omfattende forståelse af mekanismen for Handling. Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at optimere og efterfølgende effektiv generering af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra primære kroniske lymfocytiske leukæmiceller. Disse fraktioner kan bruges til at bestemme ændringer i protein handel mellem de nukleare og cytoplasmiske fraktioner ved celle stimulation og narkotikabehandling. Dataene kan kvantificeres og præsenteres parallelt med immunfluorescent billeder, hvilket giver solide og kvantificerbare data.
Introduction
Transport af makromolekyler mellem kernen og cytoplasmaet har længe været etableret for at spille en central rolle i normal cellulære funktion og er ofte dereguleret i kræftceller1,2. En sådan deregulering kan skyldes over ekspression/mutation af proteiner, der kontrollerer nuklear eksport. En sådan protein Exportin-1 (XPO1), er en transport receptor, der eksporterer > 200 nukleare eksport signal (NES)-indeholdende proteiner i cytoplasmaet fra Nucleus2. XPO1-Cargos omfatter P53, foxo familiemedlemmer og Ib, hvilket bidrager til deres inaktivering ved at hæmme deres virkningsmekanisme1,2,3. Yderligere protein fejllokalisering kan forekomme, når mikromiljømæssige signaler indvirke på kræftcellerne, fører til aktivering af intracellulære signalerings veje såsom phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)/akt pathway, hvilket resulterer i inaktivering af foxo familiemedlemmer og efterfølgende eksport fra Nucleus4,5. En sådan fejllokalisering af tumor suppressor proteiner har været impliceret i progression af en række hæmatologiske og solide tumorer1,2,6.
Udviklingen af små molekyle hæmmere til klinisk brug i hæmatologiske maligniteter (akut myeloid leukæmi (AML)/CLL), som binder til og selektivt hæmmer XPO1 funktion, understreger vigtigheden af at udvikle passende teknikker til at løse de virkningen af farmakologiske midler på fjer ningen af proteiner mellem de nukleare og cytoplasmiske rum6,7,8. Imaging teknikker har fremskreden betydeligt gør det muligt at identificere proteiner i subcellulære rum ved ekstern stimulering af lægemidler behandlinger, men betydningen af robuste og støttende parallelle teknikker er afgørende for pålideligt informere et videnskabeligt publikum om gyldigheden af et resultat.
Hvilende lymfocytter og maligne CLL-B-celler isoleret fra patient blodprøver repræsenterer en udfordring i produktionen af nukleare og cytoplasmiske fraktioner på grund af den høje nukleare: cytoplasmisk ratio. Optimering af eksperimentelle betingelser for at generere robuste og pålidelige eksperimentelle data er naturligvis afgørende for at planlægge fremtidige eksperimentelle programmer. Den beskrevne metode muliggør kvantificering af proteiner i de nukleare og cytoplasmiske fraktioner og afgør, hvordan disse proteiner kan påvirkes af cellulær stimulation og/eller lægemiddelbehandling.
Protocol
Brugen af primære prøver fra CLL-patienter, der er beskrevet her, er blevet godkendt af den vestskotske Forskningsetiske tjeneste, NHS Greater Glasgow og Clyde (UK), og alt arbejde blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
1. isolering af CLL-celler fra patient blodprøver
-
Perifert blodprøver fra tidligere godkendte CLL-patienter modtages fra klinikken i EDTA-blodindsamlings rørene, ledsaget af det hvide celletal (WCC). Rense de perifert blod CLL prøver i henhold til WCC. For WCC < 40 x 106 celler/ml, Fortsæt til trin 1.1.1; for WCC ≥ 40 x 106 celler/ml fortsættes til trin 1.1.2.
- Indholdet af alle EDTA-blod rørene hældes i et 50 mL konisk centrifugeglas, og der tilsættes 50 μL humant B-celle berigende cocktail pr. 1 mL blod. Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 20 min. Fortsæt til trin 1.1.2.
- Prøven fortyndes med et forhold på 1:1 med RT CLL-vaskebuffer (fosfat-Buffered Salin (PBS), 0,5% føtal bovint serum (FBS) og 2 mM EDTA).
- Alikvots graduerings medie til et konisk centrifugeglas med passende størrelse til prøven (10 mL til et 50 mL rør til 30 mL prøve eller 4 mL til et 15 mL rør i 10 mL prøve).
- Omhyggeligt lag prøven på toppen af tætheden gradient medier og centrifuge ved 400 x g for 30 min ved rt.
Bemærk: Sørg for, at centrifugen er ved RT, før Prøverne anbringes i centrifugen, da en temperaturændring vil resultere i dårlig berigelse af mononukleare celler, og sluk for bremsen på centrifugen, da pludselig bremsning kan forstyrre væske interfacet. - Høst forsigtigt det hvide lag af mononukleale celler, der samler sig ved grænsefladen af massefylde gradient mediet og CLL-vaskebufferen, til et frisk 50 mL konisk centrifugeglas ved hjælp af en plastik-pipette.
- Tilsæt 40 ml CLL-vaskebuffer til det isolerede enkeltlags for at vaske cellerne og centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved rt.
- Kassér supernatanten, resuspension pellet ved at svirpe bunden af røret, derefter gentage vaske trin beskrevet i trin 1,5.
- Kassér supernatanten, resuspendere pellet som beskrevet i trin 1,6, derefter resuspendere pellet i et sæt volumen CLL vask buffer (op til 40 mL, afhængigt af størrelsen af celle pellet).
- Tæl cellerne ved hjælp af trypan og et Blue og et hæmatocytometer. Fortsæt derefter til flow cytometri for at kontrollere renheden af CLL-celler.
Bemærk: På dette stadium kan CLL-cellerne dyrkes i en koncentration på 10 x 106 celler/ml i medier, der skal anvendes til eksperimenter, og/eller kryopræserverede i 10% dimethylsulfoxid (DMSO)/fb'er til fremtidigt arbejde i koncentrationer på op til 100 x 106 celler/hætteglas.
2. strømnings cytometri af CLL-celler
- Etiket 12 mm x 75 mm rund bundne polystyren-rør som beskrevet i tabel 1.
- I rør 2-5, sætte en dråbe af kompensation perler og opbevares på is. Tilsæt 1 μL af det relevante antistof (anti-CD5, CD19, CD23 eller CD45, som angivet i tabel 1) til rør 2-5, og Inkuber på is i 20 min, beskyttet mod lys ved at placere tin folie over isspanden.
Bemærk: Disse rør fungerer som kompensations kontrol til opsætning af flowcytometry-skabelonen. -
Sæt op til 1 x 106 CLL-celler i rør 1, 6 og 7, tilsæt 2 ml FACS BUFFER (PBS + 2% FBS) til hvert rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min ved rt for at vaske cellerne. Kassér supernatanten og opbevar rørene indeholdende celle pellets på is.
- Resuspension af celle pellets og tilsæt den passende kombination af antistoffer til cellerne i tube 7 som anvist i tabel 1, i et endeligt volumen på 100 ΜL med FACS buffer. Antistoffer anvendes i en passende koncentration i henhold til producentens retningslinjer.
- Opslæmmer celle pellets i rør 2 og 6 i 100 μL FACS buffer.
- Inkuber cellerne på isen, sammen med de farvede perler i rør 2-5, beskyttet mod lys i 20 minutter.
- Efter inkubationen tilsættes 2 mL FACS buffer til alle rørene og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved rt for at vaske cellerne. Kassér supernatanten og resuspension vulst/celle pellets ved forsigtigt at svirpe rørene.
- Resuspension rør 1-5 i 100 μL af FACS buffer og sted på isen, indtil klar til at analysere på flow cytometer.
- DAPI-opløsningen fortyndes til 0,05-0,2 μg/mL i FACS-buffer umiddelbart før brug. Den optimale koncentration kan variere, og titrering anbefales.
- Resuspension af rør 6 og 7 med 100 μL fortyndet DAPI opløsning og Inkubér rørene på is i mindst 5 minutter for at tillade cellerne at plette.
Bemærk: Ingen yderligere vask er nødvendig, da DAPI skal være til stede i bufferen for døde celler til at forblive mærket. Når DAPI er blevet tilføjet, skal cellerne analyseres på flowcytometer inden for 4 timer. - Analysér celler ved hjælp af et flow-cytometer.
3. fremstilling af subcellulære fraktioner fra CLL-celler
Bemærk: Når du planlægger den eksperimentelle set-up, omfatter en brønd af ustimuleret/ubehandlet celler, hvorfra hele celle ekstrakt kan genereres.
- Udfør den ønskede stimulation og/eller stofbehandling af MEC1 CLL celle linjen eller isolerede primære CLL-celler ved hjælp af 10 – 20 x 106 celler/tilstand. Cellerne vil derefter blive brugt til subcellulære fraktionering (trin 3,4 & 3,5) eller til at generere hele celle ekstrakt (trin 3,6).
- Frem stilling af opløsninger/rør: Forbered alle opløsninger/buffere frisk på dagen for fraktionering, før cellerne høstes. Opbevar løsningerne på is, indtil det er nødvendigt og brug inden for 4 h forberedelse.
- PBS/fosfatasehæmmer opløsning: klargør fosfatasehæmmere i PBS ved fortynding af fosfatasehæmmere 1:20 i 1x PBS (dvs. 0,5 mL fosfatasehæmmere i 9,5 mL 1x PBS).
Bemærk: Sikre, at fosfatasehæmmere ikke er blevet fældet. Hvis et bundfald er til stede, opvarmes til 50 °C i 10 min. - Hypotonisk buffer: Forbered 1x hypotonisk buffer ved at lave en 1:10 fortynding af 10x hypotonisk buffer i destilleret vand (dvs. 50 μL af 10x hypotonisk buffer i 450 μ L af dH2O).
- 10 mm ditiotreitol (DTT): Forbered 10 mm DTT ved at lave en 1:100 fortynding på 1m DTT med destilleret vand (dvs. 10 μl af 1 M DTT i 990 μl DH2O).
Bemærk: DTT er meget labile, så Forbered denne frisk hver gang. Undgå gentagne fryse/tø cyklusser. - Komplet lysis-buffer: Bestem, hvor meget buffer der kræves for hvert eksperiment. Hvert prøveeksemplar kræver 50 μL komplet lysis-buffer, så tilsæt 5 μL 10 mM DTT (trin 3.2.3) til 44,5 μL lysis-buffer, og tilsæt derefter 0,5 μL proteasehæmmercocktail. Dette beløb kan skaleres op afhængigt af antallet af prøver i eksperimentet.
- Mærk fire sæt med 1,5 mL mikrofuge-rør til hver stimulation og/eller lægemiddelbehandling for de nystimulerede celler (trin 3,3), de frisk genererede cytoplasmiske fraktioner (trin 3.4.3), de nyproducerede nukleare fraktioner (trin 3.5.3) og hele cellen lysater (trin 3.6.3). Før chill disse mikrofuge rør på isen, indtil det kræves.
- PBS/fosfatasehæmmer opløsning: klargør fosfatasehæmmere i PBS ved fortynding af fosfatasehæmmere 1:20 i 1x PBS (dvs. 0,5 mL fosfatasehæmmere i 9,5 mL 1x PBS).
- Cellerne overføres til individuelt mærkede 1,5 mL mikrofuge-rør og pellet ved centrifugering ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °c. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 mL iskold PBS/fosfatasehæmmere (trin 3.2.1). Cellerne centrifugeres ved centrifugering ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °c. Fjern supernatanten og holde cellen pellets på isen.
- Frem stilling af cytoplasmiske fraktioner: Resuspendér forsigtigt de celle piller, der skal anvendes til subcellulær fraktionering i 50 μL 1x hypotonisk buffer (trin 3.2.2). Inkuber cellerne på is i 15 minutter for at tillade cellerne at svulme.
Bemærk: Mængden af hypotonisk buffer, der anvendes, kan øges empirisk afhængigt af celle nummeret.- Tilsæt 0,8-2,5 μL (1:20 til 1:60) vaskemiddel i hver prøve og vortex på den højeste indstilling for 10 s.
- For at bestemme den optimale koncentration af vaskemiddel til brug for en bestemt celletype for at isolere nukleare og cytoplasmiske fraktioner, skal du først udføre en vaskemiddel gradient. Et interval på 1:20 til 1:60 (dvs. 2,5 μL til 0,8 μL vaskemiddel til 50 μL hypotonisk buffer) skal være tilstrækkeligt.
Bemærk: Hvis mængden af hypotonisk buffer i trin 3,4 justeres, så sørg for, at det passende rengørings forhold opretholdes. - Bekræft celle lysis ved at observere celler ved hjælp af et fasekontrast mikroskop før og efter tilsætning af vaskemiddel. Hele celler synes større med en tæt, mørk kerne. Cytoplasmaet vil fremstå som en lys Halo omkring kernen.
Bemærk: Passende lysis bekræftes yderligere ved at bruge Western blotting til at analysere specifikke proteiner inden for de lyserede fraktioner genereret fra vaskemiddel gradienten.
- For at bestemme den optimale koncentration af vaskemiddel til brug for en bestemt celletype for at isolere nukleare og cytoplasmiske fraktioner, skal du først udføre en vaskemiddel gradient. Et interval på 1:20 til 1:60 (dvs. 2,5 μL til 0,8 μL vaskemiddel til 50 μL hypotonisk buffer) skal være tilstrækkeligt.
- Efter lysed centrifugeres prøverne ved 14.000 x g i 30 s ved 4 °c.
- Supernatanten overføres forsigtigt til et præ-kølet, mærket mikrofuge-rør. Denne cytoplasmiske fraktion kan opbevares ved-80 °c, indtil det er nødvendigt for yderligere analyse. Den resterende pellet indeholder den nukleare fraktion (trin 3,5).
Bemærk: Undgå gentagne fryse/tø-cyklusser af prøverne.
- Tilsæt 0,8-2,5 μL (1:20 til 1:60) vaskemiddel i hver prøve og vortex på den højeste indstilling for 10 s.
- Frem stilling af nukleare fraktioner: Hver Atom pille opslæmmes i 50 μL komplet lyse buffer (trin 3.2.4) ved pipettering op og ned.
Bemærk: Mængden af komplet lyse buffer kan justeres empirisk i henhold til start cellens nummer.- Tilsæt 2,5 μL vaskemiddel for at opløse proteiner i forbindelse med den nukleare membran og vortex på den højeste indstilling for 10 s. inkubere prøverne på is i 30 minutter.
- Vortex på den højeste indstilling for 30 s, derefter centrifugeres prøverne ved 14.000 x g i 20 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten overføres til et forkølet, mærket mikrofuge rør. Denne nukleare fraktion kan opbevares ved-80 °c, indtil det er nødvendigt for yderligere analyse.
Bemærk: Undgå gentagne fryse/tø-cyklusser af prøverne.
- Fremstilling af hele celle lysater (WCL) fra CLL-celler
Bemærk: Fremstillingen af hele celle ekstrakten kan udføres samtidig med forberedelsen af de nukleare fraktioner (trin 3,5).- Resuspendere hele cellen ekstrakt pellets i 100 μL komplet lysis buffer (forberedt i trin 3.2.4) ved pipettering op og ned, derefter tilsættes 5 μL vaskemiddel for at sikre fuldstændig cellelyse. Prøverne inkubates på is i 30 minutter.
- Vortex på den højeste indstilling for 30 s, derefter centrifugeres prøverne ved 14.000 x g i 20 minutter ved 4 °c.
- Supernatanten overføres til en forkølet mikrofuge slange. Hele denne celle lysat kan opbevares ved-80 °c, indtil det er nødvendigt for yderligere analyse.
Bemærk: Undgå gentagne fryse/tø-cyklusser af prøverne.
4. downstream-analyse af subcellulære fraktioner
Bemærk: I denne protokol, analyse af de genererede celle fraktioner blev udført af Western blotting ved hjælp af standardprotokoller, lastning lige cellenumre/Lane (svarende til ~ 10 μg protein) for nukleare og cytoplasmiske fraktioner.
- Kvantificering af protein handel mellem nukleare og cytoplasmiske fraktioner: Udfør kvantitativ Western blot-analyse gennem kvantitering af signalintensitet eller densitometri ved hjælp af frit tilgængelige Western blot Analysis software.
- Importerer billeder: Western blot billeder genereret fra forskellige udviklingsinstrumenter skal importeres som JPG, PNG eller TIFF-filer. En 16-bit dybde rå fil anbefales. Hvis du vil importere et billede, skal du klikke på software ikonet og holde markøren over importen. Klik derefter på tredjeparts billeder. Vælg billedfilen, og klik på Åbn.
- Visning af billedet: Klik på knappen Vælg i gruppen skærm på båndet billede. Dialogboksen Juster display åbnes for at aktivere yderligere justeringer, hvis det er nødvendigt. Implementer yderligere forbedringer, herunder lysstyrke eller kontrast , ved hjælp af de justerbare skydere under fanen billed LUTS . Brug fanen kurver til finere justeringer.
- Data analyse (kanal afvalg): Klik på analyse båndet. Hvis du kun vil analysere én kanal, skal du fravælge den eller de kanaler, der ikke analyseres. Klik på en kanals ikke vise kanalminiaturebillede i billedet LUTs, efterlader kun den ønskede kanal vises. Billeder, der importeres som JPG-, PNG-eller TIFF-filer, kan kræve afvalg af flere uønskede RGB-kanaler.
-
Tilføje figurer: Hvis du vil kvantificere signal intensiteten, skal du klikke på Tilføj rektangel for at føje et rektangel til billedet. Klik på midten af en funktion (f. eks. et protein bånd) for at placere et rektangel omkring det. Du kan også tegne en figur manuelt ved at vælge tegn rektangel. Når du har tilføjet alle de ønskede figurer, skal du klikke på Vælg for at returnere markøren til markeringsværktøjet.
Bemærk: Tilføj flere figurer i en logisk rækkefølge, da dataene sorteres efter et ID-nummer, der genereres sekventielt. -
Subtraktion i baggrunden: Hvis du vil trække baggrundsstøj fra, skal du klikke på den første knap i baggrunds gruppen og vælge median i rullemenuen. Indstil rammebredden til 3 i baggrunds dialogen, og vælg de segmenter, der skal bruges til baggrunds beregningen. Når du vælger, hvilke segmenter du vil bruge, skal du vælge segmenter, der bedst repræsenterer billedets baggrund.
Bemærk: Baggrundsstøj kan påvirke signal kvantificering, så det skal trækkes til præcist at beregne signalet fra de former af interesse. -
Trim signal og trim baggrund-Valgfrit: Filer, der importeres i JPG-, PNG-eller TIFF-format, kan udvise pixel mætning: Fremhævede/lyse områder i et protein bånd. Trim signal og trim baggrund (bkgnd) fjerner mættede pixels fra analyse. Hvis du vil se disse værdier, skal du tilføje Trimsignal og beskære Bkgnd til en tabel ved at klikke på knappen kolonner til højre for tabelvisningen.
Bemærk: Pixel mætning kan føre til upålidelig kvantificering. Mættede pixels kan kun fjernes, hvis mindre end 5% af pixlerne i en figur er mættede.
-
Tilføje figurer: Hvis du vil kvantificere signal intensiteten, skal du klikke på Tilføj rektangel for at føje et rektangel til billedet. Klik på midten af en funktion (f. eks. et protein bånd) for at placere et rektangel omkring det. Du kan også tegne en figur manuelt ved at vælge tegn rektangel. Når du har tilføjet alle de ønskede figurer, skal du klikke på Vælg for at returnere markøren til markeringsværktøjet.
- Eksporter data: Klik på fanen figurer over tabellen. For densitometri kræves værdier i signal kolonnen. Signal er summen af pixel intensitetsværdierne (total) for en figur minus produktet af Bkgnd og området. Klik på knappen anmeld. Klik på Gem som eller Start regneark.
Signal = total – (Bkgnd x område)
Bemærk: Fanen figurer indeholder en tabel med kvantitative værdier, herunder signal, total, område og Bkgrnd. - Kvantificering af protein udtryk: I det gemte regneark beregnes normaliseret ekspression af det protein, som er af interesse for hver bane eller variabel, ved at dividere det opnåede signal for det protein af interesse, som signalet til det tilsvarende protein belastningskontrol bånd har.
Bemærk: Sammenligninger mellem mængderne af et normaliseret protein af interesse på tværs af nukleare og cytoplasmatiske fraktioner kan ikke sammenlignes direkte på grund af de forskellige belastnings Kontroller, der anvendes til at skelne mellem nukleare og cytoplasmiske fraktioner. Sammenligninger inden for individuelle fraktioner, fx efter behandling af lægemidler, er dog passende. - Eksporter billede til publikation eller præsentation: Klik på fanen billeder , som findes over tabellen, og klik derefter på det billede, der skal eksporteres. Hvis du bruger billedet til en slidepræsentation eller andre digitale formater, klik på software-ikonet, hover over eksport og klik på billedet for digitale medier. Gem billedet som en JPG-, PNG-eller TIFF-fil efter behov.
Representative Results
Ved planlægning af eksperimenter på primære CLL-celler, hvis assays kræver et stort antal celler (> 50 x 106 celler), er der en præference for at bruge frisk isolerede CLL-celler, snarere end kryopræserverede celler, der kræver optøning, men dette er ikke altid Muligt. Dette skyldes, at fryse/tø-processen kan resultere i døden på op til 50% af CLL-cellerne, selv om dette er stikprøve afhængig. Tilsætning af CLL-celler med en WCC-> 40 x 106/ml ved hjælp af tætheds centrifugeringsfunktion som beskrevet her (trin 1,3 – 1,5) muliggør et højt celle opsving med høj renhed (≥ 95%) af primære CLL-celler. I det viste eksempel blev WCC = 177 x 106/ml: fra en 30 ml blodprøve 5 x 109 celler genvundet, hvilket repræsenterer et celle udbytte på 94% af de samlede celler. Analyse af denne prøve ved flow cytometri afslørede en renhed af CLL-celler på > 95% som indikeret af det dobbelte overflade ekspression af CLL celle markører CD19 og CD5 efter gating på FSC/SSC, enkeltceller, der var DAPI negative (levedygtige celler) (figur 1).
Optimering af subcellulære fraktionerings proceduren blev udført ved hjælp af en række rengørings forhold (1:20 til 1:60) under forberedelsen af den cytoplasmiske fraktion (trin 3,4). Derefter blev de nukleare fraktioner og WCLs fremstillet (henholdsvis trin 3,5 og 3,6). Der blev udført immunoblots på de resulterende fraktioner af CLL-celle linjen MEC1 (figur 2A) og primære CLL-celler (figur 2B). Blots blev probed for brøk mærkerne Lamin A/C (Nuclear; 74/63 kDa) og β-Tubulin (cytoplasmic; 55 kDa) for at bekræfte en vellykket celle fraktionering. Fraktionering indikerer, at det optimale rengøringsniveau for MEC1 celler er en 1:60 fortynding (figur 2a), sammenlignet med en 1:30 fortynding er optimal for primære CLL celler (figur 2B), som angivet ved en berigelse af kerne protein og mangel på cytoplasmisk protein i fraktioner og omvendt. WCLs repræsenterer det totale protein og fungerer som en positiv kontrol for antistoffer, der anvendes til at sonde de subcellulære fraktioner. Det er vigtigt at vælge passende proteiner som brøk markører: figur 2C viser immunoblots af nukleare/cytoplasmatiske fraktioner fremstillet af MEC1 celler, hvor RNA polymerase II (Rpb1 CTD; 250 kDa) og Lamin A/C blev blottet som markører for nukleare fraktioner, mens β-Tubulin og γ-Tubulin (50 kDa) blev anvendt som cytoplasmatiske markører. Det er klart, at γ-Tubulin er beriget i cytoplasmaet, men udtryk er tydeligt i kernen, som vist tidligere9.
Når forsøgsbetingelserne er optimeret, kan der udføres et eksperiment. I de viste eksempler blev den subcellulære lokalisering af FOXO1 i nukleare og cytoplasmiske fraktioner bestemt ved stimulering af celler med B-celle antigen receptoren (BCR) ved tilstedeværelse eller fravær af den dobbelte mTORC1/2-hæmmer AZD8055 i MEC1 celler ( Figur 3A) og primære CLL-celler (figur 3B)5,10. I begge eksempler blev genereringen af højt berigede nukleare og cytoplasmiske fraktioner opnået som indikeret ved den næsten eksklusive ekspression af Lamin i den nukleare fraktion og β-Tubulin i cytoplasmatiske fraktioner. I begge celletyper blev FOXO1 ekspression reduceret i cytoplasmaet efter behandling med AZD8055 sammenlignet med NDC, ledsaget af en stigning i FOXO1 ekspression i det nukleare rum, hvilket viste protein translokation (figur 3). For at fjerne subjektiviteten af data fortolkningen blev individuelle immunoblots fra fem primære CLL-prøver kvantificeret inden for subcellulære fraktioner (trin 4; Figur 4A), ved hjælp af de respektive nukleare eller cytoplasmiske proteiner som interne belastnings Kontroller for hver prøve, og derefter normalisere hver fraktion til USTIMULERET (US) No Drug Control (NDC) kontrol, som angivet. Den resulterende graf viser tendenser i FOXO1 bevægelse mellem de nukleare og cytoplasmatiske fraktioner, med AZD8055 at reducere niveauet af FOXO1 udtryk i cytoplasmaet, mens samtidig øge udtryk i kernen. Endvidere, en stigning i cytoplasmisk FOXO1 udtryk er indlysende på BCR crosslinking.
| Tube | Rørnavn | Celler/perler | Antigen | Fluoroforet |
| 1 | Uplettet | Celler | Na | Na |
| 2 | Enkelt bejdning | Perler | CD5 | FITC |
| 3 | Enkelt bejdning | Perler | CD19 | PE-Cy7 |
| 4 | Enkelt bejdning | Perler | CD23 | Apc |
| 5 | Enkelt bejdning | Perler | CD45 | APC-Cy7 |
| 6 | Enkelt bejdning | Celler | Levedygtighed | DAPI |
| 7 | CLL Stain | Celler | CD5, CD19, CD23, CD45 & levedygtighed | FITC, PE-Cy7, APC, APC-Cy7 & DAPI |
Tabel 1: tabel, der viser det ideelle sæt af prøve slanger til strømnings cytometri af CLL-celler. Hvert eksperiment skal omfatte alle de relevante kontroller til nøjagtig analyse af de opnåede resultater.
Figur 1: repræsentativ flow cytometri analyse plot af beriget CLL-patienter. Mononukleære CLL-celler beriget med perifert blod fra en individuel CLL-patient blev indhegnet ved hjælp af FSC-a vs. SSC-a, og form blev derefter udelukket ved brug af FSC-a vs. FSC-H (A). Ufarvede celler (tube 1) og kompensations kontrol (rør 2-6) blev brugt til at opsætte flowcytometer til at detektere celler og kompensere mellem de fluorescerende kanaler og dermed sikre, at fluorescens signalerne blev detekteret korrekt. B) et eksempel på negativ farvning (ufarvede celler, tube 1) i fluorescens kanalerne CD19 og CD5. Live (DAPI negative) og CD45 positive celler blev gated (C) og ANDELEN af CD19+CD5+ (95,5%) og CD19+CD23+ (91,2%) celler i DAPI-CD45+ populationen blev bestemt (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: optimering af nuklear/cytoplasmisk fraktionering. Cytoplasmiske og nukleare fraktioner, og hele celle lysater (WCL), blev fremstillet af celle pellets (10 – 20 x 106 celler) af CLL celle linjen (A) MEC1 eller (B) primære CLL-celler beriget fra det perifere blod af patienter som beskrevet i Trin 3. Optimering af subcellulære fraktionering blev udført ved hjælp af en række vaskemiddel forhold (1:20 til 1:60) ved klargøring af cytoplasmisk fraktion (som beskrevet i trin 3,4). De resulterende prøver blev immunoblotted og probed med anti-Lamin A/C (nuklear) og anti-β-Tubulin (cytoplasmiske) antistoffer for at bekræfte vellykket celle fraktionering sammen med WCL. Molekylvægt markører er vist til venstre for blottet (M). * Angiver de optimale vaskemiddel betingelser for cellelyse. C) immunoblot af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra MEC1 celler med kontrolbetingelser (NDC) eller narkotikabehandling (8055) i nærværelse af fravær af stimulation (+ eller – BCR binding hhv.). Blots blev probed med anti-Rbp1 CTD (klon 4H8; anerkende RNA polymerase II underenhed B1), anti-Lamin A/C, anti-β-Tubulin eller anti-γ-Tubulin (klon GTU-88) antistoffer, at identificere subcellulære fraktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: subcellulære fraktionering viser fjer ningen af FOXO1 mellem kernen og cytoplasmaet i CLL. (A) MEC-1-celler og (B) primære CLL-celler blev forbehandlet i 30 minutter med 100 nm AZD8055 (8055) eller venstre ubehandlet (NDC) som indikeret, og derefter BCR blev ligeret i 1 time eller forlod os. Nukleare og cytoplasmiske fraktioner blev derefter forberedt og immunoblotted. Efter bekræftelse af fraktionering ved sondering med anti-Lamin A/C (nuklear) og anti-β-Tubulin (cytoplasmiske) antistoffer blev virkningen af både lægemiddelbehandling og BCR ligering vurderet på FOXO1 protein ekspression, ved hjælp af et anti-FOXO1 antistof. M indikerer molekylvægt markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: et bearbejdet eksempel på kvantitativ Western blot-analyse (densitometri). (A) densitometri blev udført ved hjælp af Western blot Analysis software tilgængelig online. Kort inden for analyse båndet blev rektangler trukket omkring protein båndene i billedet for at beregne signal intensiteten. Afbildet er densitometri af en repræsentativ Western blot billede af en CLL patientprøve, der gennemgik cytoplasmisk/nuklear fraktionering. Cytoplasmiske og nukleare fraktioner udmærker sig ved ekspression af cytoplasmatiske (β-Tubulin) og nukleare (Lamin A/C) markører. Normaliseret ekspression af FOXO1 for en given betingelse kan beregnes ved at dividere det signal, der er opnået for FOXO1, med det tilsvarende signal for β-Tubulin eller Lamin A/C, afhængigt af den fraktion, der analyseres. Relative FOXO1 Expression (i forhold til US Vehicle Control) kan beregnes ved at dividere normaliseret FOXO1 udtryk for en given betingelse med det normaliserede FOXO1 udtryk for den amerikanske køretøjskontrol af en given cellulær fraktion. (B) graf, der viser FOXO1 ekspressions niveauerne i cytoplasmiske (venstre) eller nukleare (højre) fraktioner NORMALISERET til US-NDC-kontrol inden for hver celle fraktion. Den røde prik på grafen er det viste eksempel. Disse data viser den gennemsnitlige fold ændring i FOXO1 udtryk sammenlignet med US-NDC ± SEM. P værdier blev bestemt af to-sidet studerende parret t test. n = 5 individuelle CLL-patientprøver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den beskrevne protokol giver en hurtig og effektiv metode til generering af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra primære CLL-celler og efterfølgende kvantificering af protein handel mellem de nukleare og cytoplasmiske fraktioner ved celle stimulation og narkotikabehandling. De fremlagte data viser muligheden for at afsløre handel med specifikke proteiner, for eksempel FOXO1, mellem de nukleare og cytoplasmiske fraktioner, efter behandling med en dual MTOR-hæmmer AZD8055 i nærværelse af/fravær af BCR-binding-mekanismen gennem F ( AB ')2 fragment stimulation (figur 3 og figur 4). Sammenkobling af disse eksperimenter med kvantificering af vestlige blotter fra individuelle CLL-patientprøver muliggør objektiv analyse af de genererede data og viser robustheden af den beskrevne analyse for at kvantificere de globale ændringer i protein lokalisering i CLL-celler isoleret fra patient kohorter (figur 4). Det fremgår af dataene, at gennemsnittet af fem patientprøver i cytoplasmatiske fraktioner nåede nær betydning. I betragtning af den kliniske heterogenitet af CLL-patienter11, vil disse analyser normalt blive udført på større patient kohorter og/eller fokuseret på specifikke prognostiske undergrupper af patienter for at opnå en mere fyldigere forståelse af den cellulære respons af CLL celler til specifikke lægemidler behandlinger.
De præsenterede data viser vigtigheden af at vælge protein markører, der udelukkende bor i enten cytoplasmatiske eller nukleare fraktioner, da renheden af fraktionering vil blive bekræftet af disse markører. β-Tubulin blev valgt til en cytoplasmisk fraktion bekræftelse, og Lamin A/C som en nuklear markør. Yderligere anvendte proteiner er gapdh og α-Tubulin til identifikation af cytoplasmiske fraktion eller Brg1 (SMARCA4), tfiid og RNA polymerase II for nuklear fraktion renhed4,5. Der skal dog udvises forsigtighed ved valg af proteiner, der er meget berigede i specifikke fraktioner, og som ikke findes i begge fraktioner (f. eks. γ-Tubulin) (figur 2C)9. Faktisk gapdh og actin mens generelt anses for at være cytoplasmatiske proteiner kan lokalisere til Nucleus12,13, fremhæver betydningen af at vælge en brøkdel markør, der ikke flytter sig, når stimulation eller behandling er anvendes på cellerne. Desuden er det vigtigt at bekræfte, at den valgte protein markør udtrykkes i cellen af interesse ved at køre WCL sammen med subcellulære fraktioneringer.
I det viste repræsentative eksperiment blev det samme antal CLL-celler anvendt til hver betingelse (stimulation/lægemiddelbehandling), og derefter blev fraktionerings prøverne forberedt med det samme. Lastning 10 μg fraktioneret protein/Lane giver tilstrækkeligt materiale til påvisning af de proteiner af interesse. Da disse prøver kun gennemgik en kortvarig lægemiddelbehandling og stimulering (op til 4 timer), blev det antaget, at proteinniveauet ville forblive det samme i hver prøve, og der blev ikke udført en proteinanalyse. Men hvis celle behandlinger forlænges (18-72 h), kan niveauet af celledød eller spredning i celler betydeligt ændre kvaliteten og mængden af protein ekstraheret, afhængig af den anvendte stof/celle stimulation, hvilket ændrer protein niveauerne i den behandlede /stimulerede prøver. I disse tilfælde for længerevarende lægemidler behandlinger, er det tilrådeligt at udføre protein kvantificering ved hjælp af en Bradford assay eller tilsvarende, forud for vestlige blotting at sikre den samme mængde protein er kørt i hver vognbane af immunoblot. Tilstedeværelsen af vaskemidler kan interferere med specifikke protein assays14, kan denne interferens reduceres ved fortynding af celle fraktion protein prøver. Desuden anvendes den komplette lysis-buffer som blindprøve ved hjælp af den samme fortynding som i de prøver, der testes.
For at fremlægge dokumentation for de resultater, der er beskrevet her, kan parallelle eksperimenter udføres ved hjælp af Fluorescens mikroskopi for at analysere placeringen af FOXO1 inden for CLL-celler for at muliggøre visualisering af disse fund5. Desuden kan de genererede subcellulære fraktioner også anvendes til enzym aktivitets analyser eller proteomics-analyse i yderligere downstream-analyser.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Natasha Malik for kritisk gennemgang af manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af et Blodvis projekttilskud tildelt AMM (18003). FACS analyse faciliteter blev finansieret af Howat Foundation. MWM blev finansieret af en PhD Studentship fra Friends of Paul O'Gorman leukæmi Research Centre, JC blev finansieret af Friends of Paul O'Gorman leukæmi Research Center og JH blev finansieret af en Bloodwise projekt Grant (18003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
| 3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
| 12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
| 15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
| 50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
| anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
| anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
| anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
| anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
| anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
| anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
| anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
| anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
| anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
| anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
| anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
| BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| EDTA | Sigma | EDS | |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
| Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
| HyperPAGE 10 - 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
| Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
| Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
| Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
| OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
| Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
| PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
| Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
| Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge | |
References
- Kau, T. R., Way, J. C., Silver, P. A. Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nature Reviews Cancer. 4, 106-117 (2004).
- Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer. Biochemical Pharmacology. 83, 1021-1032 (2012).
- Nakamura, N., et al. Forkhead transcription factors are critical effectors of cell death and cell cycle arrest downstream of PTEN. Molecular and Cellular Biology. 20, 8969-8982 (2000).
- Calnan, D. R., Brunet, A. The FoxO code. Oncogene. 27, 2276-2288 (2008).
- Cosimo, E., et al. AKT/mTORC2 inhibition activates FOXO1 function in CLL cells reducing B cell receptor-mediated survival. Clinical Cancer Research. 25, 1574-1587 (2019).
- Mahipal, A., Malafa, M. Importins and exportins as therapeutic targets in cancer. Pharmacology & Therapeutics. 164, 135-143 (2016).
- Hing, Z. A., et al. Next-generation XPO1 inhibitor shows improved efficacy and in vivo tolerability in hematological malignancies. Leukemia. 30, 2364-2372 (2016).
- Lapalombella, R., et al. Selective inhibitors of nuclear export show that CRM1/XPO1 is a target in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 120, 4621-4634 (2012).
- Hořejší, B., et al. Nuclear γ-tubulin associates with nucleoli and interacts with tumor suppressor protein C53. Journal of Cellular Physiology. 227, 367-382 (2012).
- McCaig, A. M., Cosimo, E., Leach, M. T., Michie, A. M. Dasatinib inhibits B cell receptor signalling in chronic lymphocytic leukaemia but novel combination approaches are required to overcome additional pro-survival microenvironmental signals. British Journal of Haematology. 153, 199-211 (2011).
- Fischer, K., Hallek, M. Optimizing frontline therapy of CLL based on clinical and biological factors. Hematology. American Society of Hematology. Education Program. 2017, 338-345 (2017).
- Butera, G., et al. Regulation of autophagy by nuclear GAPDH and its aggregates in cancer and neurodegenerative disorders. International Journal of Molecular Sciences. 20, 2062 (2019).
- Virtanen, J. A., Vartiainen, M. K. Diverse functions for different forms of nuclear actin. Current Opinion in Cell Biology. 46, 33-38 (2017).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178, 263-268 (1989).
