Summary
这里介绍的是一个协议，用于氮化硅膜上的细胞培养和在X射线荧光成像之前使用同步加速器低温X射线纳米探针进行跳投。当只提供室温纳米分析时，冷冻样品可以进一步冷冻干燥。这些是获得细胞内元素组成信息的关键步骤。
Abstract
关于金属离子在亚细胞水平上的分布知之甚少。然而，这些化学元素具有基本的调节功能，其紊乱的平衡涉及各种疾病。最先进的同步加速器 X 射线荧光纳米探针提供所需的灵敏度和空间分辨率，以阐明整个细胞内的二维 （2D） 和三维 （3D） 分布和金属浓度。细胞器水平。这为金属在细胞物理病理学中的作用开辟了令人振奋的科学领域。细胞制备是一个关键且通常很复杂的过程，尤其是对于基本分析。虽然X射线荧光技术现在广泛存在，并且已经使用了各种制备方法，但很少有研究研究到细胞元素含量的保存，也没有关于冷冻制备的逐步详细方案。到目前为止，X射线荧光纳米探针的粘附细胞已经释放出来。这是一个协议的描述，该协议为快速冷冻提供分步细胞制备，以便在低温环境和转移可用时，实现对处于冷冻水合状态的细胞进行同步辐射 X 射线荧光纳米分析。如果必须在室温下进行纳米分析，则提供冷冻干燥冷冻粘附细胞制剂的额外程序。建议的方案已经成功地用于以前的工作，最近研究乳腺癌细胞中有机金属化合物的2D和3D细胞内分布。
Introduction
新设计的同步加速器 X 射线荧光 （SR-XRF） 纳米探针允许以完全定量的方式可视化元素的亚细胞分布。例如，这种分析能力允许研究纳米粒子1或有机金属分子的利用，如基于氧化铝的复合物2，从而深入了解具有强效抗癌特性的金属基分子的细胞内接受。作为一种多元素技术，SR-XRF3采用纳米探针，可同时量化和本地化细胞内最重要的生物元素，包括磷、硫、钾、钙、铁、铜和锌。事实上，使用硬X射线提供了很大的穿透深度，以无标签的方式成像整个冷冻水合细胞。此外，X射线荧光提供对大多数感兴趣元素的K边缘的访问，是最有效的激发。使用低温方法可以减少辐射损伤，优化细胞结构和元素分布的保存。
研究细胞中金属的大部分空间解析分析技术是表面技术，需要产生非常薄和扁平的细胞部分。这主要包括扫描透射电子显微镜与能量分散X射线分析（STEM_EDX），能量过滤传输电子显微镜（EF-TEM）和纳米级二次电离质谱（纳米SIMS）。后者不能在冷冻、水合细胞部分执行，而冷冻分析可以通过具有无与伦比的空间分辨率但元素灵敏度差的电子显微镜进行。粒子引起的X射线发射（PIXE）允许研究整个细胞中的元素分布。它的优点是，在微米尺度上，甚至在亚微米分辨率4下，具有完全定量和公平元素灵敏度的优点，但受到辐射损伤和缺乏低温能力来研究冷冻水合细胞。所有这些分析技术在细胞元素成像中相互补充，但对于所有技术，样品制备过程是关键步骤。应保持简单，以限制可能的污染以及元素再分配和/或泄漏，以获得有意义的结果。正如在电子显微镜中所证明的，低温工作流程，包括细胞的低温固定和低温转移到低温扫描阶段，允许在亚细胞水平上尽可能接近原生状态5、6、7、8、9、10的最佳元素保存。这一理解已成功实现同步加速器低温-软X射线显微镜（例如，全场显微镜和扫描显微镜）的开发，以2D或3D生产整个冷冻水合细胞的超结构成像。在劳伦斯伯克利国家实验室12高级光源Beamline2.1（XM-2）开发了11种低温工作流程，在电子存储环BESSY II（德国）13开发了光束线U41-XM，ALBA光源的光束线MISTRAL14，以及钻石光源15的Beamline B24等。最近，一个类似的工作流程被证明是使用X射线微探针16、17进行细胞内元素分析的最可靠的制备和保存方法。
虽然X射线纳米探针技术开始广泛用于细胞元素分析，特别是随着低温SR-XRF功能的出现，迄今尚未向研究界传播任何逐步协议。在这里，提供了一个详细的程序，以制备低温粘附细胞培养为单层在氮化硅膜上进行分析的低温条件下。此外，在协议之后，如果必须在室温下进行 X 射线分析，则提供冷冻干燥步骤。虽然该方案已经成功地用于人类乳腺癌细胞MD-MB-2312和冷冻干燥在小鼠神经元18，20，21等，它可以很容易地扩展到不同类型的人类或动物细胞。
Protocol
实验程序由CEA生命科学司的动物护理委员会（CETEA，A14-006）批准。它们是按照法国立法和欧洲共同体理事会1986年11月24日指令（86/609/EEC）进行的。
1. 氮化硅 （Si3N4） 膜支持制备
注：由于膜脆弱而细腻，其支撑（200 μm厚硅框架）必须轻轻处理，最好使用薄碳钳或杜蒙特钳子#5，直自闭精细尖端。该协议使用框架为 5 mm x 5 mm、膜尺寸为 1.5 mm x 1.5 mm 的氮化硅膜。在开始实验前，膜应准备大约12小时（即细胞播种）。膜可以在一天结束时制备，并在 II 类层流罩下过夜干燥，以便第二天早上即可使用。对于大多数销售氮化硅窗口的公司来说，硅框架厚度为 200 μm 是标准配置。如果该协议中使用的产品不可用，则可在标准框架尺寸为 5 mm x 5 mm 时使用 0.5×1.5 mm 的膜尺寸。使用 X 射线断层扫描时，首选较大的膜尺寸。也可以使用膜尺寸为 0.5 mm、厚度为 50 nm 的 TEM 网格型氮化硅窗口。
- 打开含有Si3N4膜支架的胶囊（图1）。轻轻挤压胶囊，轻轻松开支架。
- 使用薄钳子握住硅架的一个角。小心不要触摸中间的 Si3N4膜。200 或 500 nm 厚的膜很容易损坏。
- 使用薄钳子，轻轻地将Si3N4膜支架放入无菌玻璃培养皿中，朝上氮化硅窗口的平面（即面向盘子底部的腔）。
- 取下培养皿的盖子，将膜放在紫外线下 25-30 分钟，放在层流柜下。
注：UVC灯（254 nm）通常设置为200μW/cm2。 - 将10μL的多L-莱辛放在膜上。滴应覆盖 Si3N4膜，并可以稍微扩散到硅框架上。在标准组织培养箱中，在37°C下保持25分钟，相对湿度为100%，空气为95%，CO2为5%。
注：在这种情况下，MDA-MB-231乳腺癌细胞使用了多L-莱辛涂层。根据细胞系的类型，可以使用各种涂层，此步骤应相应地进行优化。 - 在无菌 48 孔板中，通过 0.22 μm 无菌过滤器过滤的 200~250 μL 超纯和超微量水填充不同的井。通常，每口井可用于冲洗多达 2⁄3 个膜。使用细钳子，拿起膜支架在其硅框架的一角。在三口连续的井中垂直浸入10s，轻轻冲洗膜。
注：膜支架从培养箱取出，可在室温下处理，温度和湿度由 II 类层流罩定义。 - 将膜支架垂直置于无菌 96 孔板的空孔中，盖住它，并在 II 类层流罩下过夜干燥。
2. 细胞播种
- 在无菌 4 孔盘中，将膜的平面朝上放置。
- MDA-MB-231细胞在DMEM的单层培养中保持，在5%CO2空气加湿培养箱中辅以10%胎儿小牛血清和1%的青霉素和链霉素在37°C。
- 当细胞达到60-70%汇合时，从培养皿或烧瓶中取出介质。
- 用10毫升Dulbeco的磷酸盐缓冲盐水洗涤1次，不含Ca2+或Mg2+。
- 加入3 mL/T75烧瓶0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液，确保整个单层覆盖于胰蛋白酶溶液中。
- 在37°C下孵育3~5分钟，直到细胞开始分离。应注意不要过度尝试细胞，不要强迫细胞过早分离。
- 加入8ml DMEM，辅以10%胎儿小牛血清和1%青霉素和链霉素或完整的培养基，并通过移液收集细胞。介质中的血清将中和胰蛋白酶。
- 在室温下，以 250 x g下旋转 3 分钟。吸气上清液。
- 将8ml新鲜完整培养基加入含有细胞颗粒的15ml管中，并上下移液细胞，直到细胞分散到单个细胞悬浮液中。
- 使用血细胞计计数细胞，在完整介质中稀释至每 mL 浓度为 5 x 106细胞（DMEM 与苯酚红/1% 的 200 mM L-丙烯-谷氨酰胺二肽在 0.85% NaCl 溶液中补充 10% 胎儿小牛血清和 1% 青霉素和链霉素）。
- 取10μL的MDA-MB-231细胞悬浮液并将其沉积在膜上。这相当于 MDA-MB-231 的 50，000 个单元/10 μL。滴应覆盖 Si3N4膜井，并可在硅架上扩散一点。应小心不要用微移液器的尖端接触Si3N4膜。
注：根据细胞系的类型和实验或测量，细胞密度可能会有所不同，应相应地进行测试。在这里，建议的Si3N4膜种子的细胞密度被认为是对MDA-MB-231细胞2的实验条件和进一步的SR-XRF纳米分析的最佳选择。 - 对于海马神经元 （HN）， 从胚胎日 18.5 小鼠中取出海马脑组织，并在 Hepes-HBSS 中消化 0.25% 胰蛋白酶 （5.3 mM KCl， 0.44 mM KH2PO4， 137.9 mM NaCl， 0.34 mM NaH2PO4， 5.56 mM M 葡萄糖）， 在 37 °C 1518，19.
- 使用带有 P1000 尖端和 P200 吸头的 P1000 移液器，通过多次使用移液器绘制和释放锥体内容来执行机械解散。在此步骤中，请注意不要在介质中产生气泡，因为气泡对神经元有毒。
- 等待几分钟，直到集材在管的底部稳定下来。
- 将含有分散细胞的上清液转移到无菌 Eppendorf 管中。留下包含聚合的培养基为 ±25 μl。
- 使用血细胞计计算分离的细胞。分离的 HN 神经元在聚L-莱辛 （1 mg/mL- L-lysine） 涂层氮化硅膜上以 7 x 104细胞 cm-2的浓度镀层。
- 仅对于具有 HN 的膜，孵育第一个 DMEM 中的神经元，辅以 10% 胎儿牛血清。在DMEM中电镀HN后一小时，该介质改为神经巴层电镀介质（200 mM L-丙烯-谷氨酰胺二肽在0.85%NaCl溶液中，和B27补充剂d= 1/50稀释在神经巴底）18，19。
- 对于MDA-MB-231细胞，将膜支架在37°C的培养箱中（100%相对湿度、95%空气和5%CO2）放置25分钟。这允许细胞沉降并开始附着在基材上。这可根据所使用的细胞系进行调整。
- 加入1 mL所需的完整培养基（DMEM与苯酚红/1%的200 mM L-丙烯-谷氨酰胺二肽在0.85%NaCl溶液补充10%胎儿小牛 在MDA-MB-231细胞的每个井中，将移液器尖端放在塑料井壁上，在覆盖膜时非常缓慢地释放介质，从而将血清和1%的青霉素和链霉素）放在每个井中。
- 将膜垂直放在 4 孔板壁上，以带走 Si3N4膜井腔中的任何气泡（图 2）。为此，请使用细钳子，轻轻推开气泡，平行于 Si3N4背面框架，以避免接触和损坏膜。
- 根据所使用的细胞系的生长速度，将膜水平放回井底，并将4孔板留在培养箱中，在规定时间内。MDA-MB-231细胞在一夜之间孵育。
3. 治疗或介质变化
- 从 4 孔板上拆下介质。
- 在37°C下用1mL的PBS溶液冲洗一次。丢弃 PBS 并使用 1 mL 移液器尖端在存在或没有所需处理的情况下添加 1 mL 加热的完整新鲜介质，将液体非常缓慢地释放到井板壁上。Si3N4膜应缓慢浸没，没有任何干扰，以避免膜运动或提升。
4. 通过跳降冻结对细胞制备的冷冻固定
注：在要求的孵育时间结束时，在存在或没有治疗的情况下，细胞必须仔细冲洗并冷冻。在开始冲洗和在跳转冷冻前进行冲洗和进行污点之前约 30 分钟，首先设置并冷却自动跳台冷冻机。当您操作低温时，需要使用适当的低温手套、安全眼镜、合身的鞋子和实验室外套。液氮必须在适当的 Dewars 中运输，并且工作位置应在氧气监测器存在的情况下充分通风。理想情况下，20-30%的低湿度水平有助于限制材料、Dewars 和低温的冰污染，这对样品的冰化（即非晶形冰层）有害。理想情况下，根据研究人员的经验水平，可以使用相同的二次低温液液伊森杯制备单个会话的多达 10-12 个样品，用于葡萄化。在会话之间，自动跳台冷冻机需要 1 小时自动烘烤程序。理想情况下，样品的加工条件应相同。尽管如此，控制可以先处理，然后是具有特定治疗条件的样本。
注： 对于跳投冻结，以下步骤适用于 MDA-MB-231 或 HN 单元。
- 设置冷冻柱塞，以便细胞快速冷冻。
- 打开自动跳台式冰柜。
- 直接从控制台和参数输入参数（例如温度、湿度百分比、使用自动印迹时的印迹时间，以及将样品提升到低温原表面的位置，以方便转移到低温容器）设置菜单。在本例中，湿度室的参数设置为37°C和80%湿度。
注：通过快速、细致的手动印迹，该协议和X射线成像获得了更好的抗比结果。因此，该协议不使用自动印迹序列程序。 - 附加加湿器室，为了保持湿度，首先使用 60 mL 的双蒸馏水注射器填充，然后在自动冷冻控制台上按要求加注 20 mL。
注：避免使用超纯水，因为它可能会损坏蒸发器系统。关闭阀门，将油管固定在加湿器背面。 - 将黑色伊森杯安装到支架中，用塑料盖盖住它。
- 用LN2填充冷室的Dewar，使其达到工作区域内的网格水平。
- 在 EM-GP 工作区的专用位置和靠近伊森杯支架的转移容器中放置一个专用冷冻盒，将冷冻后膜存放。
注：专用冷冻箱是格勒诺布尔欧洲同步辐射纳米探波束线ID16A的内部开发。可应要求提供具有规格的图纸（图3）。它们一次可储存四个，一次储存在 50 mL 锥形管中，用于长期存储在 LN2 Dewar 中。另一种可能性是使用带圆顶盖的小型 0.2 mL 常规 PCR 薄壁管来存储单个 Si3N4膜支撑。您需要使用加热注射器针在壁管顶部钻一个 ±2 mm 孔，以便 LN2填充管。 - 用 LN2填充传输容器，然后用专用铝盖盖住它。继续用 LN2填充冷室（通常需要 +2 L），保持控制台上的 LN2级显示器显示屏的 100%。等待，直到达到最终要求的温度。
- 取下塑料盖，用液化液连接到伊森瓶盖住伊森杯。等待，直到当当当当中的伊森杯温度与温度设定点平衡。达到时，开始使用二次低温原（即液化成石。
注：使用的设定点是-180°C，略高于酸化熔点（-182.8 °C）。您无需预冷却液化液，因为它可能是沙结和受生母杯污染的来源。 - 打开高纯度的伊塔瓶主阀，缓慢地打开压力调节器，直到得到缓慢的气雾。保持这种非常低的流量，直到液体伊森积聚。将杯子填充到其顶部边缘。关闭压力调节器和伊森瓶的主阀。小心地取下 Leica 液化液，并将其放在烟气罩下的小型聚苯乙烯支架上。保持工作区域松散地覆盖与机器随附的黑色聚苯乙烯盖，以防止工作区域和伊森容器受到霜冻污染。
- 在手动印迹样品之前，取下黑色聚苯乙烯盖，并从控制台按压"下腔室"的菜单中取出，使环境室与低温工作区域接触。
- 准备对样品进行斑点。
- 准备足够的缓冲液，从培养基中去除盐的痕迹。对于该协议，醋酸铵缓冲液用于对MDA-MB-231细胞进行排温。
注： 醋酸铵缓冲液适用于大多数细胞类型，不会添加到 X 射线荧光信号（考虑具有 Z > 9 的元素）。某些特定的细胞系（如神经元细胞）可能需要使用专用缓冲液。例如，对于原发性皮质神经元，可以使用由 1.8 体积的 0.5 M Na2HPO4和 1.9 体积的 0.5 M NaH2PO4组成的盐水溶液。15。另一方面，缓冲液中所含的磷或氯将有助于XRF光谱。必须牢记这种对虚假 X 射线发射线的限制，具体取决于要检测的感兴趣元素。 - 用醋酸铵超纯溶液制备150 mM醋酸铵溶液，并检查pH值（7.0~7.3）和渗透度（270~300 mOsm/kg）
注：上述渗透度相当于Dulbeco的磷酸盐缓冲盐（D-PBS），不含钙和镁，可使用微渗透仪进行检查。 - 使用醋酸铵缓冲液从 12 孔塑料板上填充所需数量的井。
- 从带有预切孔的 1 号滤纸中，或从直径为 55 mm 的手动冲孔纸中切割四分之一的滤纸，以便进行印迹，
- 在最后一刻以37°C在培养箱中采集所需的样品，然后进行冲剂和柱塞冷冻膜。
- 使用快速释放钳子的黑色夹环（通常是 Dumont 夹紧环高精度医用钳子）解锁钳子，并从培养井中抓住 Si3N4膜支架。
注：抓住硅框架的中间，将钳尖靠近膜。将黑色夹环向下移到第一条条纹上，以锁定钳子。 - 将Si3N4膜垂直浸入醋酸铵缓冲液中，在37°C下保持±5s。
注： 支持应在缓冲区中保持垂直。请注意，在相同的孵育条件下，每个孔中的缓冲液可用于多达三个膜。 - 用滤纸手动排出膜洗面溶液中多余的缓冲液（图4），以留下一层细而均匀的醋酸铵水溶液覆盖细胞。
注：为此，首先将车窗背面按到滤纸上，以去除井中和膜背面剩余的几乎所有水缓冲液。其次，从钳子的两侧开始，然后两侧框上，然后去污点（图4）。切勿触摸膜。使用滤纸上形成的奥列尔可以监测排出的缓冲液的过剩。 - 打开环境室门，快速安装钳子，将其滑入钳内联锁，然后关闭门（图5）。
- 按"Blot/A 暴跌"。拿着Si3N4膜的钳子会迅速陷入低温原中。
- 用预冷却钳取下转移容器的盖子。
- 按"转移"。Si3N4膜将稍微向上移动，高于低温原。
- 在一次快速移动中，通过将钳子从钳内锁中滑出并稍微从联锁中倾斜来断开钳子的连接，直接放入装有 LN2的传输容器中的冷冻箱空槽中。释放黑色夹环以释放膜 （图 5）。
注： 传输容器应始终覆盖 LN2。当需要重新加注时，用机器随附的塑料盖盖住伊森杯，以避免混合 LN2和伊森。 - 用盖子盖住转移容器，并使用装有LN2的白色聚苯乙烯杯将其转移到装有LN2的聚苯乙烯盒中。
注：装有膜的冷冻盒或管可以储存在50 mL圆锥管中，充满LN2，并转移到长期存储LN2 Dewar。在开始冷冻下一个样品之前，用吹风机或热板/冷冻工具干燥机（45°C）加热所有冷霜和霜冻的钳子，以避免受到冰晶的污染。
- 准备足够的缓冲液，从培养基中去除盐的痕迹。对于该协议，醋酸铵缓冲液用于对MDA-MB-231细胞进行排温。
5. 在氮化硅膜上培养的柱冻细胞的冷冻干燥
注：对于冷冻干燥，以下步骤适用于 MDA-MB-231 和 HN 电池。要冷却冷冻干燥机，您需要等待大约 40 分钟到 1 小时。
- 设置冷冻干燥机
- 使用位于仪器后面板上的摇臂开关打开电源。
- 开始输入 LCD 菜单后的参数：段 1 = 2 小时，温度 -120 °C;段 2 = 2 小时斜坡，从 -120 °C 到 -80 °C;段 3 = 2 小时，温度 -80 °C;段 4 = 2 小时斜坡，从 -80°C 到 50 °C;段 5 = 2 小时，温度 -50 °C;段 6 = 6 小时斜坡，从 -50°C 到 30°C。
- 在参数设置结束时，保存设置，关闭造型室盖并按"START"。
- 该装置将泵降至 1.10-5 mbar。当达到此压力时，显示屏的命令行将显示"立即开始冷却，开始继续"。
- 定期填充液氮 Dewar，以冷却温度三点设置以下的阶段。
注：三分级温度设置为-140 °C。在加载此协议的示例之前，最好等待大约 1 小时，温度阶段为 -160°C。 - 当准备"加载示例"时，显示屏将显示"按 ENTER"。
- 在 LN2填充聚苯乙烯 Dewar（供应商提供的样品转移支架）和两个额外的黄铜圆柱形 Si3N4膜支架内冷却至液氮温度。
- 将 Si3N4膜黄铜支架安装在供应商提供的聚苯乙烯 Dewar 中提供的样品转移支架上（图 6A）。将 LN2的电平保持在第一黄铜件顶部边缘以下约 1⁄2 mm。
- 在异氧化物或特氟龙涂层中使用预冷却自闭钳从冷冻盒或 PCR 管中取取 Si3N4膜样品支架。
- 将细胞样品侧朝上沉积在黄铜支架编号腔中。
- 用第二块黄铜片盖住组件（图6C）。
注：我们设计了两个黄铜盘，每个圆盘的厚度为5毫米，直径为50毫米，中央直径为11毫米。第一个黄铜盘具有 14 个加工矩形 （8 mm x 6 mm） 位置，以容纳支架（5 毫米 x 5 毫米）。每个插槽都有一个平坦和抛光井，深度为 2 mm。第二个黄铜盘是平的，覆盖Si3N4膜黄铜支架，并充当冷陷阱外壳。 - 将转移杆预冷却在 LN2填充聚苯乙烯泡沫盒中，并用它来锁定整个组件（图 6D，E）。
- 按冷冻干燥机前面板上的"ENTER"。
- 涡轮和旋转泵将停止，腔室将清除干氮气，以便打开造型室的盖子。
- 立即将样品转移组件与弹簧加载的转移杆转移到冷冻干燥器室中，并将其夹在铜 LN2冷级上。
注：将带转移杆的完整组件留在造型室中。 - 立即关闭冷冻干燥室的盖子，然后按"START"继续冷冻干燥循环。
- 每 2 小时手动加注冷冻干燥器的 LN2储液罐。
注：自动 LN2加注系统可能连接到此储液罐。 - 在冷冻干燥周期结束时，按"STOP"向腔室通风，然后拆下整个组件以进入冷冻干燥样品。
Representative Results
图7A显示了对在聚L-莱辛涂层Si3N4膜支架上进行亚培养的冷冻水合物MDA-MB-231细胞的典型光学视频显微镜视图。真空室中样品的光学视图是在反射模式下使用ESRF2的ID16A光束线的专用在线视频显微镜获得的。虽然电子或软 X 射线显微镜要求嵌入细胞的冰层尽可能薄（通常为 <0.5 μm），但硬 X 射线 （>10 keV） 具有更高的穿透深度和较低剂量沉积的优势。因此，冰的厚度可以更大，通常为<10 μm，包括细胞，以便嵌入细胞的冰厚度为几微米。这可以通过测量的X射线强度在传输中与没有样品的强度进行比较，考虑到500nm厚的Si3N4膜的吸收。这种冰厚度可以通过手动印迹来实现，如本协议所述。在牛顿环区域，冰厚度可能更薄（不测量）。
图7B显示了冷冻水合细胞的X射线荧光元素图谱，其中显示了钾（K）、硫（S）和锌（Zn）等生理元素的代表性分布。这些地图表示元素质量（即元素投影质量）。虽然在本例中没有完成，但可以通过基于X射线传播的相位对比度成像来标准化这些地图，该成像提供样本投影质量23的估计值。正如许多研究所报道的，在保持其近原生状态的细胞中，高度扩散的K型子被认为均匀地分布在整个细胞23、24、16。如图7B中的2D X射线荧光元素图像所示，紧密结合的元素S均匀地分布在细胞内，与K类似，并代表细胞质量特征的良好估计值。锌分布在原子核中的信号比在细胞醇中高，并清楚地勾勒出细胞核。可以注意到，在核区域的空间分辨率（50nm）上可以检测到小的锌富集区域。
现有的X射线纳米探针或要建造的不一定能容纳低温功能。在这种情况下，在低于100nm空间分辨率下获取细胞X射线荧光图像的最佳替代方法是在细胞柱冻结后执行本协议中所述的冷冻干燥程序。图 8A显示了在 Si3N4膜上直接培养的冻干原小鼠海马神经元的典型明亮场显微镜视图。在这种情况下，如果储存在干净的干燥室中，样品可以提前1-2周制备，并用普通直立光学显微镜观察，以登记感兴趣的区域。应注意防止暴露于环境湿度，因为它可能被冻干样品捕获，并导致 X 射线纳米束下损坏。这个程序成功地应用于非常敏感的细胞（即神经元细胞），甚至更好的结果与其他更健壮的细胞类型，如癌细胞。至于柱冻细胞，整个冷冻干细胞显示屏上的K、S和Zn的X射线荧光图像与上述图像相似。它们代表了以50-100nm空间分辨率在各类冻干细胞中发现的元素分布。虽然冷冻干燥的整个细胞是保持元素完整性的替代方法，但它是以细胞形态16，特别是细胞膜的完美保存为代价的。
图1：X射线荧光纳米分析的典型样品支持。Si3N4膜在其保护胶囊中支撑。这种类型的基板可用于室温分析（柱状冷冻细胞制剂，然后是低温和低真空冷冻干燥工艺）或低温X射线荧光分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：细胞播种后氮化硅窗口的原理图视图。细胞直接培养在Si3N4膜支架的聚L-莱辛涂层平面上。有时，气泡可能被困在 Si3N4膜支架的背面腔中，必须像协议中所述进行去除。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：内部开发的3D打印冷冻箱，用于长期储存液氮德瓦中冷冻的Si3N4膜支架。（A） 冷冻箱与容器和盖（下部）和 （B） 组装的冷冻箱，带上锁盖。盖可以使用钳子操作，通过旋转打开或锁定。根据 ESRF ID16A 的要求，可提供 3D 打印的详细计划。设计旨在适应氮化硅 TEM 网格。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在Si3N4上培养的细胞的印迹。在进行跳槽冷冻之前，培养在Si3N4膜上的细胞单层需要用醋酸铵溶液（A）冲洗，并使用滤纸（B）小心手动过滤。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：自动跳投冻结EM-GP机。（A） 自动跳水机.（B） 环境室，锁上钳子 . （C） 用莱卡液化剂覆盖的乙醚杯连接到乙醚瓶.（D） 柱形冷冻外壳显示黑色杯，里面装满了液化的电石，而冷冻盒则进一步储存在玻璃化 Si3N4膜的 LN2中。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：用于冷冻干燥过程的样品冷冻转移组件。（A） Si3N4膜的第一个黄铜接收器安装在冷冻干燥器供应商提供的样品转移支架的顶部。（B） 和 （C） 显示第二个扁平黄铜盘用作盖板，并用作冷疏水阀外壳，以插入冷冻干燥器的真空外壳。（D） 带弹簧负载输送杆的完整组件。（E） 携带 Si3N4膜上生长的玻璃化细胞制剂的样品支架必须进一步插入 LN2冷却冷冻干燥机中。安装组件的所有步骤均在 LN2中，在发泡胶盒中完成。为清楚起见，所有图像都是在没有LN2的情况下产生的。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：使用硬X射线纳米探针的冷冻水合细胞的冷冻X射线荧光图像。（A） 使用ESRF ID16A光束线的专用光学视频显微镜在反射模式下的典型在线视图。手动印迹后，达到约5~10微米的冰厚，可以清晰查看冷冻水合细胞。牛顿环表示冰层更薄的区域是明显的。（B） 代表性低温-X射线荧光细胞分布的生理元素钾（K）、硫（S）和锌（锌）。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：使用硬X射线纳米探针的冻干神经元细胞的X射线荧光图像。（A） 典型明亮的场显微镜视图的结果冻结干燥的原皮质神经元细胞直接培养在Si3N4膜上。刻度条 = 200 μm （B） 代表室温 X 射线荧光图像，显示单个冷冻干燥的海马神经元的分布，显示生理元素钾 （K）、硫 （S） 和锌 （Zn） 的分布。比例尺 = 2 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
低温电子显微镜（Cryo-EM）荣获2017年诺贝尔化学奖，因此，J.Dubochet在生物材料的硝化方面进行了开发，用于在溶液25中解析生物分子的高分辨率结构测定。正如杜博切特在他的诺贝尔演讲中所报道的"知道如何对一滴水进行颤化是一回事，准备生物样本进行生物观测是另一回事"。冷冻制备步骤现在被认为是减轻辐射剂量损伤和研究接近其原生状态的细胞的标准技术。然而，准备工作仍然单调乏味。这是因为电子显微镜由于其无与伦比的空间分辨率，对样品制备过程中发生的任何超结构伪影都十分敏感。同步加速器低温探针正在接近类似的困难，在高能X射线范围26下，空间分辨率低至13纳米。硬X射线显微镜可以分析整个细胞，而电子显微镜则受电子穿透深度差的影响，只能观察到非常薄的细胞片。
单层细胞足够薄，因此通过在液体伊森太中冷冻，达到水硝化所需的冷却速率。理论上，使用高压冷冻27可实现高达 108 K/s 的冷却速率，这使得样品的压度太厚，无法进行压冻。使用自动跳投冷冻机和此处介绍的参数，使样品在环境压力28下完全实现压化所需的冷却速率为105 K/s。这允许研究人员通过液体伊森太中冷冻，使单个细胞的细胞12、13、14、15、29、30等薄生物标本（<10μm）得到冷冻。
该协议的一个重要挑战是，还要尽可能保持细胞内含量的化学完整性，以在细胞内以2D或3D提供可靠的元素分布。正如在其他地方发表的第2、16、17、31中所发表的，在亚细胞水平上进行元素成像时，应考虑对冷冻水合细胞的分析。否则，细胞的柱冻和冷冻干燥的组合可用于室温分析。对于后者，非晶冰通过升华过程被去除，而结合的水分子通过解吸过程被去除。与冷冻水合物样品相比，由于细胞膜的可能改变和某些亚细胞结构的形态32，这个过程可能远非理想。此外，对于物种研究，水提取可能导致金属物种化伪影。尽管如此，它还是成功和冷冻水合样品的最佳替代品，用于在低于100nm水平2，16，17，18，20，33，34，35，36元素成像。
据37日报道，冷冻细胞制剂的质量可以通过钾与钠K/Na比来评估。不幸的是，由于用于检测元素的X射线荧光光子（E = 1.3 keV镁）的硅漂移探测器的能量截止，目前还不能确定这里使用的硬X射线纳米探针。事实上，可以使用TOF-SIMS、EPMA或核微探针PIXE16、37测量的高K/Na比（>10），表明细胞的化学完整性与活细胞37中预期的K/Na25相比，是保存下来的。这可以通过伴随的低Cl/K比率38来支撑。然而，不完美的玻璃化，特别是如果样品冷却速度太低，会导致形成大冰晶，从而破坏细胞膜和细胞器，从而改变化学元素的分布。虽然没有常规程序来监测这种潜在的损害和对细胞内分布的影响，但上述元素比率以及使用X射线相对比或低温-软X射线显微镜以高分辨率成像细胞的可能性可能是支持细胞内腔内良好保存以及同时保持元素完整性的最佳方法。这些技术与新开发的低温相关荧光光学显微镜的结合将有助于评估这种损伤发生的程度，并影响细胞内元素分布。
总体而言，提出了一种详细而全面的方案，用于制备用于同步辐射X射线荧光纳米分析的细胞样品。这是研究界的良好起点，有助于解决如何为（低温）硬X射线纳米探针的2D和3D元素成像准备合适的细胞样本这一难题。这些方法可以与光学荧光和电子显微镜功能相结合，用于细胞的深入相关化学和结构成像。
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
在ESRF方案LS2430、LS2303和LS2765的帧中进行了纳米成像光束ID16A的实验。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
| B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
| DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
| Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
| Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
| Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
| Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
| HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
| Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
| MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
| Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
| Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
| Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
| poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
| Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
| Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco... |
| Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
| Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
| Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |
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