这里介绍的是一个协议,用于氮化硅膜上的细胞培养和在X射线荧光成像之前使用同步加速器低温X射线纳米探针进行跳投。当只提供室温纳米分析时,冷冻样品可以进一步冷冻干燥。这些是获得细胞内元素组成信息的关键步骤。
关于金属离子在亚细胞水平上的分布知之甚少。然而,这些化学元素具有基本的调节功能,其紊乱的平衡涉及各种疾病。最先进的同步加速器 X 射线荧光纳米探针提供所需的灵敏度和空间分辨率,以阐明整个细胞内的二维 (2D) 和三维 (3D) 分布和金属浓度。细胞器水平。这为金属在细胞物理病理学中的作用开辟了令人振奋的科学领域。细胞制备是一个关键且通常很复杂的过程,尤其是对于基本分析。虽然X射线荧光技术现在广泛存在,并且已经使用了各种制备方法,但很少有研究研究到细胞元素含量的保存,也没有关于冷冻制备的逐步详细方案。到目前为止,X射线荧光纳米探针的粘附细胞已经释放出来。这是一个协议的描述,该协议为快速冷冻提供分步细胞制备,以便在低温环境和转移可用时,实现对处于冷冻水合状态的细胞进行同步辐射 X 射线荧光纳米分析。如果必须在室温下进行纳米分析,则提供冷冻干燥冷冻粘附细胞制剂的额外程序。建议的方案已经成功地用于以前的工作,最近研究乳腺癌细胞中有机金属化合物的2D和3D细胞内分布。
新设计的同步加速器 X 射线荧光 (SR-XRF) 纳米探针允许以完全定量的方式可视化元素的亚细胞分布。例如,这种分析能力允许研究纳米粒子1或有机金属分子的利用,如基于氧化铝的复合物2,从而深入了解具有强效抗癌特性的金属基分子的细胞内接受。作为一种多元素技术,SR-XRF3采用纳米探针,可同时量化和本地化细胞内最重要的生物元素,包括磷、硫、钾、钙、铁、铜和锌。事实上,使用硬X射线提供了很大的穿透深度,以无标签的方式成像整个冷冻水合细胞。此外,X射线荧光提供对大多数感兴趣元素的K边缘的访问,是最有效的激发。使用低温方法可以减少辐射损伤,优化细胞结构和元素分布的保存。
研究细胞中金属的大部分空间解析分析技术是表面技术,需要产生非常薄和扁平的细胞部分。这主要包括扫描透射电子显微镜与能量分散X射线分析(STEM_EDX),能量过滤传输电子显微镜(EF-TEM)和纳米级二次电离质谱(纳米SIMS)。后者不能在冷冻、水合细胞部分执行,而冷冻分析可以通过具有无与伦比的空间分辨率但元素灵敏度差的电子显微镜进行。粒子引起的X射线发射(PIXE)允许研究整个细胞中的元素分布。它的优点是,在微米尺度上,甚至在亚微米分辨率4下,具有完全定量和公平元素灵敏度的优点,但受到辐射损伤和缺乏低温能力来研究冷冻水合细胞。所有这些分析技术在细胞元素成像中相互补充,但对于所有技术,样品制备过程是关键步骤。应保持简单,以限制可能的污染以及元素再分配和/或泄漏,以获得有意义的结果。正如在电子显微镜中所证明的,低温工作流程,包括细胞的低温固定和低温转移到低温扫描阶段,允许在亚细胞水平上尽可能接近原生状态5、6、7、8、9、10的最佳元素保存。这一理解已成功实现同步加速器低温-软X射线显微镜(例如,全场显微镜和扫描显微镜)的开发,以2D或3D生产整个冷冻水合细胞的超结构成像。在劳伦斯伯克利国家实验室12高级光源Beamline2.1(XM-2)开发了11种低温工作流程,在电子存储环BESSY II(德国)13开发了光束线U41-XM,ALBA光源的光束线MISTRAL14,以及钻石光源15的Beamline B24等。最近,一个类似的工作流程被证明是使用X射线微探针16、17进行细胞内元素分析的最可靠的制备和保存方法。
虽然X射线纳米探针技术开始广泛用于细胞元素分析,特别是随着低温SR-XRF功能的出现,迄今尚未向研究界传播任何逐步协议。在这里,提供了一个详细的程序,以制备低温粘附细胞培养为单层在氮化硅膜上进行分析的低温条件下。此外,在协议之后,如果必须在室温下进行 X 射线分析,则提供冷冻干燥步骤。虽然该方案已经成功地用于人类乳腺癌细胞MD-MB-2312和冷冻干燥在小鼠神经元18,20,21等,它可以很容易地扩展到不同类型的人类或动物细胞。
低温电子显微镜(Cryo-EM)荣获2017年诺贝尔化学奖,因此,J.Dubochet在生物材料的硝化方面进行了开发,用于在溶液25中解析生物分子的高分辨率结构测定。正如杜博切特在他的诺贝尔演讲中所报道的”知道如何对一滴水进行颤化是一回事,准备生物样本进行生物观测是另一回事”。冷冻制备步骤现在被认为是减轻辐射剂量损伤和研究接近其原生状态的细胞的标准技术。然而,准备工作仍然单调乏味。这是因为电子显微镜由于其无与伦比的空间分辨率,对样品制备过程中发生的任何超结构伪影都十分敏感。同步加速器低温探针正在接近类似的困难,在高能X射线范围26下,空间分辨率低至13纳米。硬X射线显微镜可以分析整个细胞,而电子显微镜则受电子穿透深度差的影响,只能观察到非常薄的细胞片。
单层细胞足够薄,因此通过在液体伊森太中冷冻,达到水硝化所需的冷却速率。理论上,使用高压冷冻27可实现高达 108 K/s 的冷却速率,这使得样品的压度太厚,无法进行压冻。使用自动跳投冷冻机和此处介绍的参数,使样品在环境压力28下完全实现压化所需的冷却速率为105 K/s。这允许研究人员通过液体伊森太中冷冻,使单个细胞的细胞12、13、14、15、29、30等薄生物标本(<10μm)得到冷冻。
该协议的一个重要挑战是,还要尽可能保持细胞内含量的化学完整性,以在细胞内以2D或3D提供可靠的元素分布。正如在其他地方发表的第2、16、17、31中所发表的,在亚细胞水平上进行元素成像时,应考虑对冷冻水合细胞的分析。否则,细胞的柱冻和冷冻干燥的组合可用于室温分析。对于后者,非晶冰通过升华过程被去除,而结合的水分子通过解吸过程被去除。与冷冻水合物样品相比,由于细胞膜的可能改变和某些亚细胞结构的形态32,这个过程可能远非理想。此外,对于物种研究,水提取可能导致金属物种化伪影。尽管如此,它还是成功和冷冻水合样品的最佳替代品,用于在低于100nm水平2,16,17,18,20,33,34,35,36元素成像。
据37日报道,冷冻细胞制剂的质量可以通过钾与钠K/Na比来评估。不幸的是,由于用于检测元素的X射线荧光光子(E = 1.3 keV镁)的硅漂移探测器的能量截止,目前还不能确定这里使用的硬X射线纳米探针。事实上,可以使用TOF-SIMS、EPMA或核微探针PIXE16、37测量的高K/Na比(>10),表明细胞的化学完整性与活细胞37中预期的K/Na25相比,是保存下来的。这可以通过伴随的低Cl/K比率38来支撑。然而,不完美的玻璃化,特别是如果样品冷却速度太低,会导致形成大冰晶,从而破坏细胞膜和细胞器,从而改变化学元素的分布。虽然没有常规程序来监测这种潜在的损害和对细胞内分布的影响,但上述元素比率以及使用X射线相对比或低温-软X射线显微镜以高分辨率成像细胞的可能性可能是支持细胞内腔内良好保存以及同时保持元素完整性的最佳方法。这些技术与新开发的低温相关荧光光学显微镜的结合将有助于评估这种损伤发生的程度,并影响细胞内元素分布。
总体而言,提出了一种详细而全面的方案,用于制备用于同步辐射X射线荧光纳米分析的细胞样品。这是研究界的良好起点,有助于解决如何为(低温)硬X射线纳米探针的2D和3D元素成像准备合适的细胞样本这一难题。这些方法可以与光学荧光和电子显微镜功能相结合,用于细胞的深入相关化学和结构成像。
The authors have nothing to disclose.
在ESRF方案LS2430、LS2303和LS2765的帧中进行了纳米成像光束ID16A的实验。
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |