Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/60427
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 1
1Unidade de Investigação Cardiovascular, Departamento de Cirurgia e Fisiologia, Faculdade de Medicina, Universidade do Porto, 2Department of Physiology, Kilimanjaro Christian Medical University College
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol har til formål at beskrive trin-for-trin teknikken med udvinding og vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter. Denne metode gør det muligt at måle og akutmodulering af myofilamentfunktionen ved hjælp af små frosne biopsier, der kan indsamles fra forskellige hjertelokationer, fra mus til mænd.

Abstract

I denne artikel beskriver vi de trin, der kræves for at isolere en enkelt permeabiliseret ("flået") cardiomyocyte og fastgøre den til et kraftmåleapparat og en motor til at udføre funktionelle undersøgelser. Disse undersøgelser vil gøre det muligt at måle kardiomyocytstivhed (passiv kraft) og dens aktivering med forskellige calcium (Ca2+)-holdige opløsninger for blandt andet at bestemme: maksimal kraftudvikling, myofilament Ca2+-følsomhed (pCa50),samarbejdslighed (nHill) og force saneringshastigheden (ktr). Denne metode gør det også muligt at bestemme virkningerne af lægemidler, der virker direkte på myofilamenter, og af eksogene rekombinant proteiners udtryk for både aktive og passive egenskaber af kardiomyocytter. Klinisk, flået cardiomyocyte undersøgelser fremhæve patofysiologi af mange myokardiesygdomme og tillade in vitro vurdering af virkningen af terapeutiske indgreb rettet mod myofilamenter. Alt i alt muliggør denne teknik afklaring af hjertepatofysiologi ved at undersøge korrelationer mellem in vitro- og in vivo-parametre i dyremodeller og humant væv opnået under åben hjerte- eller transplantationsoperation.

Introduction

Traditionelt har man fortrudt en vurdering af myokardiemekaniske egenskaber, hovedsagelig i flercellede præparater, såsom papillære muskler og trabeculae1,2. Multicellulære hjertemuskler strimler omfatter en heterogen population af celler, herunder kontraktile kardiomyocytter med et ukendt mønster af orientering og kraft generation, elektrisk aktivitet og stress / stamme distributioner samt en omgivende bindevæv matrix3,4. Et præparat uden kollagen og indeholdende en enkelt kardiomyocyt ville gøre det muligt at måle sarcomerelængde og kontraktile egenskaber på tværs af broen på en meget præcis og kontrolleretmåde 5,6. Derfor, i løbet af de sidste fire årtier, flere metoder blev udviklet giver mulighed for at undersøge de mekaniske, kontraktile, og afslapning egenskaber af en enkelt cardiomyocyte6,7. Disse cellers kontraktile funktion afhænger i høj grad af sarcomerelængde og cykelkinetik på tværs afbroen 3. Således er det ønskeligt at undersøge muskelfunktion direkte i enkelte isolerede hjerteceller, i betragtning af at det giver mulighed for at vurdere sarcomere længde og ydeevne samt cross-bro funktion og kontraktile egenskaber. Det er dog stadig en udfordring og udviklingaf 3, 6 , at der isoleres og fastgøres funktionelle kardiomyocytter med en rimelig optisk sarkomeropløsning, mens kraftmålingen på μN-niveauoptages. Andre udfordringer er den logistik, der skal installeres for at isolere kardiomyocytter fra frisk indsamlede biopsier. Uforudsigeligheden af indsamling af menneskelige biopsier kan f.eks.

Desuden har etiske bekymringer vedrørende udskiftning, reduktion og forfinelse af dyreforsøg til videnskabelige procedurer (principperne i 3R) fremmet undersøgelsesændringer på celle- og vævsniveau, helst i humane biopsier eller i mindre dyreprøver. Faktisk en progressiv raffinering af metoder til at vurdere hjertefunktion in vitro på et mindre niveau af kompleksitet giver mulighed for korrekt integration af resultaterne til hele kroppen og oversætte dem til det kliniske scenario7. I alt kan det være et tiltalende alternativ at anvende prøver, der er lagret ved -80 °C til at udtrække kardiomyocytter.

Det myokardievæv skæres i små stykker og homogeniseres med en morter og en støder. Resultatet af denne homogenisering er en suspension af flåede bundtede og isolerede celler med varierende grader af sarkolemmale skader, hvor i nærsynet er udsat for bademediet og alle de cellulære komponenter vaskes ud. Strukturer som myofibrils, der er længere væk fra sarkolemma bevares. Således sarcomere afkortning og funktionelle egenskaber i forbindelse med myofibrillar apparatet holdes intakt og kan registreres8,9.

Den cardiomyocyte kraft målesystem består af en elektromagnetisk motor, der anvendes til at justere cardiomyocyte længde, og en kraft transducer, der måler isometrisk cardiomyocyte sammentrækning. En permeabilized, eller flået, cardiomyocyte er placeret i et eksperimentelt kammer, der indeholder en afslappende opløsning ([Ca2 +] < 10 nM) og silicium-limet til 2 tynde nåle: en fastgjort til motoren og den anden til kraft transducer. Et optisk system bruges til at bestemme kardiomyocyt morfologi og sarcomere længde. Forsøgsprotokollen består ofte af en række kraftoptagelser på bufferopløsninger, der indeholder forskellige Ca2+-koncentrationer, bestemmelse af actin-myosin cross-bridge kinetik og måling af den passive spænding af de monterede kardiomyocytter ved foruddefinerede sarcomere længder (Figur 1). Isolering af permeabiliserede kardiomyocytter fra myokardieprøver frosset i flydende nitrogen (og efterfølgende opbevaret ved -80 °C) er en teknik, der anvender cellulær mekanik og proteinbiokemi til måling af maksimal Ca2+-aktiveret (aktiv) kraft pr. tværsnitsområde (Taktivt,kN∙m-2), Ca2+-uafhængig (passiv) spænding (Tpassiv, kN∙m-2),myofilaments Ca2+-følsomhed (pCa50),myofilaments cooperativity (nHill), force saneringshastigheden (ktr) samt sarkomere længde afhængigheder af Taktiv, Tpassiv, pCa50, nHill og ktr.

Målet med denne protokol er at illustrere og opsummere potentialet i kardiomyocyte kraft målesystem som en pålidelig procedure til at vurdere de funktionelle mekaniske egenskaber af enkelt flået kardiomyocytes isoleret fra frosne prøver fra forskellige arter.

Protocol

Alle dyreforsøg er i overensstemmelse med vejledningen om pleje og anvendelse af laboratoriedyr (NIH-publikation nr. 85-23, revideret 2011) og den portugisiske lov om dyrevelfærd (DL 129/92, DL 197/96; P 1131/97). De kompetente lokale myndigheder godkendte denne forsøgsprotokol (018833).

1. Forberedelse af lageropløsning (tabel 1)

  1. Der klargør 1.000 ml afslappende opløsning til isolering af kardiomyocytter (RELAX-ISO) ved at følge anvisningerne i tabel 2. Reagensen ovenfor opløses i ≈500 ml og justeres pH-3 til 7,0 med KOH. Juster det endelige volumen til 1000 ml.
    1. Relax-ISO fordeles i 50 ml rør. Opbevares ved -20 °C.
  2. Der klargør 250 ml aktiveringsopløsning ved at følge anvisningerne i tabel 3. Reagenserne ovenfor opløses i ≈100 ml ultra rent vand. PH-1 til 7,1 med 5 M KOH ved 15 °C.
    BEMÆRK: Normalt er det nødvendigt at tilføje en betydelig mængde KOH for at nå den ønskede pH. Sæt den volumetriske ballon i en kasse med is for at køle opløsningen ned til 15 °C.
    1. Juster det endelige volumen til 250 ml. Omrør denne opløsning kontinuerligt med en magnetisk omrører indtil det øjeblik, hvor den blandes med den afslappende opløsning.
  3. Der tilberedes 100 ml afslappende opløsning ved at følge anvisningerne i tabel 4. Reagenserne ovenfor opløses i ≈50 ml ultra rent vand. PH-3 til 7,1 med KOH 5 M ved 15 °C.
    BEMÆRK: Normalt er det nødvendigt at tilføje en betydelig mængde KOH for at nå en pH-300.1. Den volumetriske ballon i en kasse fyldt med is skal afkøles til 15 °C. Den ioniske styrke af de løsninger, der blev anvendt under målingerne, udgjorde 180 mM.
    1. Juster det endelige volumen til 100 ml. Omrør denne opløsning kontinuerligt med en magnetisk omrører indtil det øjeblik, hvor den blandes med aktiverende opløsning.
  4. Bland aktiverende og afslappende opløsninger i de proportioner, der præsenteres i tabel 5, for at opnå pCa-opløsninger mellem 5,0 og 6,0.
    1. Hold altid afslappende og aktiverende opløsninger omrørende, mens du blander begge dele.
    2. Aliquot hver blanding til 2 ml mikrorør. Alle mikrorørene opbevares ved -20 °C.
  5. Der klargørs et andet parti pCa-opløsning (4,5 til 6,0) for hver protokol.

2. Kalibrering af krafttransduceren

BEMÆRK: Kalibreringen af krafttransduceren er en rutineprocedure, der skal udføres hvert par måneder, eller når den mistænkes for at være ikke kalibreret. Krafttransduceren er meget følsom og kan nemt brydes. Det bør forsigtigt håndteres i hvert trin af sin brug, herunder kalibrering, limning af kardiomyocyt og rengøring.

  1. Fjern krafttransduceren fra resten af apparatet.
  2. Ved hjælp af en klemme skal krafttransduceren anvendes vandret på en sådan måde, at nålen peger nedad i samme retning, som kardiomyocytten vil udvikle kraft. Dette vil lette hængende en række masser med kendte vægte (elastik, sutur eller pin).
    BEMÆRK: Kontroller krafttransducerens egenskaber, før du går videre til dette trin for at kontrollere skalafaktoren [mg/volt] og for at undgå for stor vægt på transduceren. For krafttransducermodellen er skalafaktoren 50 (50 mg svarer til 1 volt), og vi bruger 5 vægte mellem 12,5 og 250 mg.
  3. Tænd for krafttransduceren og lad den varme op i 30 min.
  4. Start med at hænge den lettere masse på krafttransduceren og registrere den tilsvarende spænding målt ved FORCE OUT.
    1. Gentag denne procedure for op til fem vægte.
  5. Plot kraft anvendes på kraft transducer (belastning) versus spænding og kontrollere for linearitet.
  6. Hvis der ikke er nogen linearitet, justeres nul og forstærkning potentiometre i transducerens printkort. Se den specifikke instruktion for yderligere oplysninger.
    1. Drej nul potentiometer, indtil udgangsspændingen lyder 0,0 V.
    2. Hånd en medium vægt på transducernålen og juster forstærkningsdi potentiometeret for at aflæse den tilsvarende spænding (f.eks. svarer 50 mg til 1 V). Vægten fjernes, og nul potentiometeret justeres igen til 0,0.
    3. Trin 2.6.2 gentages, indtil udgangen med og uden vægten er korrekt.
  7. Monter krafttransduceren tilbage i apparatet.

3. Indstilling af forsøgsapparatet

  1. Tø et hætteglas af hver af de aktiverende, 4,5, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0 og afslappende løsninger og vedligeholde dem på is.
    BEMÆRK: ATP og PCR er labile forbindelser, der bør opretholdes ved kolde temperaturer.
  2. Mikroskopet, prøvningsapparatet og den tilhørende computer klargørs til brug (Figur 1).
  3. Temperaturen justeres, så kammerets termometer aflæser 15 °C. Alle forsøg ved denne temperatur undtagen kinase- og fosfataseinkubationer (20 °C).
  4. Tænd for krafttransduceren og motoren.

4. Udvinding og permeabilisering af flåede kardiomyocytter

  1. Optø 50 ml RELAX-ISO-opløsning.
  2. Tænd centrifugen og hurtigt afkøle den op til 4 °C.
  3. Tø 3-5 μg af en myokardieprøve op i en petriskål indeholdende 2,5 ml RELAX-ISO-opløsning.
  4. Skær vævet i små stykker med en skalpelkling (Figur 2). Skær prøven præcist for at undgå unødvendige celler.
  5. Overfør 2,5 ml RELAX-ISO-opløsningen med vævet til et Potter-Elvehjem-glas ved hjælp af en afskåret pipettespids.
  6. Mekanisk forstyrre vævet med en kværn ved en rotationshastighed på 30-40 rpm. Tryk på vævet 3 gange for 2 s hver for at opnå en god celle suspension.
  7. Der tilberedes 10% Triton i RELAX-ISO-opløsning (250 μL Triton med 2,25 ml RELAX-ISO) i et 15 ml rør, og denne opløsning til cellesuspensionen.
  8. Bland forsigtigt ved at vende røret 3 gange.
  9. Inkuber ved stuetemperatur i 1 min og 4 min på is.
  10. Triton vaskes ved at tilsætte RELAX-ISO op til toppen af 15 ml-røret. forsigtigt blande (invertere 3 gange røret) og endelig spinding ned cellerne i en vinklet centrifuge (1 min ved 348 x g). Fjern supernatanten op til 3 ml over cellepellet.
    BEMÆRK: Fjern supernatanten forsigtigt for at undgå at forstyrre cellepellet. Stadig, nogle celler i supernatant vil uundgåeligt gå tabt.
  11. Trin 4.10 gentages mindst 4 gange, eller indtil der ikke observeres flere bobler produceret af Triton-rester.
    BEMÆRK: Jo flere udvaskningstrin der er taget, jo flere celler går tabt med den kasserede supernatant.
  12. Ved den sidste udvaskning fjernes supernatanten op til et volumen på 5-10 ml celleaffjedring.

5. Valg og limning af flået kardiomyocyt

  1. Sæt en celle suspension dråbe på en coverlip oven på et glas dias i mikroskop diasholderen (Figur 1).
  2. Vælg en enkelt stangformet kardiomyocyt med et godt rillationsmønster og størrelse (Figur 2).
  3. Find nålespidserne på krafttransduceren og motoren ved hjælp af den laveste forstørrelse af det omvendte mikroskop.
  4. Drej dækslæden for at placere den valgte kardiomyocyt vandret, så dens ender flugter med kanylen på krafttransduceren og motoren (Figur 2).
  5. Anbring en tynd limlinje på siden af dækslæbet ved hjælp af en vatpindspids (Figur 2).
  6. Nedsænk nålespidserne på krafttransduceren og motoren i limlinjen for at skabe en limglorie omkring begge spidser.
    BEMÆRK: Trin 5.6 - 5.10 opnås ved omhyggelig brug af de motoriserede mikropositioner.
  7. Flyt hurtigt nålespidserne tæt på kardiomyocytens brændplan.
  8. Flyt kanylespidsen af krafttransduceren ned, så den limes fast til den ene kant af kardiomyocytten.
  9. Gentag denne procedure med spidsen af motoren og den anden ende af cellen.
    BEMÆRK: Denne procedure skal tage mindre end 2-3 min, da limen begynder at hærde meget hurtigt.
  10. Efter 5-8 min løftes nålene ≈ 15 μm for at undgå at lime cellen til dækslæbet. Dette gøres ved at bevæge sig op både mikromanipulatorer samtidigt.
  11. Lad limen hærde. Denne procedure kan vare fra 15 til 45 min, afhængigt af typen af lim. I vores tilfælde er kardiomyocyt tilstrækkeligt limet efter ≈15 min.

6. Registrering af kraftmålinger af aktiv, passiv og Ca2+ følsomhed

  1. Fyld den første eksperimentelle brønd med den afslappende opløsning (55-100 μL i forsøgsapparatet) og den anden eksperimentelle brønd med aktiverende opløsning.
  2. Brug kameraet software, placere region af interesse (ROI) i et område af cardiomyocyte med et klart mønster af rillation.
    BEMÆRK: For hjerte-myocytter varierer den fungerende sarcomerelængde mellem 1,8 og 2,2 μm, og den optimale sarkomlængde er ca. 2,15 μm.
  3. Afstand mellem karmyocyttens to yderpunkter (fra motoren til transducerlimgloriet, figur 3), efter at den optimale sarkomlængde er indstillet (2,2 μm). Optag værdien som myocyte længde i softwaren.
  4. Mål kardiomyocyt bredde og dybde, sidstnævnte ved hjælp af en prisme spejl placeret vinkelret på cellen.
    BEMÆRK: Der kræves en kraftig, ekstern lyskilde for at visualisere cellen gennem prisme. Hvis der ikke er nogen prisme, og under forudsætning af, at hjerteceller har en elliptisk form, kardiomyocyte dybde kan udledes som 70% af kardiomyocyt bredde.
  5. Tværsnitsareal (CSA, mm2) beregnes under forudsætning af kardiomyocyttens elliptiske form.
    Equation 1
  6. Flyt forsigtigt mikroskopstadiet, så cellen bevæger sig fra dækslæbet til brønden, der indeholder afslappende opløsning på bagsiden af scenen.
    BEMÆRK: Denne procedure kan nemt beskadige cellen. Før du flytter cellen, skal du forsigtigt flytte nålene lidt mere op. Undgå at fjerne cellen ud af opløsningen.
  7. Vælg den protokol i software, der indeholder to celle afkortning (80% af sin oprindelige længde), der vil opstå, når cellen er opstået i Ca2 + løsning og i afslappende løsning, henholdsvis (Figur 1, Supplerende Fil).
    BEMÆRK: Cellens første "Slack" udføres i aktiveringsopløsningen og den anden "Slack" i afslappende opløsning. Ved at gøre dette, vil brugeren være i stand til at beregne den samlede kraft (Falt)af cellen fra 1st og passiv kraft (Fpassiv)afcellenfra 2. Brug formlen til at beregne aktiv kraft, Faktiv = Ftotal - Fpassiv. Cellen forkortes 80% for at frigøre alle cross-broer rekordkraft.
  8. Fremkalde isometrisk sammentrækning ved at flytte mikroskopstadiet, så kardiomyocytten bevæger sig fra den afslappende til den aktiverende opløsning (pCa=4,5(1)).
    BEMÆRK: Hvis cellen er funktionel, vil den straks indgå kontrakter.
  9. Når du når kraftplateauet, skal du begynde at registrere kraftdataene.
    BEMÆRK: Testene kan udføres individuelt. Afhængigt af software er der mulighed for at skabe en sekvensaf tests,der svarer til de forskellige Ca2 + løsninger inden for en Ca2 +-følsomhed protokol (Figur 1, Supplerende File ).
  10. Vent ~10 s, og skift derefter cellen nedsænket i aktiverende opløsning.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at vente 10 s, før du nedsænker cellen i afslappende opløsning. Hvis cellen flyttes for tidligt, kan vigtige data til beregning af cellerens saneringskraft (ktr-værdi) gå tabt.
  11. Flyt hurtigt scenen, så kardiomyocytet fordyber sig i den afslappende løsning.
  12. Vent, indtil testen stopper.
  13. Gentag trin 6.8 - 6.12, således at cellen aktiveres to gange i aktiveringsopløsningen (pCa=4,5(2)).
    BEMÆRK: Typisk, efter den første aktivering, kardiomyocyte ender kan lidt løsrive sig fra nålen tips, ændre cardiomyocyte længde, CSA og / eller sarcomere længde. Justere til den ønskede sarcomere længde og indføre de korrigerede dimensioner i softwaren.
    1. Fortsæt til trin 6.13.2 for Ca2+ følsomhedsprotokol eller gem dataene, hvis værdierne af passiv og aktiv kraft af cellen er de eneste parametre, der er nødvendige, og tag cellen ud af nåle og rengør dem med acetone for at fjerne limen.
    2. Cellerens sarkomerlængde justeres til 2,2 μm ved om nødvendigt at strække den lidt igen.
    3. Udskift aktiveringsopløsningen med den næste Ca2+ opløsning (55-100 μL her). Gentag trin 6.8 - 6.12.
    4. Aktiveringsopløsningen skal udskiftes med den næste Ca2+-opløsning (55-100 μL her), og trin 6.8 - 6.12 gentages, indtil alle opløsninger er testet (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0).
    5. Endelig genaktivere cellen med aktiverende opløsning (pCa4.5(3)). Gentag trin 6.8- 6.12.

7. Inkubation med kinaser og fosfatas

  1. Efter at have udført den valgte basisprotokol fortyndes kinasen/fosfatase i afslappende opløsning ved den anbefalede koncentration.
    BEMÆRK: Det anbefales at udføre en dosisresponskurve før forsøget.
  2. Temperaturen af de eksperimentelle brønde til 20 °C.
  3. Fyld de eksperimentelle brønde med kinase/fosfatase, afslappende opløsning og aktiveringsopløsning (55-100 μL).
  4. Flyt forsigtigt mikroskopstadiet, så cellen nedsænkes i brønden indeholdende kinase/fosfatase.
  5. Inkuber kardiomyocytten med kinasen/fosfatase i mindst 30 min eller i henhold til producentens anvisninger.
  6. Gentag den valgte grundlinjeprotokol.

8. Færdiggørelse af eksperimentet

  1. Unglue kardiomyocyt fra spidsen af kraft transducer og motor ved at strække cellen.
  2. Fjern forsigtigt limglorie fra nålespidserne ved hjælp af en vatpind dyppet i acetone.
  3. Luk udstyret.

9. Analyse af data

  1. Indsamle alle filer fra hver cardiomyocyte testet.
    BEMÆRK: Hver test svarer til én fil. Det betyder, at for hver Ca2 + opløsning eller sarcomere længde, vil der være en tilsvarende fil.
  2. Beregn aktive og passive kræfter af en enkelt kardiomyocyt.
    1. Åbn den fil, der svarer til første aktivering (pCa=4.5(1)) ved hjælp af et regneark (Figur 3A, tillæg A i supplerende fil).
      BEMÆRK: Vi brugte et skræddersyet program til at udføre analysen. Se tillæg A i den supplerende sag.
    2. Gennemsnitlige ≈60 værdier før og gennemsnitlige ≈60 værdier efter 1m slæk af cellen (når cellen er nedsænket i Ca2 + løsning). Disse 2 værdier svarer til henholdsvis a og b.
    3. Gentag den samme analyse for 2nd slæk af cellen (når cellen er nedsænket i afslappende opløsning). Disse 2 værdier svarer til henholdsvis c og d.
    4. Beregn forskellen mellem a og b (samlet kraft, Fi alt).
    5. Beregn forskellen mellem c og d (passiv kraft, Fpassiv).
    6. Beregn aktiv kraft, Faktiv = Fi alt - Fpassiv.
    7. Normalisere alle kraftværdier til CSA (se ovenfor formel) for at opnå den samlede spænding (Ttotal),passiv spænding (Tpassiv)og aktiv spænding (Taktiv).
    8. Trin 9.2.1 til 9.2.5 gentages for2. aktivering (pCa=4,5(2)).
    9. Overvej disse værdier som dem, derrepræsentererTtotal , T aktiv og Tpassiv af kardiomyocyte under analyse.
      BEMÆRK: Den første aktivering af cellen med pCa4.5(1) er normalt forbundet med ændringer i celledimensioner. Af denne grund, den anden aktivering med pCa4.5 er mere præcis og er den, der skal anvendes.
    10. Trinnene 9.2.1 til 9.2.5 gentages for hver fil/pCa-testede opløsninger (5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 4.5(3)).
  3. Beregn pCa50 og nHill af en enkelt cardiomyocyte.
    BEMÆRK: Til denne analyse skal du bruge de ikke-normaliseredeaktive F-værdier fra filerne 4.5(2), 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0 og 4.5(3).
    1. I en regnearksfil anbringes alle ikke-normaliserede værdieraf aktiv F for hver testet Ca2+-løsning (4,5(2),5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 4,5(3)).
    2. Korrektionsfaktoren = Aktiv F[4,5(2)] - Faktiv [4,5(3)] / 7.
    3. Beregn de korrigerede værdieraf aktiv F for hver Ca2+ opløsning (5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0) ved at trækkeF aktiv - korrektionsfaktor.
    4. Den relative kraft (Frelativ)for hver Ca2+-opløsning beregnes ved at normalisere hver aktivF-værdi med den tilsvarende korrigerede værdi.
      BEMÆRK:F-relative [4.5(3)] bør være lig med 1. Hver forsøgsprotokol begynder og slutter med en kontrolaktivering ved mættende Koncentration af Ca2+ (pCa 4.5(2) og 4.5(3)). Dette gør det muligt at foretage en kraftnalisering og vurdering af gennemgangen af præparaterne ved at sammenligne ændringer i maksimal Ca2+-aktiveret kraft (Fmax). Hvis kardiomyocyt ved forsøgsprotokollens afslutning producerer mindre end mindst 70 % af den maksimale kraft ved den første sammentrækning, bør denne celle/måling udelukkes fra analysen.
    5. Brug Frelative og de tilsvarende pCa værdier til at passe til en sigmoidal kurve med følgende ligning F (Ca) = CanHill/ (Ca50nHill + CanHill).
    6. Ekstrapolere pCa og nHill værdier fra ligningen ovennævnte.
  4. Beregn force saneringshastigheden (ktr) for en enkelt kardiomyocyt.
    1. Udfør en pasform til den kurve, der svarer til værdierne umiddelbart efter 1m celle slæk.
    2. Beregne hældningen af kurven, og denne værdi svarer til den sats for kraft ombygning.
    3. Trin 9.4.1 og 9.4.2 gentages for hver Ca2+-opløsning.
      BEMÆRK: Der opnås en dårlig kurvepasning for de laveste Ca-opløsninger (R kvadreret≤0,90).

Representative Results

Funktionelle permeabiliserede kardiomyocytter skal fremstå ensartet og med et ensartet rillemønster gennem hele eksperimentet. Selv om der forventes en vis grad af forringelse og fald i kraft efter langvarige forsøg, bør værdierne af aktiv spænding være relativt stabile. Celler, der viser tydelige tegn på rilletab eller signifikant fald i kraft (< 15 kN∙m-2 eller <80% af dets oprindelige aktive kraft), bør udelukkes. Tabel 6 viser de normale værdier, der forventes for de vigtigste parametre, der stammer fra gnavere, svin og humane prøver.

De opnåede parametre afhænger hovedsageligt af den valgte protokol. Figur 5 viser repræsentative kraftspor på 3 ud af 8, kraft optagelser er nødvendige for at udføre en protokol af myofilaments Ca2 +-følsomhed. Ved at overføre cellen til et brønd, der indeholder den aktiverende opløsning, begynder kardiomyocyt at udvikle kraft, indtil den når et plateau. Efter en hurtig slæktest (varighed på 1 ms), hvor kardiomyocytet forkortes til 80 % af dens længde, opnår vi basisværdierne nulkraft. Efter slæktesten fortsætter cellen med at udvikle kraft, da den nedsænkes i aktiveringsopløsningen. Samlet kraft (Fialt) beregnes ved at trække plateauværdien fra den minimale værdi. Hældningen af den sidste del af denne kurve giver os værdien af force saneringshastigheden (ktr) (figur 6), som er et mål for den tilsyneladende hastighed af cross-bro fastgørelse og udstationering (fapp og gaap)10. Når ktr R2-værdien er <0,90, bør ktr-værdien udelukkes, og dette sker normalt ved lavere Ca2+ koncentrationer (pCa 5.6, 5.8 og 6.0). Efter overførsel af cellen tilbage til en brønd, der indeholder den afslappende løsning, slapper cellen af og dens kraft falder. Passiv kraft (Fpassiv)beregnes ved at trække den minimale værdi (opnået efter længere tids celleforkortning) til denne nye kraftværdi. Aktiv kraft skyldes forskellen mellem Ftotal og Fpassiv.

Den maksimale aktive og passive kraft, der karakteriserer en kardiomyocyt, er den, der stammer fra den anden celleaktivering med en mættende Ca2+-opløsning (pCa = 4,5). Den første aktivering er normalt kasseres som sarcomere længde ofte skal justeres.

For at udføre en myofilament Ca2+-følsomhedsprotokol er det nødvendigt at udføre mindst 9 aktiveringstest (4.5; 4.5; 5.2; 5.6; 6.0; 5.0; 5.4; 5.8 og 4.5). Denne sekvens er blot eksemplificerende, men bør altid starte med 4,5 (to gange) og slutter med 4,5. Programmeringen af data-erhvervelse software til en myofilament Ca2 +-følsomhed protokol er afbildet i figur 1 i den supplerende fil.

Efter beregning af aktiv kraft for alle disse aktiveringsløsninger skal du kontrollere, om den sidste aktivering gav mere end 80 % af den oprindelige maksimale kraft (ellers skal disse celleresultater kasseres som nævnt ovenfor). For at korrigere for faldet i F max iden eksperimentelle serie, kan de interpolerede Fmax værdier bruges til at normalisere datapunkterne. De normaliserede data kan tilpasses en sigmoidal kurve med følgende ligning F (Ca) = CanHill/(Ca50nHill + CanHill). De opnåede parameterværdier repræsenterer calciumfølsomheden (Ca50, som kan konverteres til pCa50) og samarbejdslighed (nHill). Alle kraftværdier kan konverteres til spændingsværdier efter normalisering til tværsnitsområdet. Udover myofilament Ca2 +-følsomhed og længde-afhængige aktivering protokoller, kan andre tests udføres. Dette er tilfældet med sarkomere længde afhængigheder af Taktiv, Tpassiv (Figur 7), og cardiomyocyte resterende kraft. Resterende kraft optagelser beregnes ud fra den oprindelige kraft opsving (pCa 4.5) nået efter længden ændring af cellen (80%) og normaliseret til hver samlet steady-state kraft nået før længde ændring11. Stigning i resterende kraft er normalt tegn på krydsbroer med langsom udstationering kinetik og højere stivhed.

Endelig bør vi understrege, at denne teknik kan udføres i flåede kardiomyocytter udvundet mekanisk fra frosne eller frisk indsamlede prøver, samt isolerede enzymatisk efterfulgt af permeabilisering af dens membraner. Den måde kardiomyocytter er isolerede virkninger betydeligt resultaterne stammer fra denne teknik. Figur 8 viser de forskelle, der er konstateret mellem de tre isolationsprocedurer.

Figure 1
Figur 1: Integreret ordning for testapparatet. Testapparatet omfatter mikroskopet, mikromanipulatorerne og den tilhørende computer. Bunden af figuren viser en flået kardiomyocyt limet mellem motoren og krafttransduceren. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Flowdiagram over protokollen for celleisolering, permeabilisering og limning. Billedet i øverste venstre hjørne består af 4 billeder, der viser stykker af hjerteprøven i RELAX-ISO-opløsningen (A) i en petriskål (B) i et rør, der anvendes til mekanisk homogenisering afvæv,( C ) homogenisatoren, (D) vævet umiddelbart efter homogeniseringen og (E) når det er i et rør til Triton-permeabilisering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af længden og sarkomeret længde af en flået kardiomyocyt. Cellelængde og breddebestemmelse i en sarkomerlængde på ≈2,2 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Længdeafhængig aktiveringsprotokol (efterligner Frank-starling-mekanismen in vitro). Repræsentative kraftspor og parametre, der stammer fra myofilaments' Ca2+-følsomhedsprotokoller, der er udført før (A, 1,8 μm) og efter at have strakt en kardiomyocyt på op til 2,2 μm (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Myofilaments Ca2+-følsomhedsprotokol. Repræsentative kraftspor og afledte parametre. For nemheds skyld er kun 3 ud af 8 kraftkurver afbildet. Nemlig en kardiomyocyt aktiveret med mættende, en mellemliggende og den laveste Ca2 +-holdige opløsning (4,5, 5,6 og 6,0, henholdsvis). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative spor fra en mus hjertecelle aktiveret ved forskellige calciumopløsninger og den respektive ktr fit kurve. a) pCa 4.5 b) pCa 5.0 c) pCa 5.2 d) pCa 5.4 e) pCa 5.6 f) pCa 6.0- og E-værdier for total, passiv og aktiv spænding, ktr-værdi og Rsquare for ktr-pasform. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Protokoller af sarcomere længde afhængigheder af Tpassiv (A) og Taktiv (B). Passiv spænding og aktiv spænding blev beregnet i en enkelt kardiomyocyt med en sarcomere længde på 1,8 μm til 2,3 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative resultater for kardiomyocytter, der er mekanisk isoleret fra friske ("friske") og frosne myokardieprøver ("Frosset") samt fra kollagen fordøjet hjerte (modificeret Langgendorf-teknik) med posterior permeabilisering med Triton ("Kollag+Triton"). Værdier af (A) Total spænding,B) Aktiv spænding og (C) Pasisve Spænding fra kardiomyocytter aktiveret med pCa 4.5 opløsning ved en sarkomer længde på ≈2,2 μm. (D) Calcium følsomhed kurve og de respektive værdier for (E) pCa50 og (F) nHill. g) Restkraft og (H) ktr-værdier beregnet ved maksimal aktiveringsopløsning (pCa 4.5). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.

Gem på Lagerløsninger [M] Endeligt volumen (ml) Vægt/volumen Noter
4°C Kaliumhydroxid (KOH) 1 100 5.611 g Sådan justeres pH
4°C Kaliumhydroxid (KOH) 5 50 14,03 g Sådan justeres pH
4°C Bes 1 50 10,66 g
4°C Propionsyre 1 100 7.483 ml Juster pH-automaten til 7,0 med 5M eller 1M KOH
4°C CaEGTA består af: 0.1 100 Opløsningen blandes og opvarmes til 60°C i mere end 1 time. Juster pH til 5-6 med 1M KOH.
- CaCO3 0.1 1.001 g
- Titriplex (EGTA) 0.1 3.804

Tabel 1: Vejledning i klargøring af lageropløsning.

RELAX-ISO (for kardiomyocytes isolation) [mM] Vægt
Na2ATP 5.95 3,28 g
MgCl2.6H2O 6.04 1,23 g
Tritiplex (EGTA) 2 0,76 g
KCl 139.6 10,41 g
Imidazol 10 0,68 g

Tabel 2: Vejledning i klargøring af ISO-opløsning.

Aktiveringsopløsning (til målingerne) [mM] Vægt / volumen
Na2ATP 5.97 0,823 g
MgCl 1M 6.28 1,57 mL
Propionsyre 40.64 10.16 ml
Bes 100 25 mL
CaEGTA (lagerløsning tidligere forberedt) 7 17,5 ml
Na2PCr 14.5 0,925 g

Tabel 3: Vejledning i aktivering af opløsningsforberedelse.

Afslappende løsning (til målingerne) [mM] Vægt / volumen
Na2ATP 5.89 0,325 g
MgCl 1M 6.48 0,65 ml
Propionsyre 40.76 4,08 ml
Bes 100 10 mL
Titriplex (EGTA) 6.97 0,265 g
Na2PCr 14.5 0,370 g

Tabel 4: Vejledning i afslapning til fremstilling af opløsning.

pCa = -Log [Ca2+] Afslappende (pCa=9.0)
Ml		 Ativating (pCa=4.5)
Ml
5 0.86 39.14
5.1 1.2 38.80
5.2 1.54 38.46
5.3 2 38.00
5.4 2.51 37.49
5.5 3.14 36.86
5.6 3.89 36.11
5.7 4.8 35.20
5.8 5.89 34.11
5.9 7.14 32.86
6 8.57 31.43

Tabel 5: Vejledning i klargøring af pCa-opløsninger.

Parameter Gnaver Gris Menneskelige
Aktiv spænding, kN.m-2 (ved 2,2 μm) 17 – 28 19 – 40 19 – 36
Passiv spænding, kN.m-2 (ved 2,2 μm) 3.6 – 5.5 1.9 – 6.8 1.8 – 2.3
pCa50 5.58 – 5.64 5.40 – 5.50 5.43 – 5.82
nBakke 2.60 – 2.76 2.95 – 3.36 2.99 – 3.10
ktr, s-1 4.00 – 8.00 1.00 – 3.00 0.90 – 2.00

Tabel 6: Typiske parametre og indekser afledt af enkelte hjerte-kardiomyocytter fra gnavere, svin og mennesker. Tilpasset fra12.

Problem Mulig årsag Løsning
Kardiomyocyt løsner sig under maksimal aktivering Utilstrækkelig limningstid; Limen er gammel og er tørret Forøg tidspunktet for limningstrinnet. overveje at åbne et nyt limpirør.
Der er triton® i celleaffjedringsopløsningen, som ikke længere kan fjernes Gentag ekstraktionsproceduren med en eller to ekstra Triton® udvaskningstrin
Kardiomyocyt har lav kraft under kontrolbetingelser Ekstraktionen gik galt og leverede celler af lav kvalitet Forøg prøvestørrelsen, og udvinding af en ny ekstraktion. Hvis problemet fortsætter skyldes sandsynligvis forkert indsamling af prøver - kassér denne prøve
Cellen er synligt ordregivende, men ingen kraft registreres; Cellen har usædvanlige kraftværdier Krafttransduceren er slukket Tænd den
Krafttransduceren er ikke godt kalibreret Krafttransduceren kalibreres ved hjælp af et sæt kendte vægte (se producentens brugsanvisning).
Krafttransducernålen er løs Lim nålen igen ved hjælp af krystal bond 509 eller guldsmede voks.
Rillemønsteret er ikke godt nok til at bestemme sarkomlængden Utilstrækkeligt lys Forøg mikroskoplyset, eller flyt cellen tilbage til dækslæden, og vurder sarkomlængden igen (brøndene har lavere lysintensitet)
Ekstraktionen gik galt og leverede celler af lav kvalitet Øge prøvestørrelsen og lave en ny udvinding
Nåle 'tips er ikke i samme plan Ved hjælp af mikromanipulatorer justeres nålenes spidser op eller ned, indtil der er fundet en fokuseret sarcomeres
Ingen længde og/eller force variation under erhvervelsen Motoren eller krafttransduceren er slukket Slå dem til
Motoren er i stykker og producerer ikke celleforkortning Udskift den, eller prøv at kalibrere den ved hjælp af en funktionsgenerator
For meget støj på erhvervelse optagelser For meget luftstrøm omkring udstyret Beskyt udstyret mod den direkte luftstrøm
Der er for mange vibrationer omkring udstyret En stabilisering tabel er tilrådeligt. Selv da anbefales det at fjerne alt udstyr, der kan have en kompressor eller udsende vibrationer (fryser, køleskabe)
Ca2 +-følsomhed kurve har mærkelige værdier og kraft værdier ikke stige med [Ca2 +]. Blandingen af aktiverende og afslappende opløsning blev ikke gjort korrekt (check 3.10 til 3.14 i afsnittet med metoder, muligvis på grund af utilstrækkelig blanding) Optø hætteglasset med samme koncentration, opsaml alt hætteglasindhold i samme bægerglas, bland med en omrører og del dem igen. Test disse løsninger igen i en ny celle. Hvis dette løser problemet, skal du forberede et nyt parti ca2+

Tabel 7: Fejlfinding i tabellen.

Discussion

In vitro-vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flåede kardiomyocytter repræsenterer en vigtig teknik til at tydeliggøre de ændringer, der forekommer på kardiomyocytniveau i fysiologisk (f.eks. stræk) og patologisk kontekst (f.eks. iskæmi). Denne metode har flere fordele, såsom at kræve en minimal mængde myokardi til at vurdere funktion i kardiomyocytter fremstillet af optøede prøver; ved hjælp af kardiomyocytter fra en bred vifte af arter (mus13,rotte1,14,15, kanin16, gris17, hund18, marsvin19 og human20) og forskellige hjerte steder, herunder atria, venstre og højre ventrikler eller en bestemt region af det infarkte hjerte. Desuden giver denne teknik mulighed for at levere specifikke koncentrationer af Ca2+ og energi (ATP), samtidig med at den måler funktionen af regulerings- og kontraktilestrukturer i deres oprindelige konfiguration.

På trods af enkelheden i denne teknik, er der nogle kritiske skridt. Det er vigtigt at sikre kvaliteten af hvert trin fra begyndelsen, herunder indsamling af prøver. Myofilament proteiner er modtagelige for proteaser21. Det er derfor obligatorisk at opbevare prøver i flydende nitrogen umiddelbart efter indsamlingen. Friske prøver, som ikke tidligere var frosne, vil udvikle betydeligt højere kræfter, så det er ikke tilrådeligt at blande måling udført i friske og frosne prøver i samme protokol. Det næstmest kritiske skridt er kardiomyocytters udvinding. Under denne procedure er det afgørende at opretholde prøven på is det meste af tiden. En proteasehæmmercocktail kan bruges til at reducere risikoen for proteinnedbrydning under ekstraktionen/permeabiliseringen22. For det tredje bør prøver skæres i mindre stykker ved hjælp af præcise skalpel bevægelser, da vi bemærkede nedsat kvalitet kardiomyocytter, når dette trin blev ignoreret. Et andet kritisk skridt er at vaske kardiomyocytter, da det er svært at have den rette balance mellem vask ud Triton (permeabilizes cellen, men fremmer sin ungluing) og holde så mange celler i supernatant som muligt. Det er vigtigt først at prøve ekstraktion og antal udvaskninger for hver prøve, art eller protokol. For eksempel, i vores hænder, bemærkede vi, at ZSF1 fede rotte væv ekstraktioner har en "fede" aspekt, som gjorde disse celler mere glatte under limning, men ikke vanskeligere at måle. Den måde, vi omgå dette problem var ved at udføre flere eksperimenter for at have et rimeligt antal celler pr dyr. Desuden er det afgørende at vælge en god celle til lim, nemlig med god rillation og rimelig længde. Hvis kardiomyocyt ikke har disse funktioner, vil det for det meste løsrive sig fra nålen tips eller udvikle ingen / lav kraft. Det er også vigtigt at bruge den korrekte lim til kardiomyocyt vedhæftet fil, i betragtning af tidspunktet for limning og dens effektivitet til at lime cellen til nålen. I vores hænder, silikone lim(Tabel af Materialer)hærder hurtigt (10-15 min) og stærk nok. Endelig er det sidste kritiske trin relateret til omhyggeligt at løfte kardiomyocyt 5 min efter limning af cellen (for at undgå limning af cellen til dækslæbet) og før du flytter den til brøndene (for at undgå den celle, der skal trækkes af mikroskopstadiet). Tabel 7 opsummerer den fejlfinding, der er forbundet med denne teknik, dens underliggende årsager og mulige løsninger til at løse hyppige problemer.

Den største begrænsning af denne metode er, at det ikke kan besvare alle de spørgsmål i forbindelse med myofilament kontraktility, såsom hvor hurtigt myofilaments aktivere / deaktivere. I in vivo indstilling, membran depolarisering, intracellulære Ca2 + stigning og dens diffusion til myofilamenter skal forekomme for myocytter til kontrakt, mens der i flået cardiomyocytes Ca2 + diffusion til myofilaments opstår straks, når cellen er nedsænket i Ca2 + opløsning. Denne hurtigere hastighed af Ca2 + diffusion vil bias myofilaments aktivering / deaktivering analyse23.

Disse eksperimenter er påvirket af forskellige faktorer, herunder temperatur, opløsning pH, mekanisk urolige (slack-re-stretch vs slap) og celle vedhæftet fil procedurer (pin slips vs lim), alle disse variabler tegner sig for litteratur uoverensstemmelser i form af ktr og sarcomere længde-afhængige stigning i kraft4,12.

Fremtidige fremskridt i teknikken omfatter udfører funktionelle undersøgelser i intakt snarere end permeabilized cardiomyocytes. Denne teknik har den ulempe at stole på kardiomyocytter frisk isoleret (ikke tidligere frosset). Et andet vigtigt spørgsmål, der ikke er direkte forbundet med denne metode, men som kan have en betydelig indvirkning på den, er relateret til den maksimale periode med frosset oplagring af stikprøver. Det er specifikt obligatorisk at fastsætte graden af nedbrydning af myofilament i hele opbevaringstiden (dvs. hvor længe frosne prøver kan opbevares for at sikre funktionelle data af god kvalitet fra de udtrukne kardiomyocytter).

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne takker Den Portugisiske Fond for Videnskab og Teknologi (FCT), Den Europæiske Union, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) og Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) til finansiering af UnIC (UID/IC/00051/2013) forskningsenhed. Dette projekt støttes af FEDER gennem COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), projektet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), støttet af det regionale operationelle program for Norte Portugal (NORTE 2020) under partnerskabsaftalen mellem Portugal 2020, gennem Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU), projektet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), støttet af europæiske struktur- og investeringsfonde, Lissabons regionale operationelle program 2020. Patrícia Rodrigues blev finansieret af FCT (SFRH/BD/96026/2013), og João Almeida-Coelho blev finansieret af Universidade do Porto/FMUP og FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 34580
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP) Sigma A2383
Calcium carbonate (CaCO3) Merck 1.02067.0500
Imidazole VWR 24720.157
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) Merck 1.05833.0250
Magnesium chloride solution (MgCl2 1M) Sigma M1028
N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES) Sigma B9879
Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr) Sigma P7936
Potassium chloride (KCl) Merck 1.04936.1000
Potassium hydroxide (KOH) Merck 8.14353.1000
Propionic acid (C3H6O2) Merck 8.00605.0500
Silicone Squeeze Tube Marineland 31003
Tritiplex (EGTA) Merck 1.08435.0025
Triton® X-100 10% Merck 648463
Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control) Terre Haute Glas-col
Length Controller (Model 315C-I) Aurora Scientific
Force Transducer (Model 403 A) Aurora Scientific
Software ASI 600A Aurora Scientific
Sotware VSL (Model 900B) Aurora Scientific
Inverted Microscope (IX51) Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leite-Moreira, A. M., et al. Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load. Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).
  2. Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Modulation of myocardial stiffness by β-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart. Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).
  3. Cokkinos, D. V. Introduction to Translational Cardiovascular Research. , Springer International Publishing. 371-387 (2015).
  4. van der Velden, J., Stienen, G. J. M. Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins. Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).
  5. Garnier, D. Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge. Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).
  6. Brady, A. J. Mechanical properties of isolated cardiac myocytes. Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).
  7. Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F. Chapter 20. Introduction to Translational Cardiovascular Research. Cokkinos, D. V. 20, Springer, Cham. 371-387 (2015).
  8. Liang, W. Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato. Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).
  9. Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers. Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).
  10. Huxley, A. F. Muscle structure and theories of contraction. Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).
  11. Sequeira, V., et al. Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness. Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).
  12. Edes, I. F., et al. Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes. American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).
  13. King, N. M., et al. Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells. Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).
  14. Hamdani, N., et al. Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model. Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).
  15. Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).
  16. Rodrigues, P. G., et al. Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle. American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).
  17. van der Velden, J., et al. Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction. Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).
  18. Wakili, R., et al. Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs. Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).
  19. Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch. Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).
  20. Falcao-Pires, I., et al. Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness. Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).
  21. Lim, C. C., et al. Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes. Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).
  22. Woulfe, K. C., et al. A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study. Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).
  23. Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. Exploring cardiac biophysical properties. Global Cardiology Science Practice. 2015, 10 (2015).

Tags

Medicin flået myocytter flået kardiomyocytter myokardi biopsier permeabiliserede kardiomyocytter hjertefunktion myofilamenter
In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonçalves-Rodrigues, P.,… More

Gonçalves-Rodrigues, P., Almeida-Coelho, J., Gonçalves, A., Amorim, F., Leite-Moreira, A. F., Stienen, G. J. M., Falcão-Pires, I. In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (160), e60427, doi:10.3791/60427 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter