Här presenteras ett protokoll för cellodling på kiselnitridmembran och djupfrysning före röntgenfluorescensavbildning med en synkrotron kryogen röntgennanosond. När endast nano-analys av rumstemperatur tillhandahålls kan de frysta proverna frystorkas ytterligare. Dessa är kritiska steg för att få information om den intracellulära elementära sammansättningen.
Mycket lite är känt om distributionen av metalljoner på subcellulär nivå. Emellertid, dessa kemiska element har viktiga reglerande funktioner och deras störd homeostas är inblandade i olika sjukdomar. State-of-the-art synkrotron röntgen fluorescens nanosonder ger erforderlig känslighet och rumslig upplösning för att belysa den tvådimensionella (2D) och tredimensionell (3D) distribution och koncentration av metaller i hela celler på organellnivå. Detta öppnar nya spännande vetenskapliga områden av utredning på rollen av belägger med metall i physiopatologin av cellen. Den cellulära beredningen är en viktig och ofta komplicerad procedur, särskilt för grundläggande analys. Även om röntgenfluorescensmetoder nu är utbredda och olika beredningsmetoder har använts, har mycket få studier undersökt bevarandet av elementarhalten i celler i bästa fall, och inga stegvisa detaljerade protokoll för frys reparation av anhängare celler för röntgen fluorescens nanoprober har släppts hittills. Detta är en beskrivning av ett protokoll som ger den stegvisa cellulära beredningen för snabb kryofixering för att möjliggöra synkrotron röntgen fluorescens nano-analys av celler i ett fryst hydrerat tillstånd när en kryogen miljö och överföring är tillgänglig. Om nano-analys måste utföras i rumstemperatur, finns ytterligare ett förfarande för frystorkning av den kryofasta anhängare cellulär preparationen. De föreslagna protokollen har framgångsrikt använts i tidigare verk, senast i att studera 2D-och 3D-intracellulär distribution av en organometallisk förening i bröstcancerceller.
Nydesignade nanosonderna synkrotron X-ray fluorescens (SR-XRF) möjliggör visualisering av subcellulär distribution av element på ett fullständigt kvantitativt sätt. Som ett exempel, denna analytiska förmåga möjliggör utredning av upptaget av nanopartiklar1 eller Metallorganisk molekyler såsom osmium-baserade komplex2, ger insikt i den intracellulära upptaget av metallbaserade molekyler med potenta cancer egenskaper. Som en multielement teknik, SR-XRF3 med en nanoprobe ger ett sätt att samtidigt kvantifiera och lokalisera intracellulärt mest biologiskt viktiga element, inklusive fosfor, svavel, kalium, kalcium, järn, koppar, och zink. Faktum är att användningen av hård röntgen ger stora penetrationsdjup till bilden hela frysta-hydrerade celler i en etikett-fri mode. Dessutom ger tillgång till K-kanten av de flesta delar av intresse, är röntgen fluorescens upphetsad mest effektivt. Användningen av kryogena metoder kan minska strålningsskador och optimering av bevarandet av cellstruktur och elementär distribution.
De flesta tillgängliga rumsligt lösta analytiska tekniker för att studera metaller i celler är yttekniker som kräver mycket tunna och platta delar av celler som skall produceras. Detta omfattar främst scanning transmissionselektronmikroskopi med energi-dispersiv röntgen analys (STEM – EDX), energifiltrerad transmissionselektronmikroskopi (EF-TEM) och nanoskala sekundär Jon masspektrometri (Nanosimer). Den senare kan inte utföras på frysta, hydrerade cell sektioner medan Cryo-analys kan göras med elektronmikroskopi med oöverträffad rumslig upplösning men dålig elementär känslighet. Partikel-inducerad X-ray emission (PIXE) har tillåtit studiet av elementär distributioner i hela celler. Den har fördelen av att vara helt kvantitativ med en rättvis elementär känslighet på micron skalan och även på submicron resolution4, men lider av strålningsskador och brist på kryogena förmåga att studera frysta-hydrerade celler. Alla dessa analytiska tekniker kompletterar varandra i elementarbilden av celler, men för alla tekniker är prov berednings förfarandet ett avgörande steg. Det bör hållas enkelt att begränsa eventuella föroreningar samt elementär omfördelning och/eller läckage för att få meningsfulla resultat. Som demonstreras i elektronmikroskopi, en kryogen arbetsflöde, inklusive Cryo-immobilisering av cellen och kryotransfer till en kryoscanning skede, möjliggör en optimal elementär bevarande på subcellulära nivåer så nära som möjligt till Native State5,6,7,8,9,10. Denna förståelse har framgångsrikt implementerats i utvecklingen av synkrotron Cryo-Soft röntgen mikroskopi (t. ex. full fält Mikroskop och scanning Mikroskop) för att producera ultrastrukturella avbildning av hela frysta hydrerade celler i 2D eller 3D. Olika kryogena arbetsflöden utvecklades11 för Soft X-ray Mikroskop på fd 2,1 (XM-2) av den avancerade ljuskällan på Lawrence Berkeley National Laboratory12, fd U41-XM på elektron lagrings ringen BESSY II (Tyskland)13, fd Mistral i Alba ljuskälla (Spanien)14, och på fd B24 i Diamond Light källa15, bland annat. Ett liknande arbetsflöde har nyligen visat sig vara den mest pålitliga förberedelse-och konserverings metoden för intracellulär elementaranalys med röntgen mikrosonder16,17.
Även röntgen nanoprobe tekniker börjar allmänt användas för cellulära elementär analys, särskilt med tillkomsten av kryogena SR-XRF kapacitet, har ingen stegvis protokoll sprids hittills till forskarvärlden. Här ges ett detaljerat förfarande för beredning av kryofixerade sittande celler odlade som enskiktslager på silikonnitridmembran som skall analyseras under kryogena förhållanden. Ett frys torknings steg som skall appliceras efter protokollet om röntgen analysen skall utföras vid rumstemperatur finns också. Medan det föreslagna protokollet har framgångsrikt använts med mänskliga bröstcancerceller MD-MB-2312 och frystorkning visades bland annat på mus nervceller18,20,21, det kan lätt utvidgas till olika typer av mänskliga eller animaliska celler.
Cryo-Electron mikroskopi (Cryo-EM) vann 2017 Nobel priset i kemi och som sådan den utveckling som J. dubochet på vitrifiering av biologiskt material för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler i lösning25. Som rapporterats av Dubochet i hans Nobel föreläsning “att veta hur man vitrify en droppe vatten är en sak, förbereder ett biologiskt prov för biologisk observation är en annan”25. Cryopgottgörelse steg nu anses vara standardteknik för att lindra strålning dos skador och studera celler nära deras hemland. Förberedelserna är dock långtråkigt. Detta beror på att elektronmikroskopi, på grund av dess oöverträffade rumsliga upplösning, är känslig för alla ultrastrukturella artefakter som uppstår under provet preparatet. Den synkrotron cryonanosonder närmar sig nu liknande svårigheter att gå ner till rumsliga upplösningar så lågt som 13 nm i den höga energi X-ray Range26. Hard röntgen Mikroskop kan analysera hela celler medan elektronmikroskopi lider av den dåliga penetrationsdjupet av elektroner som gör att endast mycket tunna cell skivor observeras.
Monolayers av celler är tunna nog så att genom att störta-frysning i flytande etan, den erforderliga kylningen för vatten vitrifiering uppnås. I teorin, kylning priser så höga som 108 K/s är möjliga att använda högtrycks frysning27 som gör att förglasning av prover för tjocka för att störta frysning. En kylhastighet på 105 K/s, som krävs för att möjliggöra full förglasning av provet vid omgivningstryck28, uppnås med hjälp av den automatiska dykmaskinen och parametrarna som presenteras här. Detta gör det möjligt för en forskare att vitrify tunna biologiska prover (< 10 μm) såsom en enskiktslager av celler12,13,14,15,29,30 genom att störta-frysning i flytande etan.
En viktig utmaning med detta protokoll är också att så mycket som möjligt bevara den kemiska integriteten hos det intracellulära innehållet för att ge pålitliga elementära distributioner inom cellen i 2D eller 3D. Som offentliggjorts på annat håll2,16,17,31, när det gäller elementär avbildning på subcellulär nivå, bör analysen av frysta hydrerade celler övervägas. Annars, kombinationen av Plunge-frysning och frystorkning av celler kan användas för rumstemperatur analys. För den senare, den amorfa isen avlägsnas genom processen för sublimering, medan de bundna vattenmolekylerna avlägsnas genom processen för desorption. Denna process kan vara långt ifrån perfekt jämfört med frysta hydratiserade prover på grund av den eventuella förändringen av cellmembranen och morfologin av vissa subcellulära strukturer32. Också, för artbildning studier, vattenutvinning kan leda till metall artbildning artefakter. Ändå har det varit framgångsrikt och det bästa alternativet till frysta hydratiserade prover för elementär avbildning vid sub-100 nm nivåer2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Eftersom det har rapporterats37, kvaliteten på kryopreserverade cellulära preparat kan utvärderas genom kalium-till-natrium K/na förhållandet. Tyvärr kan det ännu inte bestämmas med den hårda röntgen-nanoprobe som används här, på grund av den låga energi cut-off av kisel drift detektor används för att upptäcka röntgen fluorescens fotoner av elementen (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktum är att ett högt K/na-förhållande (> 10) som kan mätas med hjälp av TOF-Sims, epma eller nukleär mikrosond Pixe16,37 är ett tecken på den bevarade kemiska integriteten hos cellen jämfört med den förväntade K/na på 25 i en levande cell37. Detta kan stödjas av en samtidig låg cl/K ratio38. Fortfarande, ofullkomliga förglasning, särskilt om hastigheten på provet kylning är för låg, kan leda till bildandet av stora iskristaller som kan skada cellmembran och organeller, följaktligen förändra distributionen av kemiska element. Även om det inte finns något rutinmässigt förfarande för att övervaka denna potentiella skador och inverkan på den intracellulära distributionen, ovanstående elementärt nyckeltal och möjligheten att bilden cellen med hög upplösning med röntgen faskontrast eller Cryo-mjuk röntgen mikroskopi kan vara de bästa metoderna för att stödja god bevarande av intracellulära fack med samtidig bevarande av elementär integritet. Kombinationen av dessa tekniker och användningen av nya kryokorrelativa fluorescens optiska mikroskop kommer att bidra till att bedöma i vilken utsträckning denna skada uppstår och påverkar den intracellulära elementära distributionen.
Övergripande, ett detaljerat och omfattande protokoll för att förbereda cellulära prover för synkrotron röntgen fluorescens nanoanalys presenteras. Det är en bra utgångspunkt för forskarsamhället, hjälper till att lösa den svåra frågan om hur man förbereder lämpliga cellulära prover för 2D och 3D Elemental Imaging på (Cryo) hård röntgen nanosonder. Dessa metoder kan slås samman med optisk fluorescens och elektronmikroskopi kapacitet för djupgående korrelativa kemisk och strukturell avbildning av celler.
The authors have nothing to disclose.
Experimenten på nano-Imaging fd ID16A utfördes inom ramen för ESRF-förslagen LS2430, LS2303 och LS2765.
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |