Summary
وصف هو سير العمل البروتيني لتحديد الشركاء تفاعل البروتين من كسر الخلوية النووية باستخدام التخصيب المناعي للبروتين معين من الفائدة والطيف الكتلة خاليه من التسمية. يتضمن سير العمل التجزئة الخلوية ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينة بمساعده الفلتر ، والتنظيف دون اتصال ، وقياس الطيف الكتلي ، وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصب.
Abstract
وقد برز مقياس الطيف الكتلي لتنقيه المناعة (IP-MS) كطريقه كميه قويه للتعرف علي تفاعلات البروتين والبروتين. يقدم هذا المنشور التفاعل الكامل بروميكس سير العمل المصممة لتحديد التفاعلات البروتينية البروتين منخفضه الوفرة من النواة التي يمكن أيضا ان تطبق علي مقصورات فرعيه أخرى. يتضمن سير العمل هذا تجزئه الخلايا الفرعية ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينات ، والتنظيف دون اتصال ، وقياس الطيف الكتلي الخالي من التسمية ، والتحليل الحسابي المصب والتصور المرئي للبيانات. تم تحسين بروتوكولنا للكشف عن التفاعلات المجزاه والمنخفضة الوفرة التي يصعب التعرف عليها من الخلايا الكاملة (علي سبيل المثال ، تفاعلات عامل النسخ في النواة) عن طريق ايمونوبريسيبيتيشن البروتينات الذاتية من مقصورات الخلايا الفرعية مجزاه. خط أنابيب اعداد عينه المبينة هنا يوفر تعليمات مفصله لاعداد استخراج النووية الخلية هيلا ، وتنقيه المناعة من البروتين الطعم الذاتي ، وتحليل الطيف الكتلي الكمي. ونحن نناقش أيضا الاعتبارات المنهجية لأداء الايمونوبريسيبيتيشن واسعه النطاق في التفاعل القائم علي الطيف الطيفي التجارب وتوفير المبادئ التوجيهية لتقييم جوده البيانات لتمييز البروتين الإيجابي الحقيقي تفاعلات من تفاعلات غير محدده. ويتجلى هذا النهج هنا من خلال التحقيق في التفاعل النووي لل CMGC كيناز, DYRK1A, بروتين كيناز منخفضه الوفرة مع التعاملات المحددة بشكل سيئ داخل النواة.
Introduction
البروتينية البشرية المعارض التنوع الهيكلي والبيوكيميائية واسعه من خلال تشكيل المجمعات المتعددة الوحدات مستقره والتفاعلات البروتين والبروتين عابره. ووفقا لذلك ، فان تحديد الشركاء التفاعل للبروتين من الفائدة مطلوب عاده في التحقيقات لكشف اليه الجزيئية. وقد مكنت التطورات الاخيره في بروتوكولات تنقيه التقارب وظهور أجهزه قياس الطيف الكتلي عاليه الاستبانة من المسح السهل للمناظر الطبيعية للتفاعل البروتيني في تجربه واحده غير متحيزة.
بروتوكولات تفاعل البروتين تستخدم عاده أنظمه التعبير عن الرحم مع ثوابت الانصهار الموسومة التقارب لتحديد التفاعلات البروتين دون الحاجة إلى الأجسام المضادة عاليه الجودة الاعتراف بروتين من الفائدة1,2. ومع ذلك ، فان الأساليب القائمة علي علامات المرمه لها عيوب عديده. التفاعلات الفيزيائية مع المرقد يؤدي إلى الكشف عن البروتينات النحاسية غير المحددة3. بالاضافه إلى ذلك ، فان انصهار هذه العلامات المرطيه إلى N-أو C-الطرفية للبروتين قد يمنع تفاعلات بروتين البروتين الاصليه ، أو يعطل طي البروتين لتعزيز التشكيلات غير الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك, نظم التعبير عن الرحم عاده overexpress البروتين الطعم في تركيزات سوبرافيسيولوجيكال, التي يمكن ان تؤدي إلى تحديد التفاعلات البروتين المادي, لا سيما بالنسبة للجينات الحساسة للجرعة5. للالتفاف علي هذه القضايا ، يمكن ان إيمونوبريسيبيتاتيد البروتين الطعم الذاتية مع المرتبطة البروتينات فريسه التفاعل ، علي افتراض توافر الأجسام المضادة عاليه الجودة التي تعترف البروتين الأصلي.
المقدمة هنا هو التفاعل البروتينية سير العمل للكشف عن interactome النووية من البروتين الذاتي باستخدام البروتين CMGC كيناز DYRK1A كمثال. تعطيل رقم النسخة الDYRK1Aه ، مستوي النشاط ، أو التعبير يمكن ان يسبب أعاقه ذهنيه شديده في البشر ، والفتك الجنيني في الفئران6،7،8،9. DYRK1A يسلك التنظيم المكاني الديناميكي10، والتفاعلات البروتينية مجزاه11،12، تتطلب نهج قادره علي الكشف عن الشركاء التفاعل منخفضه الوفرة محدده لمقصورات فرعيه مختلفه.
يستخدم هذا البروتوكول التجزئة الخلوية للخلايا البشرية هيلا في الكسور السيتوزول والنيوتوبلاسما ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينة لقياس الطيف الكتلي ، ونظره عامه علي خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم جوده البيانات وتصور النتائج ، مع نصوص R المقدمة للتحليل والتصور (الشكل 1). حزم البرامج البروتينية المستخدمة في سير العمل هذه كلها متاحه بحريه للتحميل أو يمكن الوصول اليها من خلال واجهه ويب. للحصول علي معلومات اضافيه حول البرامج والأساليب الحسابية ، والدروس المتعمقة والتعليمات المتاحة في الروابط المقدمة.
Protocol
ملاحظه: جميع التراكيب العازلة وخلائط الانزيم البروتيني مبينه في الجدول 1.
1. اعداد الخلايا
ملاحظه: من المرغوب فيه المواد الاوليه من 1 − 10 ملغ محلله النووية في النسخ المتماثل لهذا ايمونوبريسيبيتيشن الكتلي (IP-MS) النهج. ستعطي كميات الخلايا ل 1 ملغ من الإيمونوبريسيبيتيشنز النووية في ثلاث نسخ بالاضافه إلى الضوابط ثلاثية النسخ.
- إذا كنت تستخدم خط خليه ملتصقة ، تنمو الخلايا إلى 90 ٪ كونفلوينسي في 3 × 15 سم الاطباق في النسخ المتماثل قبل الحصاد.
ملاحظه: من المستحسن اجراء ثلاثه نسخ متماثل إيمونوبريسيبيتيشنز لحالات الطعم والتحكم الحد ادني. هذا البروتوكول سوف تفترض استخدام "الخرز فقط" الضوابط ، والتي تتحكم في التفاعلات غير محدد وفيرة مع الخرز ، بدءا من القسم 4. قد تكون أنواع أخرى من عناصر التحكم مفيده. ويرد وصف هذه البيانات بتعمق في قسم المناقشة.- غسل لوحات 2x مع الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني) والخلايا التريسيسيزي باستخدام 3 مل من 0.25 ٪ التريبسين في لوحه 15 سم. تدور الخلايا في 1,200 x g لمده 5 دقائق وصب التريبسين.
- لخلايا التعليق ، تنمو إلى مستوي مماثل/كثافة لتحقيق 70 − 80 ملغ من البروتين الكلي.
- خلايا بيليه في 1,200 x g و 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق decant وسائل الاعلام بعناية.
ملاحظه: يمكن دمج الكريات اثناء هذه الخطوة لتمكين المعالجة الفعالة باستخدام التجزئة الخلوية الواسعة النطاق الموضحة في القسم 2.
- خلايا بيليه في 1,200 x g و 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق decant وسائل الاعلام بعناية.
- غسل الخلية بيليه 2x مع تلفزيوني + 5 مم MgCl2 تكمله مثبطات الانزيم البروتيني (بيس) ومثبطات الفوسفاتيز (فيس) (انظر الجدول 1).
ملاحظه: قد تكون الكريات الخلوية فلاش مجمده في النيتروجين السائل وتخزينها في-80 درجه مئوية حتى تصبح جاهزه لتجزئه.
2-اعداد مستخرجات الاسلحه النووية
ملاحظه: يجب أضافه الانزيمات البروتينية ومثبطات الفوسفاتيز إلى المخازن المؤقتة تجزئه في غضون 30 دقيقه من الاستخدام.
- إذا المجمدة ، وذوبان الكريات الخلية لمده 15 دقيقه في حجم بيليه 1x من العازلة الباردة A + بيس/فيس. وضع بيليه الخلية علي البندق في 4 درجه مئوية للمساعدة في أعاده التعليق اثناء الذوبان. خلاف ذلك ، أعاده تعليق بيليه الخلية من الخطوة 1.3 إلى 1x بيليه حجم المخزن المؤقت A + بيس/Phis.
- بيليه في 2,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه decant المخزن المؤقت.
- تعليق الخلايا مع 5x حجم الخلية معباه مع العازلة A واحتضان علي الجليد لمده 20 دقيقه.
- بيليه في 2,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه decant المخزن المؤقت وأعاده التعليق مع 2x الأصلي معباه حجم الخلية المخزن المؤقت a + بيس/فيس و dounce ~ 7x مع "a"/المدقه فضفاض.
- الطرد المركزي محلله لمده 10 دقيقه في 2,000 x g و 4 ° c.
- ماصه بعناية قباله سوبرناتانت وتجميد فلاش مع النيتروجين السائل. تخزين محلله في-80 درجه مئوية. و ماده طافي من هذه الخطوة هو الكسر الخلوية السيتووليك.
ملاحظه: يمكن حفظ بيليه النووية خلال هذه الخطوة عن طريق تجميد فلاش مع النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية - أعاده تعليق بيليه مع حجم 0.9 x بيليه من العازلة B + بيس/فيس وتخلط علي البندق لمده 5 دقائق في 4 درجه مئوية.
- لlyse النوى ، dounce 20x مع المدقه أكثر صرامة "B".
- تخلط الليمات النووية علي البندق لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية بحيث تكون متجانسة.
- الطرد المركزي محلله النووية لمده 30 دقيقه في 21,000 x g في 4 ° c. الماصة قباله سوبرناتانت وحفظ كمستخرج البروتين النووي القابل للذوبان.
ملاحظه: المعالجة النونويه لبيليه النووية الناتجة يسمح لاستعاده جزء البروتين المرتبطة الكروماتين. - الديزه استخراج النووية القابلة للذوبان ضد العازلة C + بيس ل 3 ح في 4 ° c.
- قطع الطول المناسب لأنابيب غسيل الكلي بعرض 24 مم مع الوزن الجزيئي 8 كده قطع. المشبك جانب واحد من الأنابيب وتحميل النونوتوبلاسما في الأنبوب. بعد تحميل lysate ، المشبك الطرف الآخر والاندماج في حاويه زجاجيه نظيفه تحتوي علي العازلة C + بيس.
- الطرد المركزي استخراج النووية ديزيد/النيوتوبلاسما في 21,000 x ز في 4 درجه مئوية ل 30 دقيقه aliquot 3x 20 μl مجلدات من استخراج النووية لعمليه التحقق من التجزئة بواسطة لطخه الغربية. استخراج النووية المستخدمة لتحليل الملكية الفكرية-MS يمكن نقلها وفلاش المجمدة في النيتروجين السائل وتخزينها في-80 درجه مئوية ، إذا لزم الأمر.
3. التحقق من التجزئة تحت الخلوية
- استكمال فحص البروتين لتحديد تركيز البروتين من lysate النووية. ويوفر فحص البروتين حمض ثنائي الاتجاه حساسية كافيه للتطبيق المصب.
- تحميل 20 ميكروغرام من كل من الكسور الخلوية والنووية علي هلام SDS-PAGE لتحليل لطخه الغربية كما سبق وصفها13. تخطي الممرات عند التحميل لتجنب التوصيف الخاطئ للعينه.
- التحقيق في وصمه عار الغربية ل p84 (THOC1) كعلامة النووية ، و جابdh كعلامة عصاري خلوي. تحديد مدي التجزئة بنسبه العلامة الخلوية في الكسر النووي والعكس.
ملاحظه: يمكن استخدام الأجسام المضادة للعلامات النووية الأخرى والعلامات السيتووليك.
4. ايمونوبريسيبيتيشن المحلية الطعم النووي البروتين
ملاحظه: من المستحسن استخدام أنابيب الاحتفاظ منخفضه من هذه النقطة علي. سيؤدي هذا إلى تقليل الربط غير المحدد للأنابيب اثناء معالجه العينة وتجنب الفقدان غير الضروري للعينه. بالاضافه إلى ذلك ، تاكد من استخدام LCMS الصف H2O لاعداد المخازن المؤقتة للخطوات المتبقية.
- اعداد خليط حبه البروتين A/G لكل نسخ متماثل عن طريق الجمع بين 12.5 μL من حجم حبه لكل من البروتين-A والبروتين-G في أنابيب الطرد المركزي الصغير. تخزين الأسهم حبه كما الطين التي تحتوي علي 20 ٪ الايثانول. تحديد تركيز الخرز داخل الطين ٪ (v/v) وماصه الحجم اللازم باستخدام طرف ماصه التي تم قطعها علي الطرف لضمان ان الخرز يمكن ان تدخل الطرف.
- غسل البروتين A/G حبه خليط 2x مع 300 μL من المخزن المؤقت IP 1. تدور الخرز في 1,500 x ز في 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه والعازلة صب.
- اعداد الأجسام المضادة-بروتين A/G الخرز: لربط الأجسام المضادة إلى الخرز ، أضافه 300 μL من المخزن المؤقت IP 1 و 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة المطلوبة. السماح لخليط حبه/الجسم المضاد لموسيقي الروك علي البندق في 4 °C بين عشيه وضحيها. لعناصر التحكم حبه فقط ، لا تقم باضافه اي الأجسام المضادة.
ملاحظه: يمكن استخدام ما مجموعه 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة في النسخ المتماثل كنقطه بداية ، ولكن المبلغ الدقيق سوف تحتاج إلى ان تكون الأمثل لكل الأجسام المضادة الفردية ومقياس محلله المستخدمة في التجربة - ذوبان اللايتس النووية من الخطوة 2.10 في حمام المياه والاحجام المناسبة قسامه في الاحتفاظ منخفضه أنابيب الطرد المركزي الصغير ل 1 ملغ مدخلات البروتين في النسخ المتماثل.
- تدور محلله في 16,000 x g لمده 30 دقيقه ونقل ماده طافي إلى أنبوب جديد.
- أضافه 1 μl من البنبناز (250 وحدات/μl) لكل 1 ملغ من محلله النووية والصخور علي البندق في 4 درجه مئوية لمده 10 − 15 دقيقه.
- اعداد الخرز لتطهير lysate. أضافه 12.5 μL من كل بروتين A والخرز G البروتين إلى 1.5 mL أنابيب الاحتفاظ منخفضه كما هو الوضع في الخطوة 4.1. غسل 2x مع IP غسل العازلة 1 + بيس وصب العازلة.
- أضافه 1 ملغ من محلله النووية إلى حبات من الخطوة 4.5. احتضان بينما هزاز علي البندق لمده 1 ساعة في 4 درجه مئوية.
- أجهزه الطرد المركزي التي تم مسحها مسبقا لست] في 1,500 x g و 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه.
- في حين ان المضادات النووية هي احتضان مع الخرز في الخطوة 4.5.1 ، وغسل الأضداد-البروتين A/ز الخرز 2x مع المخزن المؤقت IP 1 + بيس. الطرد المركزي في 1,500 x g و 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه وصب العازلة.
- نقل المضادات النووية التي تم مسحها مسبقا من الخطوة 4.6.1 علي الأضداد-البروتينات A/G الخرز. احتضان بينما هزاز علي البندق في 4 درجه مئوية ل 4 ح. أجهزه الطرد المركزي بعد الحضانة في 1,500 x g و 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه.
- نقل ماده طافي إلى أنابيب وصفت بأنها تدفق من خلال لكل نسخ متماثل.
- غسل الأجسام المضادة-البروتين A/G الخرز مع 1 مل من العازلة IP 2 + بيس. الطرد المركزي في 1,500 x g و 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه ، صب العازلة ، وتكرار لما مجموعه 3x.
- غسل الخرز 2x مع 1 مل من المخزن المؤقت IP 1 + بيس يطرد كما في الخطوة السابقة. تاكد من أزاله كافة المخزن المؤقت بعد الغسيل الأخير.
- Elute 2x مع 20 μL من 0.1 M الجليسين (pH 2.75) لمده 30 دقيقه لكل منهما. تاكد من ان الأنابيب تهتز اثناء الاحتضان مع المخزن المؤقت التملص. تدور في 750 x g و 4 درجه مئوية لمده 1 دقيقه وماصه قباله ماده طافي بعد كل حضانة 30 دقيقه.
ملاحظه: في حين ان الطريقة المنخفضة الحموضة الجليس وصفت هنا التملص من معظم البروتينات الطعم ، وبعض التفاعلات مستضد الأجسام المضادة تتطلب ظروف العازلة أكثر صرامة. - فلاش تجميد التملص في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية.
5-اعداد العينات
ملاحظه: الانسولين ارتفعت في عينات ايمونوبريسيبيتيشن شطف الإيدز في استعاده البروتينات خلال حمض ثلاثي الكلور (الشكل) هطول الامطار ومعالجه العينات ، وهو أمر مهم لانخفاض وفره البروتينات الطعم الذاتية.
- ذوبان الجليد في درجه حرارة الغرفة إذا جمدت.
- وضع العينات علي الجليد وأضافه 10 μL من 1.0 ملغ/مل الانسولين لكل 100 μL من التملص. دوامه ثم أضافه علي الفور 10 μL من 1 ٪ ديكسيتشوليت الصوديوم. دوامه العينة مره أخرى وأضافه 30 μL من 20 ٪ من الطرازات تليها دوامه واحده النهائي.
- احتضان العينات علي الجليد لمده 20 دقيقه ، ثم أجهزه الطرد المركزي في 21,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
- يستنشق ماده طافي وأضافه 0.5 مل من الأسيتون التي تم تبريدها مسبقا إلى-20 درجه مئوية. دوامه ثم تدور في 21,000 x g و 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. كرر هذه الخطوة.
- يستنشق ماده طافي والهواء الجاف بيليه المتبقية في الجزء السفلي من الأنبوب.
- اعداد العينة لقياس الطيف الكتلي باستخدام طريقه تعديل نموذج الاعداديه بمساعده تصفيه (FASP) ، الأمثل للحد من معالجه العينة ، كما هو موضح أدناه14.
- أعاده تعليق بيليه البروتين من الخطوة 5.1.4 مع 30 μL من المخزن المؤقت للكله SDS (انظر الجدول 1). احتضان العينة علي كتله حرارة 95 درجه مئوية لمده 5 دقائق. ندعه يبرد في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه قبل ان تسبق الخطوة التالية.
- أضافه 300 μL من الحل UA و 30 μL من 100 mM TCEP لكل عينه. تحميل هذا الحل علي فلتر الطرد المركزي 30k. تدور فلتر الطرد المركزي في 21,000 x g في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
ملاحظه: يجب ان يكون البروتين الطعم والجهات المشتركة المفترضة ملزمه للمرشح في هذه المرحلة. ومع ذلك ، قد يتم الاحتفاظ تدفق من خلال ، في حاله وجود مشكله مع عامل التصفية. - غسل فلتر مع 250 μL من UA وأجهزه الطرد المركزي في 21,000 x g ل 10 دقيقه. decant تدفق من خلال وتكرار لما مجموعه 3x.
- غسل فلتر مع 100 μL من 100 mM تريس الأس الهيدروجيني 8.5 والطرد المركزي في 21,000 س ز ل 10 دقيقه. decant تدفق من خلال وتكرار لما مجموعه 3x.
- أضافه 3 μl من 1 ميكروغرام/μl Lys C معلق في 0.1 M تريس الأس الهيدروجيني 8.5. أملا الفلاتر حتى علامة 100 μL واتركها للهضم لمده 1 ساعة عند 37 درجه مئوية اثناء الاهتزاز علي البندق.
- أضافه 1 μL من 1 ميكروغرام/μL MS الصف التريبسين. اخلطي برفق واتركي التريبسين لاحتضان العينة بين عشيه وضحيها عند 37 درجه مئوية بينما تهزين البندق.
- جهاز الطرد المركزي في 21,000 x g لمده 20 دقيقه إلى الوت الببتيد من فلتر.
ملاحظه: قد تكون هناك حاجه إلى جولات متعددة من طرد لاسترداد كل التملص. إذا لم يتم ذلك ، هناك احتمال لفقدان العينة الشديدة.
- Desalt الببتيدات باستخدام C18 تدور الاعمده. اتبع البروتوكول الموفر من قبل الشركة المصنعة.
- أعاده تعليق الببتيد بالتجميد في 7 μL من 0.1 ٪ TFA في 5 ٪ اسيتلونيتريل. Sonicate العينة لمده 3 دقائق للتاكد من ان الببتيدات قد أعيد تعليقها. تدور في 14,000 x g لمده 10 دقيقه.
- نقل الببتيد أعاده التعليق إلى قنينة عينه مناسبه للتحميل علي اللوني السائل – الطيف الكتلي (LC/MS) النظام.
6. LC/MS ملاءمة النظام
ملاحظه: نظرا لحجم صغير وعموما اقل وفره من البروتين من عينات التقارب-تنقيه ، فمن المهم ان تعمل منصة LC/MS بحساسية قصوى ومتانة.
- أضافه 1 مل من lc/ms الصف حمض الفورميك إلى 1 لتر من lc/ms الصف المياه للمرحلة المتنقلة A ، وأضافه 1 مل من حمض الصف lc/ms إلى 1 لتر من lc/ms الصف اسيتلونيتريل للمرحلة المتنقلة ب.
- اعداد أو تثبيت 75 μm تنصهر-السيليكا الشعرية العمود معباه مع < 2 μm عكس المرحلة الراتنج C18 هو ≥ 250 مم في الطول. سيكون أفضل النتائج مع حقنه مباشره من العينات في العمود.
- تطهير نظام اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) مع المراحل المتنقلة الجديدة. مع عمود C18 تثبيت ، وإنشاء معدل تدفق مستقره والرش الكهربائي مع باعث مناسب (اي ، 20 ميكرون id x 360 μm od سحبت إلى تلميح 10 μm). الحفاظ علي العمود في 40 − 60 درجه مئوية.
- اختبار أداء النظام LC/MS العام عن طريق حقن معيار لمراقبه الجودة المعقدة ، مثل 100 − 200ng من الهضم الكامل للخلايا الخلوية. Elute مع التدرج مناسبه لعينه معقده (اي ، 2 − 3 h التدرج الوقت الشطف). تاسيس أداء نظام الأساس من الببتيد والبروتين الهويات.
ملاحظه: للحصول علي أفضل النتائج ، سيوفر 3000 − 5000 أو أكثر من الهويات البروتينية من 20000 − 35000 الببتيدات الفريدة الأداء الأمثل للعينات التجريبية. - لملاءمة نظام LC/MS الروتيني ، يمكنك حقن 100 − 200 fmol أو اقل من معيار واحد لهضم البروتين ، مثل زلال مصل الأبقار (بوسنيا). Elute مع التدرج قصيرة (اي ، 20 − 30 دقيقه).
ملاحظه: حقن متعددة من خلاصه البروتين سوف تساعد علي إنشاء خط الأساس LC/MS أداء النظام ، وتكرار الحقن بعد كل عينه IP-MS يوفر قياس أداء النظام في جميع انحاء التجربة ويسمح للكشف عن الانجراف الصك ، والتي يمكن ان التحيز التجارب الخالية من التسمية. سيقوم خط أساس لكثافة الذروة الفردية المحددة واشكال الذروة باعلام أداء MS و LC والعمود. - لتجنب اثقال العمود التحليلي ، يمكنك تحميل جزء صغير (15 − 30% من الإجمالي) للعينه التجريبية علي العمود وفصلها باستخدام تدرج مناسب للعينات المعقدة (اي 2 − 3 ساعة). إذا كان عدد من البروتين الهويات غير مرضيه ، تحميل كل من العينة علي العمود.
- تشغيل معيار واحد لهضم البروتين بين العينات لمراقبه أداء نظام LC/MS وعينه المرحل. قد تكون هناك حاجه إلى معايير متعددة للحد من عينه المرحل اعتمادا علي العينات الخاصة بك.
7. معالجه البيانات
- تحميل حزمه البرمجيات بروتيميكس MaxQuant وجدت في https://www.maxquant.org/.
ملاحظه: سيتم استخدام هذا لمعالجه ملف البيانات RAW MS من الخطوة 6.6 إلى جداول بيانات معرفات البروتين وأسماء الجينات والقيم الكمية المرتبطة بتعريف هذه للتحليل المتلقي للمعلومات.- حدد تحميل ضمن الراس الفرعي بيانات الإدخال من علامة التبويب بيانات raw . افتح موقع الملف حيث يتم تخزين ملفات ms الخام وحدد الملفات الاوليه لكل ms/ms تشغيل.
- انقر علي علامة التبويب الخاصة بالمجموعة وحدد الهضم. ضمن قائمه الانزيمات حدد Lysc وانقر علي السهم الأيمن لأضافه هذا الانزيم في القائمة التي سيتم استخدامها في البحث. بعد ذلك ، حدد الاداه وتاكد من ظهور نوع الاداه الصحيح في القائمة المنسدلة في اعلي الشاشة. اترك معلمات البحث الأخرى الخاصة بالمجموعة علي الإعدادات القياسية.
- انقر فوق علامة التبويب المعلمات العمومية وحدد تسلسلات. أضافه ملف FASTA المناسب للتصنيف الذي سيتم استخدامه في هذا البحث. لن يتم تعيين الببتيدات بشكل صحيح إذا لم يتم ذلك. بالنسبة للبرومي البشري ، قم بتنزيل ملف FASTA من UniProt في https://www.uniprot.org/help/human_proteome.
- ضمن علامة التبويب المعلمات العمومية ، انقر علي كميه البروتين. ضمن الببتيدات للقياس الكمي القائمة المنسدلة ، حدد فريدة من نوعها + الشفرة.
ملاحظه: MaxQuant يقدم كميه بديله من البروتينات من خلال التحديد الكمي المطلق القائم علي كثافة (iBAQ) والتسمية خاليه من القيمة (LFQ). ومع ذلك ، معلومات عدد الببتيد كافيه للتحليل المصب في هذا البروتوكول15. - في الجزء السفلي الأيسر من واجهه MaxQuant ، حدد عدد المعالجات التي سيتم استخدامها للبحث. هذا سيؤثر مباشره علي طول الوقت المطلوب للتشغيل ، لذلك حدد أكبر عدد ممكن لهذا). انقر فوق أبدا في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة لبدء تشغيل. حدد علامة التبويب " الأداء " في اعلي الشاشة لعرض تقدم البحث.
- عند اكتمال التشغيل ، افتح ملف المجموعات البروتينية في براوس ، منصة حساب بروتينيه ، أو برنامج جداول البيانات الأخرى لعرضها16.
- استخدام ساوس لأزاله الملوثات الشائعة ويضرب لعكس تسلسل البروتين. اتبع وثائق ساوس مفصله في http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
ملاحظه: سيؤدي فتح ملف المجموعات البروتينية في برنامج التحليل (علي سبيل المثال ، Excel) إلى إفساد بعض أسماء الجينات والبروتينات بشكل تلقائي.
- استخدام ساوس لأزاله الملوثات الشائعة ويضرب لعكس تسلسل البروتين. اتبع وثائق ساوس مفصله في http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
- تحليل البيانات التجريبية باستخدام مستودع الملوثات لتنقيه التقارب (كرابمي). تسجيل حساب في هذا المستودع http://crapome.org/واتبع البرنامج التعليمي حسب الحاجة17,18.
- استخدم تحليل سير العمل الخاص بالبيانات الموجود علي الصفحة الرئيسية ل كرابمي. حدد عناصر التحكم الخارجية التي تتوافق مع نظام تنقيه التقارب المستخدم في تجربه التفاعل هذه.
ملاحظه: يمكن استخدام عناصر التحكم هذه لحساب إثراء التغيير اضعاف الثانية التي هي مفيده للكشف عن الملوثات الشائعة. - إنشاء ملف إدخال من الإخراج بروتينيه من MaxQuant باستخدام ساوس أو تطبيق جدول بيانات مناسب. يمكن العثور علي تفاصيل التنسيق اليدوي في http://crapome.org/?q=fileformatting. بدلا من ذلك ، استخدم البرنامج النصي R المتوفرة "export_CRAPomeSAINT_Input_File" لإنشاء ملف الإدخال سانت/كرابمي. راجع README.TXT في ملفات الترميز الاضافيه.
- تشغيل تحليل لتحديد اضعاف التغيير الإثراء وسانت (تحليل الاهميه من INTeractome) احتمال لكل بروتين الطعم في ايمونوبريسيبيتيشن. تاكد من تحديد "عناصر تحكم المستخدم" في القائمة المنسدلة تحت fc-A ، ' عناصر تحكم كرابمي ' أو ' جميع عناصر التحكم ' يتم تحديدها في fc-B المنسدلة ويتم تحديد نقاط الاحتمال لتوليد الاحتمالات سانت. عند انتهاء التشغيل ، عرض الإخراج المتوفر ضمن "نتائج التحليل" مع معرف المهمة. قم بتنزيل مصفوفة البيانات من "نتائج التحليل" للتخطيط المستقبلي وتصور البيانات.
- استخدم تحليل سير العمل الخاص بالبيانات الموجود علي الصفحة الرئيسية ل كرابمي. حدد عناصر التحكم الخارجية التي تتوافق مع نظام تنقيه التقارب المستخدم في تجربه التفاعل هذه.
- ارسم البروتينات كداله من FC-A (IPs مقابل عناصر تحكم المستخدم) و الاحتمال القديس باتباع البرامج النصية R كما هو متوفر في ملفات الترميز الاضافيه.
ملاحظه: يتم توفير مجموعه من البرامج النصية R لإنتاج قطع من FC-A مقابل الاحتمال سانت و iBAQ مقابل log2 (وفره البروتين) ، الملونة من قبل مجموعه القيمة p المعدلة من تحليل باييس التجريبية من الكثافة الخالية من التسمية. يتم العثور علي تفاصيل التحليل الإحصائي التفاضلي والتخطيط في README.TXT والبرنامج النصي R "main_differential_analysis. R "في ملفات الترميز الاضافيه. - تقييم حيث يتم تصنيف البروتينات المتفاعلة المعروفة من البروتين الطعم من قبل FC-A و SAINT. جعل قطع من FC-A > 3.00 و SAINT > 0.7 لتجارب الطعم واحد في ثلاث نسخ كنقطه انطلاق.
ملحوظة: يجب ان تكون المعلومات البيولوجية علي علم باختيار القطع الفاصلة بين الجهات الفاعلة "ذات الثقة العالية" وبين الجهات الفاعلة "ذات الثقة المنخفضة".
8-تصور البيانات
ملاحظه: هناك العديد من البرامج التي يمكن ان تصور بشكل فعال البيانات البروتينية (علي سبيل المثال ، R ، ساوس ، Cytoscape ، سلسله DB). ويمكن ان يكون تحليل الربط بين الزيارات العالية الثقة والإثراء الوظيفي لهذه الجهات الفاعلة استراتيجية مفيده لتحديد أولويات الزيارات من أجل المزيد من التحقق والتوصيف الوظيفي.
- تحميل Cytoscape, أداه التصور شبكه مفتوحة المصدر في https://cytoscape.org/download.html19.
- اعداد ملف إدخال لبيانات التفاعل كملف جدوله محدد بثلاثه أعمده: الطعم (عقده المصدر) ، الفريسة (العقدة المستهدفة) ، نوع التفاعل (نوع الحافة). ويمكن ان يتم ذلك في ساوس أو اي برنامج جداول البيانات من اختيارك.
- حدد الجدول استيراد من أيقونه الملف نحو اعلي يسار البرنامج (المعينة من قبل سهم لأسفل ومصفوفة في الرمز). سيقوم cytoscape تلقائيا بملء بيانات التفاعل في شبكه جاهزه للتنسيق والتصميم المخصصين.
- حدد علامة التبويب نمط علي لوحه التحكم ل Cytoscape وانقر علي المربعات في العمود Def لضبط السمة للشبكة بأكملها. حدد العقد أو الحواف المحددة في الشبكة ثم حدد المربع داخل عمود Byp من قائمه الأنماط لتجاوز الإعدادات الافتراضية وضبط الكائنات المحددة فقط. بدلا من ذلك ، انقر علي القائمة المنسدلة في الأعلى من القائمة نمط لعرض تنسيقات الشبكة مسبقا.
ملاحظه: يمكن دمج بيانات تفاعل بروتين بروتين السلسلة db في هذه الشبكة في هذا الوقت اما يدويا من خلال ملف الإدخال أو من خلال أدوات الإثراء المختلفة المتوفرة كمكونات اضافيه في Cytoscape ، http://apps.cytoscape.org/20. تم العثور علي المكونات الاضافيه cytoscape الموصي بها لتحليل التخصيب في http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. - لزيادة الثقة في مجموعه البيانات التي تم إنشاؤها في سير العمل هذا ، قم باجراء تجارب IP-MS أو IP-الغربية المتبادلة التي تستهدف بروتينات الفريسة التي تهم الطعم.
Representative Results
معظم كتله البروتين المحددة في تجربه الملكية الفكرية-MS يتكون من البروتينات غير محدده. التالي ، فان أحد التحديات الرئيسية لتجربه الملكية الفكرية-MS هو تفسير البروتينات التي هي الجهات الفاعلة ذات الثقة العالية مقابل الجهات المشتركة غير المحددة. لإظهار المعلمات الحاسمة المستخدمة في تقييم جوده البيانات حللت الدراسة ثلاثية الإيمونوبريسيبيتيشنز من 5 ملغ من الاستخراج النووي هيلا باستخدام حبه السيطرة فقط. الاختيار الداخلي الأول للتاكد من ان تجربه الملكية الفكرية-MS هو موثوق به هو ما إذا كان البروتين الطعم باعتبارها واحده من اعلي البروتينات المخصب التي حددتها كل من اضعاف التغيير علي السيطرة واحتمال سانت. في هذه الحالة ، صنفت DYRK1A الطعم بين البروتينات الثلاثة الأكثر ثراء علي التحكم (الشكل 2 ا،ب). في دراسة التفاعلات النووية DYRK1A استخدام أربعه أجسام مضاده مستقله ، وقطع FC-A من > 3.00 و SAINT احتمال قطع > 0.7 قدمت قطع صارمة لتحديد كل من الجهات الفاعلة الرواية والمصادق عليها سابقا22. وعند تطبيقها علي هذه التجربة ، يمكن النظر إلى فصل واضح بين الجهات الفاعلة ذات الثقة العالية وال> 95 في المائة من البروتينات التي تعرف بأنها غير محدده (الشكل 2 ا،ب). تطبيق كل من الإثراء تغيير اضعاف وعتبه الاحتمال يزيد التقشف من خلال المطالبة بإثراء عاليه باستمرار من معرفات البروتين عبر البيولوجية ونسخ متماثلة.
الاضافه إلى التهديف الإحصائي ، فان سير عمل تحليل الكراسوم أيضا يرسم التفاعلات المبلغ عنها سابقا علي بيانات الطعم الجارح23. بالنسبة لDYRK1A المثال لمجموعه البيانات ، كانت قيم iREF البينية FC-A منخفضه مثل 0.45 ، مما يمثل إثراء منخفضا جدا فوق التحكم (الشكل 2C). ولتجنب التضخم في الإيجابيات الزائفة ، ينبغي اجراء الدرس الإحصائي بطريقه تعطي الاولويه للحد من السلبيات الزائفة. وتجدر الاشاره إلى ان الكشف عن هذه التفاعلات كان مستقلا عن وفره البروتين (الشكل 2 ج). اظهر رقم النسخة المطلقة المحسوب لكل تفاعل iREF داخل خلايا هيلا عدم وجود ارتباط لمستويات الكشف عن شريك التفاعل بواسطة IP-MS24.
Cytoscape بمثابه أداه فعاله لتصور طبقات متعددة من البيانات التفاعل19. في DYRK1A ايمونوبريسيبيتيشن التجربة الموصوفة هنا ، والجمع بين استخدام FC-A > 3.0 و SAINT > 0.9 خفضت قائمه الجهات الفاعلة عاليه الثقة إلى سته بروتينات (الشكل 2D). ومع ذلك ، عند تطبيق قطع FC-A من > 3.0 في عزله ، أضيفت ثمانيه بروتينات اضافيه إلى الشبكة. ولهذه العوامل البروتينية الاضافيه اتصالات عاليه مع الجهات المشتركة بالفعل في الشبكة ، مما يوحي بأنها مرتبطة بالمجمعات المتشابهة أو الأدوار الوظيفية. وتحقيقا لهذه الغاية ، أدمجت الادله المستمدة من سلسله ديسيبل من تفاعلات البروتين والبروتين في هذه الشبكة بالخطوط الزرقاء المتقطعة20. في حين ان هذا الطعم الواحد ، تجربه ثلاثية النسخ يوفر عينه محدوده من شبكه التفاعل DYRK1A الكاملة ، واستخدام الطعوم اضافيه ، وتكرارات ، ودمج مجموعات البيانات العامة الكبيرة يمكن استخدامها لتوسيع شبكه التفاعلات عاليه الثقة. التالي فان التخفيضات الاحصائيه ستكون محدده لكل تجربه علي حده ، سيتعين تقييمها بدقه.
الشكل 1: سير العمل البروتيني التمثيلي لخليه الملكية الفكرية الفرعية-MS. تزرع الخلايا اما في قوارير القاع المستديرة 4 لتر أو في الاطباق المزروعة بالانسجه بطول 15 سم وتحصد في نفس الوقت لتفتيتها تحت الخلوي. يتم تجزئه الخلايا إلى الخلوية ، والنووية ، وبيليه النووية ، ويتم إيمونوبريسيبيتيشنز من 1 − 10 ملغ من محلله النووية باستخدام واحد أو الأجسام المضادة المتعددة الاعتراف بنفس الطعم. يتم تنفيذ الاعداديه عينه بمساعده تصفيه (FASP) وتنظيف العينة دون اتصال قبل القياس الطيفي الكتلة طلقه واحده. يتم استخدام خط أنابيب الحوسبة المتلقيين للمعلومات لمعالجه البيانات في بيانات تفاعل التفسير. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: البيانات التمثيلية لتجربه الأجسام المضادة للأجسام أحاديه الطعم الوحيدة. (ا) الناتج FC-a و st احتمال من سير العمل تحليل كرابمي لتجربه مثلي باستخدام الأجسام المضادة واحده لDYRK1A كيناز (ن = 3). واستخدمت وحدات التحكم الخرز فقط للمقارنة. خطوط الصلبة الحمراء تمثل القطع التي تم تعيينها في FC-A > 3.00 والقديس > 0.7. (ب) وتقديرات وفره البروتين maxquant (iBAQ) الناتج مقابل log2 نسبه وفره البروتين في DYRK1A IP للسيطرة ، والملونة من قبل مجموعه القيمة p المعدلة من تحليل bayes التجريبية لكثافة خاليه من التسمية. (ج) عدد البروتينات المدرجة كبروتينات متفاعلة في قاعده بيانات iref23،24. (د) التصور شبكه Cytoscape من الجهات المشتركة DYRK1A. العقد الأزرق = FC-A > 3.00 ، > SAINT 0.7. العقد البرتقالي = FC-A > 3.00. الحواف السوداء = البروتينات التي تم تحديدها كعناصر بينيه في تجربه IPMS. الأزرق حافه متقطعه = سانت التفاعل بين البروتين فريسه (الثقة > 150). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| المثبط البروتياز (PI) الخليط | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| الصوديوم Metabisulfite | 1 مم |
| بنزاميدين | 1 مم |
| ديثيوثريتول (DTT) | 1 مم |
| فلوريد فينيلميثانسيولفونيل (PMSF) | 0.25 مم |
| الفوسفاتيز مثبط (PhI) الخليط | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| ميكروسيستن LR | 1 μM |
| الصوديوم اورمونوفاتي | 0.1 مم |
| فلوريد الصوديوم | 5 مم |
| المخازن المؤقتة لتجزئه الخلايا الفرعية: | |
| العازلة درجه الحموضة 7.9 | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| حبيس | 10 مم |
| MgCl2 | 1.5 مم |
| بوكل | 10 مم |
| العازلة B pH 7.9 | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| حبيس | 20 مم |
| MgCl2 | 1.5 مم |
| كلوريد | 420 مم |
| حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك (أدتا) | 0.4 مم |
| الجلسرين | 25% (v/v) |
| العازلة C pH 7.9 | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| حبيس | 20 مم |
| MgCl2 | 2 مم |
| بوكل | 100 مم |
| حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك (أدتا) | 0.4 مم |
| الجلسرين | 20 في المائة (v/v) |
| ايمونوبريسيبيتيشن المخازن المؤقتة: | |
| المخزن المؤقت IP 1 | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| حبيس | 20 مم |
| بوكل | 150 مم |
| EDTA | 0.1 مم |
| NP-40 | 0.1% (v/v) |
| الجلسرين | 10% (v/v) |
| المخزن المؤقت IP 2 | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| حبيس | 20 مم |
| بوكل | 500 مم |
| EDTA | 0.1 مم |
| NP-40 | 0.1% (v/v) |
| الجلسرين | 10% (v/v) |
| SDS العازلة pH 8.5 الدرجة الحموضة | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| الحزب الديمقراطي الصربي | 4% (v/v) |
| كلورواسيتاميد | 40 مم |
| TCEP | 10 مم |
| تريس | 100 مم |
| UA pH 8.5 | |
| كاشف | التركيز النهائي |
| اليوريا | 8 م |
| تريس | 0.1 M |
| * استخدام HPLC الصف H2O | |
الجدول 1: تركيبات عازله
ملفات الترميز الاضافيه. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
يوفر سير العمل البروتيني الموضح هنا طريقه فعاله للتعرف علي العوامل البروتينية ذات الثقة العالية للحصول علي بروتين من الفائدة. هذا النهج يقلل من تعقيد العينة من خلال كسر الخلايا الخلوية ويركز علي زيادة الشركاء التفاعل التعرف من خلال اعداد عينه قويه ، دون اتصال عينه تنظيف ، ومراقبه الجودة الصارمة لنظام LC-MS. تحليل البيانات المصب الموصوف هنا يسمح للتقييم الإحصائي البسيط للبروتينات التي تم تحديدها علي انها الطعم. ومع ذلك ، ونظرا للعدد الكبير من المتغيرات التجريبية (المقياس ، وخط الخلية ، واختيار الأجسام المضادة) ، فان كل تجربه تتطلب عمليات قطع مختلفه واعتبارات تتعلق بتصور البيانات وإثراءها.
أول اعتبار للتصميم في تجربه الملكية الفكرية-MS هو اختيار الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها لتجسيد البروتين المثير للاهتمام مع شركائها المتفاعلين. في حين ان توافر الأجسام المضادة التجارية قد اتسع لتغطيه أجزاء أكبر من بروتينيه البشرية علي مدي العقود القليلة الماضية ، لا يزال هناك العديد من البروتينات التي الكواشف محدوده. وعلاوة علي ذلك ، قد تكون الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها للتطبيقات مثل الكشف عن لطخه الغربية غير قادره علي إثراء انتقائي للبروتين المستهدف في تجربه ايمونوبريسيبيتيشن. قبل اجراء تجربه التفاعل البروتيني علي نطاق واسع ، ويقترح لاستكمال الملكية الفكرية من 90 ٪ متموج 10 سم طبق ، أو ما يعادلها رقم الخلية ، والتحقيق للبروتين الهدف من الفائدة الغربية التنقيط. إذا كان أكثر من الأجسام المضادة واحده متاحه لايمونوبريسيبيتيشن, ويقترح بالاضافه إلى ذلك لتحديد الأجسام المضادة المتعددة الاعتراف مرتوب داخل أجزاء مختلفه من البروتين. يمكن ان اوككلودي ربط الأجسام المضادة ببروتين الطعم واجهه الربط اللازمة للشركاء المتفاعلين المفترضين. سيؤدي اختيار الكمية الثانوية للبروتين الطعم إلى زيادة تغطيه التفاعل الذي حددته التجربة المستندة إلى الطيف الكتلي.
ويكمن الاعتبار الرئيسي الثاني في اختيار السيطرة المناسبة للتمييز بين التفاعلات ذات الثقة العالية والتفاعلات المنخفضة الثقة أو غير المحددة من تلك التي تم تحديدها علي انها الطعم. التحكم الأكثر صرامة لتجربه الملكية الفكرية-MS هو لإكمال الايمونوبريسيبيتيشن من خط خليه CRISPR KO من الطعم. مثل هذا التحكم يتيح تحديد وتصفيه من البروتينات غير المحددة التي ترتبط مباشره إلى الأجسام المضادة بدلا من البروتين الطعم. في الحالات التي يكون فيها توليد خط الخلية CRISPR KO من كل البروتين الطعم غير ممكن ، ويمكن استخدام السيطرة مفتش الخرزة من نفس النمط من الأجسام المضادة الطعم. في التجارب التي تستخدم لوحه من الأجسام المضادة التي تمثل أنواع متعددة ، يمكن ان يكون استخدام التحكم بالخرز فقط مناسبا ولكنه سيزيد من معدل الإيجابيات الزائفة التي تم تحديدها كاطراف ذات ثقة عاليه.
يعتمد اختيار خط الخلية المستخدم في تجربه IP-MS علي عده عوامل رئيسيه. يعتمد تعبير البروتين والتعريب إلى حد كبير علي نوع الخلية. بينما [رنا] تعبير تقديرات يستطيع كنت أسست لمعظم مورثات في كثير يشيع يستعمل خليه خطوط, بروتين ارتبطت تعبير بضعف مع [رنا] تعبير وينبغي كنت حددت تجريبيا25. وينبغي تجنب الخطوط الخلوية التي يتم فيها التعبير عن البروتين الطعم في عدد منخفض جدا من النسخ للالتفاف علي المشاكل المرتبطة بالزيادات الحاده في نطاق ثقافة الخلية التي قد تكون مطلوبه. وتجدر الاشاره ، مع ذلك ، ان اعداد العينة يمكن ان يكون الأمثل للكشف عن البروتينات وفره منخفضه جدا. بمساعده فلتر عينه الاعداديه (FASP) الأسلوب ، في حين قويه ، يمكن ان يسبب فقدان أكثر من 50 ٪ من الببتيد في عينه. وتعد عمليه اعداد العينات ذات المرحلة الصلبة المعززة بالطور الواحد (SP3) طريقه فعاله لتوليد العينات لتحليل قياس الطيف الكتلي الذي يقلل من فقدان العينات26. يمكن ان يكون الاسترداد المتزايد الذي تم تمكينه بواسطة أسلوب SP3 لاعداد العينات بديلا مفيدا في سير العمل هذا للقياس الكمي للبروتينات التي تقع بالقرب من حد الكشف.
وقد تم تطبيق هذا العمل بروتينيه عبر العديد من الطعوم النووية, بما في ذلك كيناسيس, E3 اوبيكويتين ligases, والسقالات أعضاء المجمعات متعددة الوحدات الفرعية. علي افتراض التحقق السليم من الكواشف الأجسام المضادة ، فان التنفيذ الناجح لسير العمل هذا سيؤدي إلى الكشف عن شركاء التفاعل النووي البروتين عاليه الثقة للبروتين من الفائدة.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه التحدي الكبير لW.M.O. من معهد ليندا كرانك لمتلازمة داون وببموجب اتفاقيه تعاونيه في داربا 13-34-RTA-FP-007. نود ان نشكر جيسي كورلاند وكيرا كوتزيينو علي مساهماتهم في القراءة والتعليق علي المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
| acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
| benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
| HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
| Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
| Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
| p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
| Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
| Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
| TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
| TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
| Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
| Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
| Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |
References
- Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
- Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
- Mahmood, N., Xie, J. An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
- Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
- Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
- Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
- Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
- Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
- Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
- Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
- Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
- Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
- Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
- Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
- Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
- Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).
