Præsenteret her er en protokol for cellekultur på silicium nitrid membraner og springet-frysning forud for røntgenstråler fluorescens Imaging med en Synchrotron kryogen X-ray nanoprobe. Når kun rumtemperatur Nano-analyse er forudsat, de frosne prøver kan yderligere frysetørret. Disse er kritiske skridt til at indhente oplysninger om den intracellulære elementært sammensætning.
Meget lidt vides om fordelingen af metalioner på subcellulært niveau. Disse kemiske elementer har imidlertid væsentlige reguleringsfunktioner, og deres forstyrrede homøostase er involveret i forskellige sygdomme. State-of-the-art Synchrotron X-ray fluorescens nanopkåber giver den nødvendige følsomhed og rumlig opløsning til at belyse den todimensionelle (2D) og tredimensionale (3D) fordeling og koncentration af metaller inde i hele celler ved organelle niveau. Dette åbner nye spændende videnskabelige områder af undersøgelsen om rollen af metaller i fysiopatologi af cellen. Den cellulære forberedelse er en nøgle og ofte kompleks procedure, især for grundlæggende analyse. Selv om røntgen-fluorescens teknikker nu er udbredte, og der er anvendt forskellige tilberedningsmetoder, har meget få undersøgelser undersøgt bevarelsen af det elementære indhold af celler i bedste fald, og ingen trinvis detaljeret protokol til kryopreparation af overholder celler til røntgen fluorescens nanopkåber er blevet frigivet indtil videre. Dette er en beskrivelse af en protokol, der giver den trinvise cellulære forberedelse til hurtig kryofikse ring for at muliggøre Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse af celler i en frosset hydreret tilstand, når et kryogen miljø og overførsel er til rådighed. I tilfælde af Nano-analyse skal udføres ved stuetemperatur, en yderligere procedure for fryse-tørring af cryofixed klædning cellulære præparat er tilvejebragt. De foreslåede protokoller er blevet anvendt med succes i tidligere værker, senest i studiet af 2D og 3D intracellulær fordeling af en Organometallisk forbindelse i brystkræft celler.
Nydesignet Synchrotron røntgen fluorescens (SR-XRF) nanopkåber tillader visualisering af den subcellulære fordeling af elementer i en fuldt kvantitativ måde. Som et eksempel, denne analytiske kapacitet tillader undersøgelse af optagelsen af nanopartikler1 eller organometalliske molekyler såsom osmium-baserede komplekser2, giver indsigt i den intracellulære optagelse af metal-baserede molekyler med potente anticancer egenskaber. Som en multielement teknik, SR-XRF3 med en nanoprobe giver en måde at samtidig kvantificere og lokalisere intracellulært mest biologisk vigtige elementer, herunder fosfor, svovl, kalium, calcium, jern, kobber, og zink. Faktisk, brugen af hårde røntgenstråler giver stor penetration dybde til billede hele frosne-hydrerede celler i en etiket-fri mode. Desuden, giver adgang til K-kanten af de fleste elementer af interesse, røntgenstråler Fluorescens er spændt mest effektivt. Brugen af kryogene tilgange tillader reduktion af strålingsskader og optimering af bevarelsen af cellestrukturen og elementær distribution.
De fleste tilgængelige rumligt løste analytiske teknikker til at studere metaller i celler er overflade teknikker, der kræver meget tynde og flade sektioner af celler, der skal produceres. Dette omfatter primært scanning transmission elektronmikroskopi med energi-dispersive røntgen analyse (Stem-EDX), energi-filtreret transmission elektronmikroskopi (EF-tem), og nanoskala sekundær ion massespektrometri (nanosims). Sidstnævnte kan ikke udføres på frosne, hydrerede celle sektioner, mens Cryo-analyse kan gøres med elektronmikroskopi med uovertruffen rumlig opløsning, men dårlig elementær følsomhed. Partikel induceret røntgen emission (PIXE) har gjort det muligt at studere elementær distributioner i hele celler. Det har fordelen af at være fuldt kvantitativ med en rimelig elementær følsomhed på micron skalaen og selv ved submikron resolution4, men lider af strålingsskader og mangel på kryogene kapaciteter til at studere frosne-hydrerede celler. Alle disse analytiske teknikker supplerer hinanden i elementær billeddannelse af celler, men for alle teknikker er prøveforberedelsesproceduren et afgørende skridt. Det bør holdes enkelt at begrænse eventuel kontaminering samt elementær omfordeling og/eller lækage for at opnå meningsfulde resultater. Som påvist i elektronmikroskopi, en kryogen arbejdsgang, herunder Cryo-immobilisering af cellen og kryooverførsel til en kryoscanning fase, tillader en optimal elementær bevaring på subcellulære niveauer så tæt som muligt på den indfødte tilstand5,6,7,8,9,10. Denne forståelse er blevet implementeret med succes i udviklingen af Synchrotron Cryo-Soft røntgen mikroskopi (f. eks. fuld felt mikroskoper og scannings mikroskoper) for at producere ultrastrukturel billeddannelse af hele frosne-hydrerede celler i 2D eller 3D. Der blev udviklet forskellige kryogene arbejdsprocesser11 for bløde røntgen mikroskoper på strålinger 2,1 (Xm-2) af den avancerede lyskilde på Lawrence Berkeley National Laboratory12, strålinger U41-XM på elektron lagrings ringen Bessy II (Tyskland)13, strålinger MISTRAL af Alba Light source (Spanien)14, og på strålinger B24 af diamant lyskilden15, blandt andre. En lignende Workflow blev for nylig vist sig at være den mest pålidelige forberedelse og bevaring metode til intracellulære elementært analyse ved hjælp af X-ray microprobes16,17.
Selv om X-ray nanoprobe teknikker er begyndt at blive udbredt til cellulær elementær analyse, især med fremkomsten af Cryogen SR-XRF kapaciteter, ingen trinvis protokol er blevet formidlet indtil videre til forskersamfundet. Her er der en detaljeret procedure for at forberede kryofaste klæbriste celler, der dyrkes som monolag på silicium nitrid membraner til at blive analyseret under kryogene forhold. Et frysetørret trin, der skal anvendes efter protokollen i tilfælde af røntgen analyse skal udføres ved stuetemperatur er også forudsat. Mens den foreslåede protokol er blevet anvendt med succes med humane brystkræft celler MD-MB-2312 og frysetørring blev demonstreret blandt andre på mus neuroner18,20,21, det kan nemt udvides til forskellige typer af humane eller animalske celler.
Cryo-Electron mikroskopi (Cryo-EM) vandt 2017 Nobelprisen i kemi og som sådan udvikling foretaget af J. dubochet om forvitning af biologisk materiale til højopløsnings struktur bestemmelse af biomolekyler i opløsning25. Som rapporteret af Dubochet i hans nobel forelæsning “at vide, hvordan man vitrify en dråbe vand er én ting, forbereder en biologisk prøve for biologisk observation er en anden”25. Cryopreparation trin er nu betragtes som standard teknik til at afbøde strålingsdosis skader og studere celler tæt på deres oprindelige tilstand. Forberedelsen er dog stadig kedelig. Dette skyldes elektronmikroskopi, på grund af sin uovertruffen rumlig opløsning, er følsom over for enhver ultrastrukturel artefakt, der opstår under prøven forberedelse. Synchrotron cryonanopkåber nærmer sig nu lignende vanskeligheder, der går ned til rumlige opløsninger så lavt som 13 nm i den høje energi X-ray Range26. Hård røntgen mikroskopi kan analysere hele celler, mens elektronmikroskopi lider under den dårlige indtrængningsdybde af elektroner, der kun gør det muligt at iagttage meget tynde celle skiver.
Monolayers af celler er tynde nok, så ved dybfrysning i flydende Ethan opnås de nødvendige afkølingshastigheder for vand vitrifikation. I teorien, køling satser så højt som 108 K/s er muligt ved hjælp af højtryks frysning27 som tillader forglasning af prøver for tyk til springet frysning. En afkølingshastighed på 105 K/s, der kræves for at muliggøre fuld vitrifikation af prøven ved omgivende Tryk28, opnås reproducerbart ved hjælp af den automatiske dybfrysnings maskine og de parametre, som præsenteres her. Dette giver en forsker til at vitrify tynde biologiske prøver (< 10 μm) såsom en enkeltlags af celler12,13,14,15,29,30 ved springet-frysning i flydende Ethan.
En vigtig udfordring med denne protokol er også at bevare så meget som muligt den kemiske integritet af det intracellulære indhold for at give pålidelige elementært distributioner i cellen i 2D eller 3D. Som offentliggjort andetsteds2,16,17,31, i tilfælde af elementær billeddannelse på subcellulært niveau, bør analysen af frosne hydrerede celler overvejes. Ellers kan kombinationen af dykfrysning og frysetørring af celler anvendes til rumtemperatur analyse. For sidstnævnte, den amorfe is fjernes gennem processen med Sublimation, mens de bundne vandmolekyler fjernes gennem processen med desorption. Denne proces kan være langt fra ideel i forhold til frosne hydrerede prøver på grund af den mulige ændring af de cellulære membraner og morfologien af nogle subcellulære strukturer32. Også, for artsbestemmelse undersøgelser, vand udvinding kan føre til metal artsbestemmelse artefakter. Stadig, det har været en succes og det bedste alternativ til frosne hydrerede prøver for elementær billeddannelse på sub-100 nm niveauer2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Som det er blevet rapporteret37, kvaliteten af kryopræserverede cellulære præparater kan evalueres gennem kalium-til-natrium K/na ratio. Desværre kan det endnu ikke bestemmes med den hårde røntgen-nanoprobe, der anvendes her, på grund af den lave energi cut-off af Silicon drift detektor anvendes til at detektere røntgenstråler fluorescens fotoner af elementerne (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktisk en høj K/na ratio (> 10), der kan måles ved hjælp af TOF-Sims, EPMA, eller nuklear mikroprobe pixe16,37 er en indikation af den bevarede kemiske integritet af cellen i forhold til den forventede K/na af 25 i en levende celle37. Dette kan understøttes af et samtidigt lavt CL/K-forhold38. Stadig, ufuldkommen forvitrifikation, især hvis hastigheden af prøven afkøling er for lav, kan føre til dannelsen af store iskrystaller, der kan beskadige cellemembraner og organeller, dermed ændre fordelingen af kemiske elementer. Selv om der ikke er nogen rutine procedure for at overvåge denne potentielle skade og indvirkning på den intracellulære fordeling, de ovennævnte elementært nøgletal og muligheden for at billedet cellen ved høj opløsning ved hjælp af røntgen fasekontrast eller Cryo-Soft røntgen mikroskopi kan være de bedste tilgange til at støtte god bevaring af intracellulære rum med samtidig bevarelse af elementært integritet. Kombinationen af disse teknikker og brugen af nyudviklede kryocorrelative fluorescens optiske mikroskoper vil hjælpe med at vurdere, i hvilket omfang denne skade opstår og påvirker den intracellulære elementale fordeling.
Samlet set præsenteres en detaljeret og omfattende protokol til forberedelse af cellulære prøver for Synchrotron røntgen fluorescens Nano-analyse. Det er et godt udgangspunkt for forskersamfundet, der hjælper med at løse det vanskelige spørgsmål om, hvordan man forbereder passende cellulære prøver til 2D og 3D elementært Imaging på (Cryo) hårde X-ray nanopkåber. Disse tilgange kan fusioneres med optisk fluorescens og elektronmikroskopi kapaciteter til dybtgående korrelativ kemisk og strukturel billeddannelse af celler.
The authors have nothing to disclose.
Forsøgene på nano-Imaging strålinger ID16A blev udført inden for rammerne af ESRF-forslag LS2430, LS2303 og LS2765.
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |