Summary
Beskrivs är ett proteomik arbetsflöde för att identifiera protein interaktion partner från en nukleär subcellulär fraktion med hjälp av immunoaffinity berikning av ett givet protein av intresse och etikettfri masspektrometri. Arbetsflödet omfattar subcellulär fraktionering, immunoprecipitation, filterstödd provberedning, offlinerensning, masspektrometri och en nedströms bioinformatik-pipeline.
Abstract
Immunoaffinity rening masspektrometri (IP-MS) har vuxit fram som en robust kvantitativ metod för att identifiera protein-protein interaktioner. Denna publikation presenterar en komplett interaktion proteomik arbetsflöde som utformats för att identifiera låg förekomst protein-protein interaktioner från kärnan som också kan tillämpas på andra subcellulära fack. Detta arbetsflöde innehåller subcellulär fraktionering, immunoprecipitation, provberedning, offline Cleanup, Single-Shot etikettfri masspektrometri, och nedströms beräknings analys och datavisualisering. Vårt protokoll är optimerat för att upptäcka compartmentalized, låg överflöd interaktioner som är svåra att identifiera från hela cellen celllysat (t. ex., transkription faktor interaktioner i kärnan) genom immunoprecipitation av endogena proteiner från fraktionerade subcellulära fack. Provet beredning pipeline beskrivs här innehåller detaljerade anvisningar för beredning av HeLa cell kärn extrakt, immunoaffinity rening av endogent bete protein, och kvantitativ masspektrometri analys. Vi diskuterar också metodologiska överväganden för att utföra storskaliga immunoprecipitation i masspektrometri-baserade interaktions profilering experiment och ge riktlinjer för att utvärdera datakvalitet för att skilja sant positivt protein interaktioner från icke-specifika interaktioner. Detta tillvägagångssätt demonstreras här genom att undersöka den nukleära interactome av CMGC Kinas, DYRK1A, en låg förekomst proteinkinas med dåligt definierade interaktioner inom kärnan.
Introduction
Den mänskliga proteomen uppvisar stora strukturella och biokemiska mångfald genom bildandet av stabila multisubunit komplex och transienta protein-protein interaktioner. Följaktligen krävs identifiering av interaktions partner för ett protein av intresse ofta i utredningar för att riva upp molekylära mekanismen. Senaste framstegen inom affinitetsrenings protokoll och tillkomsten av högupplöst snabb skanning masspektrometri instrumentering har möjliggjort enkel kartläggning av protein interaktion landskap i en enda opartisk experiment.
Protein interaktions protokoll använder ofta ektopiska uttrycks system med affinitetsmärkta fusions konstruktioner för att identifiera proteininteraktioner utan att behöva högkvalitativa antikroppar som erkänner ett protein av intresse1,2. Emellertid, epitop tagg-baserade metoder har flera nackdelar. Fysiska interaktioner med epitopen kan leda till detektion av icke-specifika copurifying proteiner3. Dessutom, fusion av dessa epitop taggar till N-eller C-terminalen av ett protein kan blockera infödda protein-protein interaktioner, eller störa proteinveckning för att främja icke-fysiologiska konformationer4. Dessutom överuttrycker ektopiska uttrycks system vanligtvis bete proteinet vid suprafysiologiska koncentrationer, vilket kan resultera i identifiering av Artifakt proteininteraktioner, särskilt för dos känsliga gener5. För att kringgå dessa frågor, kan det endogena bete proteinet immunoprecipitated tillsammans med tillhörande samverkande bytes proteiner, förutsatt tillgången på en högkvalitativ antikropp som erkänner det inhemska proteinet.
Här finns en interaktion proteomik arbetsflöde för att upptäcka den nukleära interactome av ett endogent protein med hjälp av CMGC proteinkinas DYRK1A som ett exempel. Störningar av DYRK1A kopierings nummer, aktivitetsnivå eller uttryck kan orsaka allvarliga intellektuella funktionshinder hos människor, och embryonal dödlighet hos möss6,7,8,9. DYRK1A uppvisar dynamisk spatiotemporal regulation10, och uppdelade proteininteraktioner11,12, som kräver metoder som kan upptäcka låg överflöd interaktion partner specifika för olika subcellulära fack.
Detta protokoll sysselsätter cellulär fraktionering av mänskliga HeLa celler i Cytosol och nukleoplasm fraktioner, immunoprecipitation, provberedning för masspektrometri, och en översikt av en bioinformatisk pipeline för att utvärdera datakvalitet och visualisera resultat, med R-skript som tillhandahålls för analys och visualisering (figur 1). Proteomik mjukvarupaket som används i detta arbetsflöde är alla fritt tillgängliga för nedladdning eller kan nås via ett webbgränssnitt. För ytterligare information om programvara och beräkningsmetoder finns djupgående handledningar och instruktioner tillgängliga på de länkar som tillhandahålls.
Protocol
Anmärkning: alla buffertsammansättningar och proteasblandningar beskrivs i tabell 1.
1. beredning av celler
Anmärkning: ett utgångsmaterial på 1 − 10 mg nukleärt lysat per replikat önskas för denna immunoprecipitation masspektrometri (IP-MS) metod. Cell mängder kommer att ges för 1 mg nukleära immunoprecipitation i tre exemplar plus tre tre exemplar kontroller.
- Om du använder en anhängare cellinjer, växa cellerna till 90% confluency i 3 x 15 cm rätter per replikat före skörd.
Anmärkning: det rekommenderas att utföra minst tre replikationer immunoprecipitations för bete och kontrollvillkor. Detta protokoll kommer att anta användningen av "pärlor bara" kontroller, som kontroll för riklig ospecifik interaktioner med pärlorna, med början i avsnitt 4. Andra typer av kontroller kan vara användbara. Dessa beskrivs ingående i diskussionsavsnittet.- Tvätta plattorna 2x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och trypsinize celler med 3 mL 0,25% trypsin per 15 cm plåt. Snurra ner cellerna på 1 200 x g för 5 min och Dekantera den trypsin.
- För suspensions celler, växa till en liknande skala/densitet för att uppnå 70 − 80 mg totalt protein.
- Pellets celler vid 1 200 x g och 4 ° c i 5 min. dekanera mediet noggrant.
Obs: pellets kan kombineras under detta steg för att möjliggöra effektiv bearbetning med hjälp av storskalig subcellulär fraktionering beskrivs i avsnitt 2.
- Pellets celler vid 1 200 x g och 4 ° c i 5 min. dekanera mediet noggrant.
- Tvätta cellpelleten 2x med PBS + 5 mM MgCl2 kompletterad med proteashämmare (Pis) och Fosfatashämmare (PhIs) (se tabell 1).
Obs: cell pellets kan vara blixt nedfrysta i flytande kväve och lagras vid-80 ° c tills den är klar för fraktionering.
2. beredning av kärn extrakt
Anmärkning: proteas och fosfatashämmare bör tillsättas till fraktioneringbuffertarna inom 30 minuter efter användning.
- Om fryst, Tina cell pellets för 15 min i 1x pellets volym av kall buffert A + PIs/PhIs. Placera cellpelleten på en nutator vid 4 ° c till stöd i resuspension medan upptinning. Annars, Omsuspendera cellpelleten från steg 1,3 till 1x pelletvolymbuffert A + PIs/PhIs.
- Pellets vid 2 000 x g och 4 ° c i 10 min. dekanera bufferten.
- Suspendera cellerna med 5x packade cell volymen med buffert A och inkubera på is för 20 min.
- Pellets vid 2 000 x g och 4 ° c i 10 min. dekanera bufferten och Omsuspendera cellerna under med 2x ursprungliga packade cell volym buffert A + Pis/PhIs och dounce ~ 7X med "A"/Lös mortelstöt.
- Centrifugera lysatet i 10 min vid 2 000 x g och 4 ° c.
- Pipettera försiktigt bort supernatanten och blixt frysningen med flytande kväve. Förvara lysatet vid-80 ° c. Den supernatanten från detta steg är den cytosoliska subcellulära fraktionen.
Anmärkning: den nukleära pelleten kan sparas under detta steg genom att blixten fryser med flytande kväve och lagrar vid-80 ° c - Omsuspendera pelleten med 0,9 x pelletvolym av buffert B + PIs/PhIs och blanda på en nutator i 5 min vid 4 ° c.
- Att lyse kärvar, dounce 20x med en stramare mortelstöt "B".
- Blanda den nukleära lysat på en nutator i 30 min vid 4 ° c så att den är homogen.
- Centrifugera det nukleära lysatet i 30 min vid 21 000 x g vid 4 ° c. Pipettera bort supernatanten och Spara som ett lösligt kärn proteinextrakt.
Anmärkning: Nukleasbehandling av den resulterande nukleära pelleten möjliggör återvinning av en kromatin-associerad proteinfraktion. - Dialysera det lösliga kärn extraktet mot buffert C + PIs under 3 h vid 4 ° c.
- Skär en lämplig längd av 24 mm bredd dialys slang med en 8 kDa molekylvikt avskurna. Kläm fast ena sidan av slangen och ladda nukleoplasm i röret. Efter lastning av lysat, klämma den andra änden och dränk in i en ren glasbehållare som innehåller buffert C + PIs.
- Centrifugera det dialyserade kärn extraktet/nukleoplasm vid 21 000 x g vid 4 ° c i 30 min. alikvot 3x 20 μl volymer av kärn extrakt för fraktionering validering av Western blot. Det nukleära extraktet som används för IP-MS-analys kan aliciteras och blinka i flytande kväve och lagras vid-80 ° c, om det behövs.
3. validering av subcellulär fraktionering
- Slutföra ett protein test för att bestämma protein koncentrationen av nukleär lysat. En och syra proteinanalys ger tillräcklig känslighet för nedströmsanvändning.
- Ladda 20 μg av både cytosoliska och nukleära fraktioner på en SDS-Page gel för Western blot analys som tidigare beskrivits13. Hoppa över körfält vid lastning för att undvika fel i ett prov.
- Sond Western blot för P84 (THOC1) som en nukleär markör, och GAPDH som en cytosolisk markör. Bestäm omfattningen av fraktionering med förhållandet mellan cytosoliska markör i den nukleära fraktionen och vice versa.
Observera: antikroppar mot andra nukleära och cytosoliska markörer kan användas.
4. immunoprecipitation av endogent kärn bete protein
Obs: det rekommenderas att använda låg retention rör från denna punkt på. Detta kommer att minska icke-specifik bindning till rören under provhantering och undvika onödig förlust av provet. Kontrollera dessutom att LCMS grade H2O används för att förbereda buffertar för de återstående stegen.
- Förbered en protein A/G-pärlblandning för varje replikat genom att kombinera 12,5 μL pärlvolym för både protein-A och protein-G i mikrocentrifugrör. Förvara pärllagren som en flytgödsel som innehåller 20% etanol. Bestäm koncentrationen av pärlor i flytgödsel% (v/v) och Pipettera den nödvändiga volymen med hjälp av en pipett spets som har skurits på spetsen för att säkerställa att pärlorna kan komma in i spetsen.
- Tvätta proteinet A/G-pärlblandningen 2x med 300 μL IP-buffert 1. Snurra pärlorna vid 1 500 x g vid 4 ° c i 1 min och Dekantera buffert.
- Förbered antikropp-protein A/G-pärlor: för att binda antikroppen till pärlorna, tillsätt 300 μL IP-buffert 1 och 10 μg av önskad antikropp. Låt pärla/antikropp blandningen klippa på en nutator vid 4 ° c över natten. För endast pärlkontroller ska du inte lägga till någon antikropp.
Anmärkning: totalt 10 μg antikropp per replikat kan användas som utgångspunkt, men det exakta beloppet kommer att behöva optimeras för varje enskild antikropp och skalan av lysat som används i experimentet - Tina de nukleära lysaterna från steg 2,10 i ett vattenbad och alikvoter lämpliga volymer till låg retention mikrocentrifug rör för 1 mg protein input per replikat.
- Snurra lysat på 16 000 x g i 30 min och överföra supernatanten till ett nytt rör.
- Tillsätt 1 μl bensonas (250 enheter/μl) per 1 mg av den nukleära lysat och rock på en nutator vid 4 ° c i 10 − 15 min.
- Förbered pärlor för preclearing den lysate. Tillsätt 12,5 μL av varje protein A-och protein G-pärlor till 1,5 mL låg hållnings rör som i steg 4,1. Tvätta 2x med IP tvättbuffert 1 + PIs och dekanera bufferten.
- Tillsätt 1 mg av den nukleära lysat till pärlorna från steg 4,5. Inkubera medan du skakar på en nutator i 1 h vid 4 ° c.
- Centrifugera celllysat vid 1 500 x g och 4 ° c i 1 min.
- Medan nukleära celllysat inkuberar med pärlor i steg 4.5.1, tvätta antikropp-protein A/G pärlor 2x med IP buffert 1 + Pis. Centrifugera vid 1 500 x g och 4 ° c i 1 min och dekanera bufferten.
- Överför den precleared nukleär lysate från steg 4.6.1 till antikropp-protein A/G pärlor. Inkubera medan du skakar på en nutator vid 4 ° c i 4 h. Centrifugera efter inkuberingen vid 1 500 x g och 4 ° c i 1 min.
- Överför supernatanten till rör som är märkta som flödet genom för varje replikat.
- Tvätta antikropp-protein A/G-pärlorna med 1 mL IP-buffert 2 + PIs. Centrifugera vid 1 500 x g och 4 ° c i 1 min, decantbuffert och upprepa för totalt 3x.
- Tvätta pärlorna 2x med 1 mL IP-buffert 1 + PIs-centrifugering som i föregående steg. Se till att all buffert tas bort efter den sista tvätten.
- Elute 2x med 20 μL av 0,1 M glycin (pH 2,75) för 30 min vardera. Se till att rören skakar under inkuberingen med elueringbufferten. Snurra på 750 x g och 4 ° c i 1 min och Pipettera av supernatanten efter varje 30 min inkubation.
Obs: medan den låga pH glycin metod som beskrivs här eluera mest bete proteiner, vissa antikropp-antigen interaktioner kräver strängare buffertförhållanden. - Blixt frysningen eluerar i flytande kväve och förvaras vid-80 ° c.
5. provberedning
Anmärkning: insulin spetsade till immunoprecipitation elueringprover stöd i återhämtningen av proteiner under triklorättiksyra (TCA) nederbörd och provbearbetning, vilket är viktigt för lågt överflöd endogena bete proteiner.
- Tina eluaterna vid rumstemperatur om de är frysta.
- Placera proverna på is och tillsätt 10 μL 1,0 mg/mL insulin för varje 100 μL eluat. Vortex och tillsätt sedan omedelbart 10 μL 1% natriumdeoxycholat. Virvel provet igen och tillsätt 30 μL 20% TCA följt av en sista Vortex.
- Inkubera proverna på is under 20 min och centrifugera vid 21 000 x g vid 4 ° c i 30 minuter.
- Sug upp supernatanten och tillsätt 0,5 mL aceton som har förkyld till-20 ° c. Vortex och snurra sedan på 21 000 x g och 4 ° c i 30 min. Upprepa detta steg.
- Aspirera på supernatanten och lufttorka pelleten kvar i botten av röret.
- Förbered provet för masspektrometri med hjälp av en modifierad Filterstödd prov prep metod (FASP), optimerad för att minska provhanteringen, enligt beskrivningen nedan14.
- Omsuspendera proteinpelleten från steg 5.1.4 med 30 μL SDS Alkylationsbuffert (se tabell 1). Inkubera provet på ett värmeblock på 95 ° c i 5 min. Låt den svalna i rumstemperatur i 15 min före föregående till nästa steg.
- Tillsätt 300 μL UA-lösning och 30 μL 100 mM TCEP till varje prov. Ladda denna lösning på ett 30k centrifugalfilter. Snurra centrifugalfiltret på 21 000 x g vid rumstemperatur i 10 min.
Anmärkning: bete protein och dess förmodade interactmedlemmar bör vara bunden till filtret på denna punkt. Men flödet genom kan hållas, om det finns ett problem med filtret. - Tvätta filtret med 250 μL UA och centrifugera vid 21 000 x g i 10 min. dekanera flödet genom och upprepa för totalt 3x.
- Tvätta filtret med 100 μL 100 mM Tris pH 8,5 och centrifugera vid 21 000 x g under 10 min. dekanera flödet genom och upprepa för totalt 3x.
- Tillsätt 3 μL 1 μg/μL LYS C återsuspenderat i 0,1 M Tris pH 8,5. Fyll filtren upp till 100 μL-märket och låt smälta i 1 h vid 37 ° c medan du skakar på en nutator.
- Tillsätt 1 μL av 1 μg/μL MS-lönegrad trypsin. Blanda försiktigt och låt trypsin att Inkubera med provet över natten vid 37 ° c medan gunga på en nutator.
- Centrifugera vid 21 000 x g i 20 min för att eluera peptiden från filtret.
Obs: flera omgångar centrifugering kan krävas för att återvinna alla eluatet. Om detta inte görs, det finns en risk för svår prov förlust.
- Desalt peptiderna med hjälp av C18 spin kolumner. Följ det protokoll som tillhandahålls av tillverkaren.
- Omsuspendera den frystorkade peptiden i 7 μL 0,1% TFA i 5% acetonitril. Sonikera provet i 3 minuter för att säkerställa att peptiderna har återsuspenderas. Snurra ner på 14 000 x g i 10 min.
- Överför den återsuspenderade peptiden till en lämplig provflaska för lastning på vätskekromatografi – masspektrometri (LC/MS)-systemet.
6. system lämplighet för LC/MS
Anmärkning: på grund av den lilla skalan och generellt lägre överflöd av protein från affinitetsrenade prover, är det viktigt att LC/MS-plattformen fungerar med en maximal känslighet och robusthet.
- Tillsätt 1 mL LC/MS grade myrsyra till 1 liter LC/MS grade vatten för mobil fas A, och tillsätt 1 mL LC/MS grade myrsyra till 1 L LC/MS grade acetonitril för mobilt fas B.
- Förbered eller installera en 75 μm smält kiseldioxid kapillärkolonn packad med < 2 μm omvänd fas C18 harts som är ≥ 250 mm i längd. Bästa resultat kommer att göras med en direkt injektion av prover i kolonnen.
- Rensa Ultra Performance vätskekromatografi (UPLC) system med friska mobila faser. Med en C18-kolonn installerad, upprätta en stabil flödeshastighet och elektrospray med en lämplig sändare (dvs. 20 μm ID x 360 μm OD dras till en 10 μm spets). Behåll kolonnen vid 40 − 60 ° c.
- Testa den övergripande LC/MS systemprestanda genom att injicera en komplex kvalitetskontroll standard, såsom 100 − 200ng av en hela hel cell lysate tryptic Digest. Eluten med lämplig gradient för ett komplext prov (dvs. 2 − 3 h gradientelueringstid). Fastställa en baslinje systemprestanda av peptid och protein identifieringar.
Obs: för bästa resultat ger 3000 − 5000 eller fler proteinidentifieringar från 20000 − 35000 unika peptider optimala prestanda för experimentella prover. - För rutinmässig LC/MS system lämplighet, injicera 100 − 200 fmol eller mindre av en enda protein Digest standard, såsom bovint serum albumin (BSA). Med en kort gradient (dvs. 20 − 30 min).
Anmärkning: multipla injektioner av ett protein sammandrag kommer att bidra till att fastställa baseline LC/MS systemprestanda, och upprepa injektion efter varje IP-MS-prov ger ett mått på systemets prestanda i hela experimentet och möjliggör detektering av instrument drift, som kan bias etikettfria experiment. En baslinje för de Välj enskilda toppintensiteter och Peak former kommer att informera om MS, LC, och kolumn prestanda. - För att undvika överbelastning av analys kolonnen, ladda en liten portion (15 − 30% av den totala) av ett experimentellt prov på kolonnen och separera med hjälp av en gradient som lämpar sig för komplexa prover (dvs 2 − 3 h). Om antalet protein identifieringar inte är tillfredsställande läser du in hela provet i kolumnen.
- Kör en enda protein Digest standard mellan proverna för att övervaka LC/MS systemprestanda och provöverföring. Flera standarder kan krävas för att minska provöverföring beroende på dina prover.
7. data behandling
- Data överför den proteomik mjukvaran packe maxquant grunda på https://www.maxquant.org/.
ANMÄRKNINGAR: detta kommer att användas för att bearbeta rå MS-datafilen från steg 6,6 till datatabeller av protein-ID, gen namn och kvantitativa värden som är associerade med identifieringen av dessa för nedströms analys.- Välj Läs in i under rubriken indata på fliken RAW-data . Öppna filens plats där MS Raw-filerna lagras och välj RAW-filer för varje MS/MS-körning.
- Klicka på fliken gruppspecifik och välj matsmältning. Inom enzym listan väljer du Lysc och klickar på högerpilen för att lägga till detta enzym i listan som kommer att användas i sökningen. Välj sedan instrument och kontrollera att rätt instrumenttyp visas i den nedrullningsbara listan överst på skärmen. Lämna andra gruppspecifika sökparametrar i standardinställningar.
- Klicka på fliken globala parametrar och välj sekvenser. Lägg till lämplig FASTA-fil för taxonomin som ska användas i den här sökningen. Peptider kommer inte att tilldelas på rätt sätt om detta inte görs. För den mänskliga proteomen, Ladda ner FASTA-filen från UniProt på https://www.uniprot.org/help/human_proteome.
- Klicka på Proteinkvantifieringpå fliken globala parametrar . I den nedrullningsbara menyn peptider för beräkning väljer du Unique + Razor.
Obs: MaxQuant erbjuder alternativ kvantifiering av proteiner genom intensitetsbaserad absolut kvantifiering (iBAQ) och etikettfri kvantifiering (LFQ). Emellertid, peptid räkna information är tillräcklig för nedströms analys i detta protokoll15. - Längst ned till vänster i MaxQuant-gränssnittet väljer du antalet processorer som ska användas för sökningen. Detta kommer att direkt påverka längden på den tid som krävs för körningen, så välj så många som möjligt för detta). Klicka på Start nere till vänster på skärmen för att starta körningen. Välj fliken prestanda längst upp på skärmen för att visa förloppet för sökningen.
- När körningen har slutförts, öppna den proteingroups. txt filen i Perseus, en proteomik beräkningsplattform, eller andra kalkylprogram för att visa data16.
- Använd Perseus för att ta bort vanliga föroreningar och träffar på omvända proteinsekvenser. Följ den detaljerade dokumentationen för Perseus på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
Anmärkning: öppna filen proteingroups. txt i analysprogram (t. ex. Excel) kommer automatiskt att korrumpera vissa gen-och protein namn.
- Använd Perseus för att ta bort vanliga föroreningar och träffar på omvända proteinsekvenser. Följ den detaljerade dokumentationen för Perseus på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
- Analysera experimentella data med hjälp av det kontaminerande lagret för affinitetsrening (CRAPome). Registrera ett konto på detta repository http://crapome.org/och följ handledningen som behövs17,18.
- Använd den analysera ditt data arbetsflöde finns på CRAPome hemsida. Välj externa kontroller som motsvarar det tillhörighets reningssystem som används i det här interaktions experimentet.
ANMÄRKNINGAR: dessa kontroller kan användas för att beräkna en andra faldig förändring berikning som är användbar för att upptäcka vanliga föroreningar. - Generera en indatafil från proteingroups. txt-utdata från MaxQuant med hjälp av Perseus eller ett lämpligt kalkylbladsprogram. Information om manuell formatering finns på http://crapome.org/?q=fileformatting. Alternativt kan du använda det medföljande R-skriptet "export_CRAPomeSAINT_Input_File. R" för att generera indatafilen SAINT/CRAPome. Se README. txt i de kompletterande Kodningsfiler.
- Kör en analys för att avgöra vik-Change anrikning och SAINT (signifikans analys av INTeractome) sannolikhet för varje bete protein i immunoprecipitation. Se till att "User Controls" är valt i rullgardinsmenyn under FC-A, "crapome Controls" eller "all Controls" väljs i FC-B listrutan och sannolikheten Poäng väljs för att generera Saint sannolikheter. När körningen har slutförts kan du visa utdata som är tillgängliga under "analysresultat" tillsammans med ett jobb-ID. Ladda ner data Matrix från "analysresultat" för framtida plottning och datavisualisering.
- Använd den analysera ditt data arbetsflöde finns på CRAPome hemsida. Välj externa kontroller som motsvarar det tillhörighets reningssystem som används i det här interaktions experimentet.
- Rita proteiner som en funktion av FC-A (IPs vs. User Controls) och SAINT sannolikhet genom att följa R-skript som anges i kompletterande Kodningsfiler.
Anmärkning: en uppsättning R-skript tillhandahålls för att producera tomter av FC-A vs. SAINT sannolikhet och iBAQ vs. log2 (protein överflöd), färgade av den justerade p värdeintervallet från empiriska Bayes analys av den märkfria intensiteter. Detaljerna i differential statistisk analys och plottning finns i README. txt och R-script "main_differential_analysis. R "i de kompletterande Kodningsfiler. - Utvärdera var kända samverkande proteiner av bete protein rankas av FC-A och SAINT. Gör en cutoff av FC-A > 3,00 och SAINT > 0,7 för enstaka bete experiment i tre exemplar som utgångspunkt.
Anmärkning: val av cutoffs för en "hög-förtroende" interactkamrat och en "låg-förtroende" interactkamrat måste informeras av biologisk information.
8. visualisering av data
Obs: det finns många program som effektivt kan visualisera proteomik data (t. ex., R, Perseus, Cytoscape, STRING-DB). Analysera anslutningen mellan högt förtroende träffar, och funktionell berikning av dessa interactmedlemmar kan vara en användbar strategi för att prioritera träffar för ytterligare validering och funktionell karakterisering.
- Ladda ner Cytoscape, ett open source nätverk visualiseringsverktyg på https://cytoscape.org/download.html19.
- Förbered en indatafil för interaktionsdata som en tabbavgränsad fil formaterad med tre kolumner: bete (källnod), byte (målnod), typ av interaktion (Kanttyp). Detta kan göras i Perseus eller något kalkylprogram som du väljer.
- Välj den Importera tabell från fil ikonen mot överst till vänster i programmet (anges av en nedåtpil och en matris i ikonen). Cytoscape kommer automatiskt att fylla i interaktionsdata till ett nätverk redo för anpassad formatering och design.
- Välj fliken stil på Kontrollpanelen för cytoscape och klicka på rutorna i def -kolumnen för att justera attributet för hela nätverket. Välj specifika noder eller kanter i nätverket och markera sedan kvadraten i kolumnen Byp. i menyn stil för att kringgå standardinställningarna och endast justera markerade objekt. Du kan också klicka på rullgardinsmenyn högst upp på menyn stil för att visa de förinställda nätverks formaten.
Anmärkning: STRING-DB protein-protein interaktionsdata kan integreras i detta nätverk vid denna tid antingen manuellt via indatafilen eller genom olika beriknings verktyg tillgängliga som plug-ins i Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. En rekommenderad cytoscape plug-in för beriknings analys finns på http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. - För att öka förtroendet för datauppsättningen som genereras i detta arbetsflöde, utför ömsesidiga IP-MS-eller IP-västerländska experiment som riktar sig till bytes proteiner av intresse som bete.
Representative Results
Majoriteten av proteinmassan som identifierats i ett IP-MS-experiment består av icke-specifika proteiner. Således är en av de viktigaste utmaningarna med ett IP-MS-experiment tolkningen av vilka proteiner är hög-förtroende interactmedlemmar kontra ospecifika interactmedlemmar. För att demonstrera de avgörande parametrarna som används i utvärderingen av datakvaliteten studien analyserade tre exemplar immunoprecipitations från 5 mg hela nukleärt extrakt utnyttjar en pärla endast kontroll. Den första interna kontrollen för att säkerställa att ett IP-MS-experiment är tillförlitligt är om bete proteinet rankas som en av de högsta anrikade proteiner som identifierats av både Fold-förändring över kontroll och SAINT sannolikhet. I detta fall, betet DYRK1A rankas bland de tre berikade proteiner över kontrollen (figur 2A,B). I en nukleär interactome studie av DYRK1A utnyttjar fyra oberoende antikroppar, en FC-a cutoff av > 3.00 och Saint sannolikhet cutoff > 0,7 förutsatt en strikt cutoff för identifiering av både nya och tidigare validerade interactmedlemmar22. När det tillämpas på detta experiment, en tydlig separation kan ses mellan hög-förtroendeinteractors och > 95% av copurified proteiner identifierats som icke-specifik (figur 2A,B). Tillämpa både en faldig förändring anrikning och sannolikhet tröskel ökar stränghet genom att kräva en genomgående hög berikning av protein-ID över biologiska replikat.
Förutom statistiska scoring, den CRAPome analys arbetsflödet också kartor tidigare rapporterade interaktioner på bete-Prey data23. Även om den här mappningen kan vara användbar för tröskelvärde för höga och låga förtroende interaktioner, tidigare rapporterade interaktioner kan få dåligt resultat av FC-A och SAINT sannolikheter, potentiellt tyder på att många kända interaktioner av ett visst bete kan existera endast i specifika celltyper, sammanhang eller organeller. För exempel DYRK1A dataset var iref interactkamrat FC-A-värden så låga som 0,45, vilket motsvarade en mycket låg anrikning över kontroll (figur 2C). För att undvika att inflationen av falska positiva identifieringar, statistiska tröskelvärde bör utföras på ett sätt som prioriterar stränghet över minskning av falska negativ. Det bör noteras att upptäckten av dessa interaktioner var oberoende av protein överflöd (figur 2C). Beräknat absolutkopieringsnummer för varje iREF-interaktion inom HeLa cells visade inget samband med detekterings nivåerna hos en interaktions partner med IP-MS24.
Cytoscape fungerar som ett effektivt verktyg för att visualisera flera lager av interaktionsdata19. I DYRK1A immunoprecipitation experiment som beskrivs här, kombinerade användningen av FC-A > 3,0 och SAINT > 0,9 minskat listan över hög-förtroendeinteractors till sex proteiner (figur 2D). Men vid tillämpningen av en FC-A cutoff av > 3,0 i isolering, åtta ytterligare proteiner lades till nätverket. Dessa ytterligare protein interactmedlemmar har hög anslutning med interactmedlemmar redan i nätverket, vilket tyder på att de är associerade i liknande komplex eller funktionella roller. För detta ändamål, bevis från STRÄNGEN-DB av protein-protein interaktioner integrerades i detta nätverk som blå streckad linjer20. Medan detta Single-Bait, tre exemplar experiment ger ett begränsat urval av hela DYRK1A interaktion nätverk, användning av ytterligare beten, replikat, och integration av stora offentliga datamängder kan användas för att utöka nätverket av hög-förtroende interaktioner. De statistiska cutoffs kommer därför att vara specifika för varje enskilt experiment och kommer att behöva utvärderas grundligt.
Bild 1: representativ proteomik arbetsflöde för subcellulära IP-MS. Celler odlas i antingen 4 L runda botten kolvar eller 15 cm vävnad kultur rätter och skördas samtidigt för subcellulär fraktionering. Celler är fraktionerade till en cytosolic, kärnkraft, och en nukleär pellet, och immunoprecipitations görs från 1 − 10 mg av nukleärt lysat med hjälp av en eller flera antikroppar erkänner samma bete. Filter Aided prov prep (FASP) och offline prov rensning utförs före Single Shot masspektrometri. En nedströms beräkningspipeline används för att bearbeta data till tolkningsbara interaktionsdata. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa data för ett enbetes-IP-MS-experiment med en enda antikropp. (A) FC-A och Saint sannolikhet utdata från CRAPome analys arbetsflöde för ett optimalt experiment med en enda antikropp för Kinas DYRK1A (n = 3). Pärlor-endast kontroller användes för jämförelse. Röda heldragna linjer representerar cutoffs i FC-A > 3,00 och SAINT > 0,7. (B) maxquant protein Abundance skattningar (iBAQ) output kontra log2 förhållande av protein överflöd i DYRK1A IP för att kontrollera, färgade av den justerade p värdeintervallet från empiriska Bayes analys av de märkfria intensiteter. C) FC-A och uppskattat antal kopior av proteiner som är förtecknade som interagerande proteiner i iref-databasen23,24. (D) Cytoscape nätverk visualisering av DYRK1A interactors. Blå noder = FC-A > 3,00, SAINT > 0,7. Orange noder = FC-A > 3,00. Svarta kanter = proteiner identifierade som interactmedlemmar i IPMS-experiment. Blå streckad kant = SAINT interaktion mellan bytes protein (konfidens >. 150). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Proteashämmare (PI) blandning | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| Natriummetabisulfit | 1 mM |
| Tillförordnade | 1 mM |
| Ditiothreitol (DTT) | 1 mM |
| Fenylmetanesulfonylfluorid (PMSF) | 0,25 mM |
| Foshatashämmare (PhI) blandning | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| Microcystin LR | 1 μM |
| Natrium Orthovanadate | 0,1 mM |
| Natriumfluorid | 5 mM |
| Subcellulära fraktioneringbuffertar: | |
| Buffert ett pH 7,9 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| HEPES | 10 mM |
| MgCl2 | 1,5 mM |
| KCl | 10 mM |
| Buffert B pH 7,9 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| HEPES | 20 mM |
| MgCl2 | 1,5 mM |
| Nacl | 420 mM |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) | 0,4 mM |
| Glycerol | 25% (v/v) |
| Buffert C pH 7,9 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| HEPES | 20 mM |
| MgCl2 | 2 mM |
| KCl | 100 mM |
| Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) | 0,4 mM |
| Glycerol | 20% (v/v) |
| Buffertar för immunoprecipitation: | |
| IP-buffert 1 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| HEPES | 20 mM |
| KCl | 150 mM |
| Edta | 0,1 mM |
| NP-40 | 0,1% (v/v) |
| Glycerol | 10% (v/v) |
| IP-buffert 2 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| HEPES | 20 mM |
| KCl | 500 mM |
| Edta | 0,1 mM |
| NP-40 | 0,1% (v/v) |
| Glycerol | 10% (v/v) |
| SDS alkylering buffert pH 8,5 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| Sds | 4% (v/v) |
| Kloracetamid | 40 mM |
| TCEP | 10 mM |
| Tris | 100 mM |
| UA pH 8,5 | |
| Reagens | Slutliga koncentrationen |
| Urea | 8 M |
| Tris | 0,1 M |
| * Använd HPLC-kvalitet H2O | |
Tabell 1: Buffertsammansättningar
Kompletterande Kodningsfiler. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Den proteomik arbetsflöde som beskrivs här ger en effektiv metod för att identifiera högt förtroende protein interactmedlemmar för ett protein av intresse. Den här metoden minskar urvalet komplexitet genom subcellulära fraktion och fokuserar på att öka identifiering interaktion partner genom robust provberedning, offline prov städa upp och strikt kvalitetskontroll av LC-MS-systemet. Nedströms dataanalys som beskrivs här möjliggör en enkel statistisk utvärdering av de proteiner som identifierats som copurifying med betet. Men på grund av ett stort antal experimentella variabler (skala, cellinje, antikropps val), varje experiment kräver olika cutoffs och överväganden när det gäller datavisualisering och berikning.
Den första utformningen övervägande i ett IP-MS-experiment är valet av antikroppar som kommer att användas för copurification av proteinet av intresse tillsammans med dess samverkande partners. Även om tillgängligheten av kommersiella antikroppar har expanderat för att täcka större delar av den mänskliga proteomen under de senaste decennierna, finns det fortfarande många proteiner som reagenser är begränsade. Dessutom kan antikroppar som har validerats för tillämpningar som västerländsk blot-detektion vara oförmögna att selektivt berika målproteinet i ett experiment med immunoprecipitation. Innan man genomför en storskalig interaktion proteomik experiment, det föreslås att slutföra en IP från en 90% konfluenta 10 cm skålen, eller motsvarande cell nummer, och sond för målet protein av intresse genom Western blotting. Om mer än en enda antikropp är tillgänglig för immunoprecipitation, det föreslås dessutom att välja flera antikroppar erkänna epitoper inom olika delar av proteinet. Bindningen av en antikropp till ett bete protein kan ockludera det nödvändiga bindnings gränssnittet för förmodade samverkande partners. Val av en sekundär epitop för bete protein kommer att öka täckningen av interaktionsprofilen identifierats av en masspektrometri-baserade experiment.
En andra viktig faktor ligger i valet av lämplig kontroll för att särskilja hög-förtroende interaktioner från lågt förtroende eller ospecifik interaktion från dem som identifierats som copurifying med betet. Den strängaste kontrollen för ett IP-MS-experiment är att slutföra immunoprecipitation från en CRISPR KO-celllinje i betet. En sådan kontroll möjliggör identifiering och filtrering av icke-specifika proteiner som binder direkt till antikroppen snarare än bete proteinet. I de fall där det inte är möjligt att generera en CRISPR KO-celllinje av varje bete protein, kan en IgG-pärlkontroll av samma isotyp av betes antikropp användas. I experiment som sysselsätter en panel av antikroppar som representerar flera arter, kan användningen av en pärlor endast kontroll vara lämpligt, men kommer att öka andelen falska positiva identifieringar som hög-förtroende interactors.
Valet av den cellrad som används i ett IP-MS-experiment är beroende av flera nyckelfaktorer. Protein uttryck och lokalisering är till stor del beroende av celltyp. Även om RNA uttrycks uppskattningar kan hittas för de flesta gener i många vanliga cellinjer, är protein uttrycket dåligt korrelerat med RNA-uttryck och måste bestämmas experimentellt25. Cellinjer där ett bete protein uttrycks i mycket låg kopienummer bör undvikas för att kringgå problem i samband med drastiska ökningar i cellkultur skala som kan krävas. Det bör dock noteras att provberedning kan optimeras för detektion av mycket låg förekomst proteiner. Den filterstödda prov prep-metoden (FASP), samtidigt som den är robust, kan orsaka mer än 50% förlust av peptid i ett prov. Single-Pot solid-fas-förstärkt Provberedning (SP3) är en effektiv metod för att generera prover för masspektrometri analys som minimerar prov förlust26. Den ökade återhämtningen som möjliggörs av SP3-metoden för provberedning kan vara ett användbart alternativ i detta arbetsflöde för kvantifiering av proteiner som faller nära detektionsgränsen.
Denna proteomik arbetsflöde har tillämpats på många nukleära beten, inklusive kinaser, E3 ubiquitin Ligaser och ställningar medlemmar av multisubunit komplex. Förutsatt korrekt validering av antikropp reagenser, framgångsrikt genomförande av detta arbetsflöde kommer att resultera i detektion av hög-förtroende protein kärn interaktion partners för ett protein av intresse.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en stor utmaning bidrag till W.M.O. från Linda Crnic Institute for Down syndrom och av en DARPA samarbetsavtal 13-34-RTA-FP-007. Vi skulle vilja tacka Jesse Kurland och Kira Cozzolino för deras bidrag i läsning och kommentera manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
| acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
| benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
| HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
| Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
| Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
| p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
| Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
| Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
| TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
| TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
| Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
| Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
| Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |
References
- Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
- Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
- Mahmood, N., Xie, J. An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
- Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A.
- Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
- Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
- Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
- Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
- Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
- Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
- Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
- Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
- Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
- Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
- Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
- Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).
