Beskrivs är ett proteomik arbetsflöde för att identifiera protein interaktion partner från en nukleär subcellulär fraktion med hjälp av immunoaffinity berikning av ett givet protein av intresse och etikettfri masspektrometri. Arbetsflödet omfattar subcellulär fraktionering, immunoprecipitation, filterstödd provberedning, offlinerensning, masspektrometri och en nedströms bioinformatik-pipeline.
Immunoaffinity rening masspektrometri (IP-MS) har vuxit fram som en robust kvantitativ metod för att identifiera protein-protein interaktioner. Denna publikation presenterar en komplett interaktion proteomik arbetsflöde som utformats för att identifiera låg förekomst protein-protein interaktioner från kärnan som också kan tillämpas på andra subcellulära fack. Detta arbetsflöde innehåller subcellulär fraktionering, immunoprecipitation, provberedning, offline Cleanup, Single-Shot etikettfri masspektrometri, och nedströms beräknings analys och datavisualisering. Vårt protokoll är optimerat för att upptäcka compartmentalized, låg överflöd interaktioner som är svåra att identifiera från hela cellen celllysat (t. ex., transkription faktor interaktioner i kärnan) genom immunoprecipitation av endogena proteiner från fraktionerade subcellulära fack. Provet beredning pipeline beskrivs här innehåller detaljerade anvisningar för beredning av HeLa cell kärn extrakt, immunoaffinity rening av endogent bete protein, och kvantitativ masspektrometri analys. Vi diskuterar också metodologiska överväganden för att utföra storskaliga immunoprecipitation i masspektrometri-baserade interaktions profilering experiment och ge riktlinjer för att utvärdera datakvalitet för att skilja sant positivt protein interaktioner från icke-specifika interaktioner. Detta tillvägagångssätt demonstreras här genom att undersöka den nukleära interactome av CMGC Kinas, DYRK1A, en låg förekomst proteinkinas med dåligt definierade interaktioner inom kärnan.
Den mänskliga proteomen uppvisar stora strukturella och biokemiska mångfald genom bildandet av stabila multisubunit komplex och transienta protein-protein interaktioner. Följaktligen krävs identifiering av interaktions partner för ett protein av intresse ofta i utredningar för att riva upp molekylära mekanismen. Senaste framstegen inom affinitetsrenings protokoll och tillkomsten av högupplöst snabb skanning masspektrometri instrumentering har möjliggjort enkel kartläggning av protein interaktion landskap i en enda opartisk experiment.
Protein interaktions protokoll använder ofta ektopiska uttrycks system med affinitetsmärkta fusions konstruktioner för att identifiera proteininteraktioner utan att behöva högkvalitativa antikroppar som erkänner ett protein av intresse1,2. Emellertid, epitop tagg-baserade metoder har flera nackdelar. Fysiska interaktioner med epitopen kan leda till detektion av icke-specifika copurifying proteiner3. Dessutom, fusion av dessa epitop taggar till N-eller C-terminalen av ett protein kan blockera infödda protein-protein interaktioner, eller störa proteinveckning för att främja icke-fysiologiska konformationer4. Dessutom överuttrycker ektopiska uttrycks system vanligtvis bete proteinet vid suprafysiologiska koncentrationer, vilket kan resultera i identifiering av Artifakt proteininteraktioner, särskilt för dos känsliga gener5. För att kringgå dessa frågor, kan det endogena bete proteinet immunoprecipitated tillsammans med tillhörande samverkande bytes proteiner, förutsatt tillgången på en högkvalitativ antikropp som erkänner det inhemska proteinet.
Här finns en interaktion proteomik arbetsflöde för att upptäcka den nukleära interactome av ett endogent protein med hjälp av CMGC proteinkinas DYRK1A som ett exempel. Störningar av DYRK1A kopierings nummer, aktivitetsnivå eller uttryck kan orsaka allvarliga intellektuella funktionshinder hos människor, och embryonal dödlighet hos möss6,7,8,9. DYRK1A uppvisar dynamisk spatiotemporal regulation10, och uppdelade proteininteraktioner11,12, som kräver metoder som kan upptäcka låg överflöd interaktion partner specifika för olika subcellulära fack.
Detta protokoll sysselsätter cellulär fraktionering av mänskliga HeLa celler i Cytosol och nukleoplasm fraktioner, immunoprecipitation, provberedning för masspektrometri, och en översikt av en bioinformatisk pipeline för att utvärdera datakvalitet och visualisera resultat, med R-skript som tillhandahålls för analys och visualisering (figur 1). Proteomik mjukvarupaket som används i detta arbetsflöde är alla fritt tillgängliga för nedladdning eller kan nås via ett webbgränssnitt. För ytterligare information om programvara och beräkningsmetoder finns djupgående handledningar och instruktioner tillgängliga på de länkar som tillhandahålls.
Den proteomik arbetsflöde som beskrivs här ger en effektiv metod för att identifiera högt förtroende protein interactmedlemmar för ett protein av intresse. Den här metoden minskar urvalet komplexitet genom subcellulära fraktion och fokuserar på att öka identifiering interaktion partner genom robust provberedning, offline prov städa upp och strikt kvalitetskontroll av LC-MS-systemet. Nedströms dataanalys som beskrivs här möjliggör en enkel statistisk utvärdering av de proteiner som identifierats som copurifying med betet. Men på grund av ett stort antal experimentella variabler (skala, cellinje, antikropps val), varje experiment kräver olika cutoffs och överväganden när det gäller datavisualisering och berikning.
Den första utformningen övervägande i ett IP-MS-experiment är valet av antikroppar som kommer att användas för copurification av proteinet av intresse tillsammans med dess samverkande partners. Även om tillgängligheten av kommersiella antikroppar har expanderat för att täcka större delar av den mänskliga proteomen under de senaste decennierna, finns det fortfarande många proteiner som reagenser är begränsade. Dessutom kan antikroppar som har validerats för tillämpningar som västerländsk blot-detektion vara oförmögna att selektivt berika målproteinet i ett experiment med immunoprecipitation. Innan man genomför en storskalig interaktion proteomik experiment, det föreslås att slutföra en IP från en 90% konfluenta 10 cm skålen, eller motsvarande cell nummer, och sond för målet protein av intresse genom Western blotting. Om mer än en enda antikropp är tillgänglig för immunoprecipitation, det föreslås dessutom att välja flera antikroppar erkänna epitoper inom olika delar av proteinet. Bindningen av en antikropp till ett bete protein kan ockludera det nödvändiga bindnings gränssnittet för förmodade samverkande partners. Val av en sekundär epitop för bete protein kommer att öka täckningen av interaktionsprofilen identifierats av en masspektrometri-baserade experiment.
En andra viktig faktor ligger i valet av lämplig kontroll för att särskilja hög-förtroende interaktioner från lågt förtroende eller ospecifik interaktion från dem som identifierats som copurifying med betet. Den strängaste kontrollen för ett IP-MS-experiment är att slutföra immunoprecipitation från en CRISPR KO-celllinje i betet. En sådan kontroll möjliggör identifiering och filtrering av icke-specifika proteiner som binder direkt till antikroppen snarare än bete proteinet. I de fall där det inte är möjligt att generera en CRISPR KO-celllinje av varje bete protein, kan en IgG-pärlkontroll av samma isotyp av betes antikropp användas. I experiment som sysselsätter en panel av antikroppar som representerar flera arter, kan användningen av en pärlor endast kontroll vara lämpligt, men kommer att öka andelen falska positiva identifieringar som hög-förtroende interactors.
Valet av den cellrad som används i ett IP-MS-experiment är beroende av flera nyckelfaktorer. Protein uttryck och lokalisering är till stor del beroende av celltyp. Även om RNA uttrycks uppskattningar kan hittas för de flesta gener i många vanliga cellinjer, är protein uttrycket dåligt korrelerat med RNA-uttryck och måste bestämmas experimentellt25. Cellinjer där ett bete protein uttrycks i mycket låg kopienummer bör undvikas för att kringgå problem i samband med drastiska ökningar i cellkultur skala som kan krävas. Det bör dock noteras att provberedning kan optimeras för detektion av mycket låg förekomst proteiner. Den filterstödda prov prep-metoden (FASP), samtidigt som den är robust, kan orsaka mer än 50% förlust av peptid i ett prov. Single-Pot solid-fas-förstärkt Provberedning (SP3) är en effektiv metod för att generera prover för masspektrometri analys som minimerar prov förlust26. Den ökade återhämtningen som möjliggörs av SP3-metoden för provberedning kan vara ett användbart alternativ i detta arbetsflöde för kvantifiering av proteiner som faller nära detektionsgränsen.
Denna proteomik arbetsflöde har tillämpats på många nukleära beten, inklusive kinaser, E3 ubiquitin Ligaser och ställningar medlemmar av multisubunit komplex. Förutsatt korrekt validering av antikropp reagenser, framgångsrikt genomförande av detta arbetsflöde kommer att resultera i detektion av hög-förtroende protein kärn interaktion partners för ett protein av intresse.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en stor utmaning bidrag till W.M.O. från Linda Crnic Institute for Down syndrom och av en DARPA samarbetsavtal 13-34-RTA-FP-007. Vi skulle vilja tacka Jesse Kurland och Kira Cozzolino för deras bidrag i läsning och kommentera manuskriptet.
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
Phosphate Buffered Saline | |||
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |