यहां प्रस्तुत सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली पर सेल संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल है और एक्स-रे फ्लोरेसेंस इमेजिंग से पहले एक सिंक्रोट्रॉन क्रायोजेनिक एक्स-रे नैनोप्रोब के साथ डुबकी-फ्रीजिंग है। जब केवल कमरे का तापमान नैनो विश्लेषण प्रदान किया जाता है, जमे हुए नमूनों को और अधिक फ्रीज-सूखे किया जा सकता है । ये इंट्रासेलर मौलिक संरचना के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं।
उपकोशिकीय स्तर पर धातु आयनों के वितरण के बारे में बहुत कम जाना जाता है। हालांकि, उन रासायनिक तत्वों में आवश्यक नियामक कार्य होते हैं और उनके अशांत होडोस्टोसिस विभिन्न रोगों में शामिल होते हैं। अत्याधुनिक सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनोप्रोब्स दो आयामी (2डी) और त्रि-आयामी (3 डी) वितरण और पूरे कोशिकाओं के अंदर धातुओं की एकाग्रता को स्पष्ट करने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और स्थानिक संकल्प प्रदान करते हैं ऑर्गेनेल लेवल। यह कोशिका के फिजियोपैथोलॉजी में धातुओं की भूमिका पर जांच के नए रोमांचक वैज्ञानिक क्षेत्रों को खोलता है। सेलुलर तैयारी विशेष रूप से बुनियादी विश्लेषण के लिए एक महत्वपूर्ण और अक्सर जटिल प्रक्रिया है। यद्यपि एक्स-रे फ्लोरेसेंस तकनीक अब व्यापक हैं और विभिन्न तैयारी विधियों का उपयोग किया गया है, बहुत कम अध्ययनों ने कोशिकाओं की मौलिक सामग्री के संरक्षण की जांच की है, और क्रायोतैयारी के लिए कोई चरणवार विस्तृत प्रोटोकॉल नहीं है एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनोप्रोब्स के लिए अनुयायी कोशिकाएं अब तक जारी की गई हैं । यह एक प्रोटोकॉल का वर्णन है जो तेजी से क्रायोफिक्शन के लिए स्टेपवाइज सेलुलर तैयारी प्रदान करता है ताकि क्रायोजेनिक वातावरण और हस्तांतरण उपलब्ध होने पर जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में कोशिकाओं के सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण को सक्षम किया जा सके। यदि नैनो विश्लेषण कमरे के तापमान पर किया जाना है, तो क्रायोफिक्स्ड अनुयायी सेलुलर तैयारी को फ्रीज-सुखाने के लिए एक अतिरिक्त प्रक्रिया प्रदान की जाती है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक पिछले कार्यों में इस्तेमाल किया गया है, सबसे हाल ही में स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एक ऑर्गेनोमेटलिक यौगिक के 2 डी और 3 डी इंट्रासेलुलर वितरण का अध्ययन करने में ।
नए डिजाइन किए गए सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस (एसआर-एक्सआरएफ) नैनोप्रोब्स पूरी तरह से मात्रात्मक तरीके से तत्वों के उपकोशिकीय वितरण के दृश्य की अनुमति देते हैं। एक उदाहरण के रूप में, यह विश्लेषणात्मक क्षमता नैनोकणों1 या ऑर्गेनोमेटलिक अणुओं जैसे ओस्मियम आधारित परिसरों2के तेज की जांच की अनुमति देती है, जो शक्तिशाली कैंसर रोधी गुणों के साथ धातु आधारित अणुओं के इंट्रासेलुलर तेज में अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। एक बहुतत्व तकनीक के रूप में, नैनोप्रोब के साथ एसआर-एक्सआरएफ3 फास्फोरस, सल्फर, पोटेशियम, कैल्शियम, लोहा, तांबा और जस्ता सहित इंट्रासेलुलर सबसे जैविक रूप से महत्वपूर्ण तत्वों की मात्रा और स्थानीयकरण करने का एक तरीका प्रदान करता है। दरअसल, हार्ड एक्स-रे का उपयोग लेबल-मुक्त फैशन में पूरे जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं को छवि के लिए बड़ी प्रवेश गहराई प्रदान करता है। इसके अलावा, ब्याज के अधिकांश तत्वों के कश्मीर-किनारे तक पहुंच प्रदान करना, एक्स-रे फ्लोरेसेंस सबसे कुशलता से उत्साहित है। क्रायोजेनिक दृष्टिकोणों का उपयोग विकिरण क्षति को कम करने और कोशिका संरचना और मौलिक वितरण के संरक्षण के अनुकूलन की अनुमति देता है।
कोशिकाओं में धातुओं का अध्ययन करने के लिए अधिकांश उपलब्ध स्थानिक रूप से हल विश्लेषणात्मक तकनीकें सतह तकनीक हैं जिन्हें उत्पादित करने के लिए कोशिकाओं के बहुत पतले और सपाट वर्गों की आवश्यकता होती है। इसमें मुख्य रूप से ऊर्जा-फैलाव एक्स-रे विश्लेषण (स्टेम-ईडीएक्स), ऊर्जा-फ़िल्टर किए गए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएफ-टेम), और नैनोस्केल सेकेंडरी आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नैनोसिम) के साथ स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी शामिल है। बाद जमे हुए, हाइड्रेटेड सेल वर्गों पर प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है, जबकि क्रायो विश्लेषण नायाब स्थानिक संकल्प लेकिन गरीब मौलिक संवेदनशीलता के साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ किया जा सकता है । कण-प्रेरित एक्स-रे उत्सर्जन (PIXE) ने पूरी कोशिकाओं में मौलिक वितरण के अध्ययन की अनुमति दी है। यह माइक्रोन पैमाने पर एक निष्पक्ष मौलिक संवेदनशीलता के साथ पूरी तरह से मात्रात्मक होने का लाभ है और यहां तक कि उपसूक्ष्म संकल्प4पर, लेकिन विकिरण क्षति और क्रायोजेनिक क्षमताओं की कमी से ग्रस्त है जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए । ये सभी विश्लेषणात्मक तकनीक कोशिकाओं की मौलिक इमेजिंग में एक-दूसरे के पूरक हैं, लेकिन सभी तकनीकों के लिए नमूना तैयारी प्रक्रिया एक महत्वपूर्ण कदम है। सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए संभावित संदूषण के साथ-साथ मौलिक पुनर्वितरण और/या रिसाव को सीमित करने के लिए इसे सरल रखा जाना चाहिए । जैसा कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में प्रदर्शित किया गया है, एक क्रायोजेनिक कार्यप्रवाह, जिसमें कोशिका का क्रायो-इम्मोबिलाइजेशन और क्रायोस्कैनिंग चरण में क्रायोट्रांसफर शामिल है, मूल राज्य5,6,7,8,9,10के करीब उपकोशिकीय स्तरों पर इष्टतम मौलिक संरक्षण की अनुमति देता है। इस समझ को 2डी या 3 डी में पूरे जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं की अल्ट्रास्ट्रक्चरल इमेजिंग का उत्पादन करने के लिए सिंक्रोट्रॉन क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोपी (जैसे, पूर्ण क्षेत्र माइक्रोस्कोप और स्कैनिंग माइक्रोस्कोप) के विकास में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। लॉरेंस बर्कले नेशनल लेबोरेटरी12में एडवांस्ड लाइट सोर्स के बीमलाइन 2.1 (एक्सएम-2) में सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोप के लिए विभिन्न क्रायोजेनिक वर्कफ्लो11 विकसित किए गए थे, जो इलेक्ट्रॉन स्टोरेज रिंग बेसी द्वितीय (जर्मनी)13,अल्बा लाइट सोर्स (स्पेन)14के बीमलाइन मिस्ट्राल और डायमंड लाइट सोर्स15अन्य के बीमलाइन B24 में एक्स-रे माइक्रोप्रोब्स16,17का उपयोग करके इंट्रासेलर मौलिक विश्लेषण के लिए हाल ही में इसी तरह के कार्यप्रवाह को सबसे विश्वसनीय तैयारी और संरक्षण विधि दिखाई गई थी।
हालांकि एक्स-रे नैनोप्रोब तकनीकों को व्यापक रूप से सेलुलर मौलिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना शुरू कर रहे हैं, विशेष रूप से क्रायोजेनिक एसआर-XRF क्षमताओं के आगमन के साथ, अनुसंधान समुदाय के लिए अब तक कोई स्टेपवाइज प्रोटोकॉल का प्रसार नहीं किया गया है । यहां, क्रायोजेनिक परिस्थितियों में विश्लेषण किए जाने वाले सिलिकॉन नाइट्राइड झिल्ली पर मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत क्रायोफिक्स्ड अनुयायी कोशिकाओं को तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान की जाती है। यदि एक्स-रे विश्लेषण कमरे के तापमान पर किया जाना चाहिए तो प्रोटोकॉल के बाद लागू किया जाने वाला एक फ्रीज-सुखाने वाला कदम भी प्रदान किया जाता है। जबकि प्रस्तावित प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं एमडी-एमबी-2312 के साथ उपयोग किया गया है और फ्रीज-सुखाने का प्रदर्शन माउस न्यूरॉन्स18,20,21पर अन्य लोगों के बीच किया गया था, इसे विभिन्न प्रकार की मानव या पशु कोशिकाओं तक आसानी से बढ़ाया जा सकता है।
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) ने रसायन विज्ञान में २०१७ नोबेल पुरस्कार जीता और इस तरह के समाधान25में जैव अणुओं के उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के लिए जैविक सामग्री के विट्रीफिकेशन पर जे डबोशे द्वारा किए गए विकास के रूप में । के रूप में अपने नोबेल व्याख्यान में Dubochet द्वारा रिपोर्ट “कैसे पानी की एक बूंद को विवर्तित करने के लिए एक बात है, जैविक अवलोकन के लिए एक जैविक नमूना तैयार एक और है”25। क्रायोतैयारी कदम अब विकिरण खुराक क्षति और उनके मूल राज्य के करीब कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए मानक तकनीक माना जाता है । तैयारी थकाऊ बनी हुई है, लेकिन । इसका कारण यह है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, इसके नायाब स्थानिक संकल्प के कारण, नमूना तैयारी के दौरान होने वाले किसी भी अल्ट्रास्ट्रक्चरल विरूपण साक्ष्य के प्रति संवेदनशील है। सिंक्रोट्रॉन क्रायोनिनोप्रोब्स अब उच्च ऊर्जा एक्स-रे रेंज26में 13 एनएम के रूप में कम स्थानिक संकल्पों के लिए नीचे जा रही इसी तरह की कठिनाइयों के करीब पहुंच रहे हैं । हार्ड एक्स-रे माइक्रोस्कोपी पूरी कोशिकाओं का विश्लेषण कर सकती है जबकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रॉनों की खराब पैठ गहराई से ग्रस्त है जो केवल बहुत पतली कोशिका स्लाइस को देखा जा सकता है।
कोशिकाओं के मोनोलेयर काफी पतले होते हैं ताकि तरल इथेन में डुबकी-फ्रीजिंग से, पानी विट्रीफिकेशन के लिए आवश्यक शीतलन दरें प्राप्त हो जाती हैं। सिद्धांत रूप में, १०८ K/s के रूप में उच्च के रूप में ठंडा दर उच्च दबाव ठंड27 जो डुबकी ठंड के लिए भी मोटी नमूनों के vitrification की अनुमति देता है का उपयोग संभव हैं । परिवेश दबाव28पर नमूने के पूर्ण विट्रीफिकेशन की अनुमति देने के लिए आवश्यक 105 K/s की एक शीतलन दर, स्वचालित डुबकी-फ्रीजिंग मशीन और यहां प्रस्तुत मापदंडों का उपयोग करके पुन: उत्पादन तक पहुंच जाती है। यह एक शोधकर्ता को तरल इथेन में डुबकी-फ्रीजिंग द्वारा12,13,14,15,29,30 कोशिकाओं के मोनोलेयर जैसे पतले जैविक नमूनों (<10 μm) को विवर्तित करने की अनुमति देता है।
इस प्रोटोकॉल के साथ एक महत्वपूर्ण चुनौती 2डी या 3 डी में सेल के भीतर विश्वसनीय मौलिक वितरण प्रदान करने के लिए इंट्रासेलुलर सामग्री की रासायनिक अखंडता को यथासंभव संरक्षित करना है। जैसा कि उपकोशिकीय स्तर पर मौलिक इमेजिंग के मामले में2,16,17,31कहीं और प्रकाशित किया गया है, जमे हुए हाइड्रेटेड कोशिकाओं के विश्लेषण पर विचार किया जाना चाहिए। अन्यथा, कोशिकाओं के डुबकी-फ्रीजिंग और फ्रीज-सुखाने के संयोजन का उपयोग कमरे के तापमान विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध के लिए, अरूप बर्फ को उदात्तीकरण की प्रक्रिया के माध्यम से हटा दिया जाता है, जबकि बंधे पानी के अणुओं को अवशोषण की प्रक्रिया के माध्यम से हटा दिया जाता है। सेलुलर झिल्ली के संभावित परिवर्तन और कुछ उपकोशिकीय संरचनाओं की आकृति विज्ञान32के कारण यह प्रक्रिया जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों की तुलना में आदर्श से दूर हो सकती है। इसके अलावा, विशिष्टता अध्ययन के लिए, पानी निकालने धातु नमूना कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । फिर भी, यह सफल रहा है और उप-100 एनएम स्तर2,16,17,18,20,33,34,35,36पर मौलिक इमेजिंग के लिए जमे हुए हाइड्रेटेड नमूनों का सबसे अच्छा विकल्प है।
जैसा कि37की रिपोर्ट की गई है, क्रायोप्रिजर्वसेलुलर तैयारी की गुणवत्ता का मूल्यांकन पोटेशियम-टू-सोडियम के/एनए अनुपात के माध्यम से किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, यह अभी तक कठिन एक्स-रे नैनोप्रोब के साथ निर्धारित नहीं किया जा सकता है, सिलिकॉन बहाव डिटेक्टर के कम ऊर्जा कट-ऑफ के कारण तत्वों के एक्स-रे फ्लोरेसेंस फोटॉन (ई ♫ 1.3 केवी मैग्नीशियम) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। दरअसल, एक उच्च K/Na अनुपात (>10) जिसे टीओएफ-सिम्स, ईपीएमए या न्यूक्लियर माइक्रोप्रोब PIXE16,37 का उपयोग करके मापा जा सकता है, एक जीवित सेल37में 25 की अपेक्षित K/Na की तुलना में सेल की संरक्षित रासायनिक अखंडता का संकेत है। इसे सहवर्ती कम सीएल /के अनुपात38द्वारा समर्थित किया जा सकता है । फिर भी, अपूर्ण विट्रीफिकेशन, खासकर यदि नमूना ठंडा करने की गति बहुत कम है, तो बड़े बर्फ क्रिस्टल के गठन का कारण बन सकता है जो कोशिका झिल्ली और ऑर्गेनेल्स को नुकसान पहुंचा सकता है, नतीजतन रासायनिक तत्वों के वितरण में फेरबदल कर सकता है। यद्यपि इंट्रासेलर वितरण पर इस संभावित क्षति और प्रभाव की निगरानी करने के लिए कोई नियमित प्रक्रिया नहीं है, उपरोक्त मौलिक अनुपात और एक्स-रे चरण कंट्रास्ट या क्रायो-सॉफ्ट एक्स-रे माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च संकल्प पर सेल को छवि देने की संभावना मौलिक अखंडता के सहवर्ती संरक्षण के साथ इंट्रासेल्युलर डिब्बों के अच्छे संरक्षण का समर्थन करने के लिए सबसे अच्छा दृष्टिकोण हो सकता है। इन तकनीकों के संयोजन और नव विकसित क्रायोकोरसापेक्ष फ्लोरेसेंस ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग यह आकलन करने में मदद करेगा कि यह नुकसान किस हद तक होता है और इंट्रासेलुलर मौलिक वितरण को प्रभावित करता है।
कुल मिलाकर, सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे फ्लोरेसेंस नैनो-विश्लेषण के लिए सेलुलर नमूने तैयार करने के लिए एक विस्तृत और व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह अनुसंधान समुदाय के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, जो 2डी और 3डी मौलिक इमेजिंग (क्रायो) हार्ड एक्स-रे नैनोप्रोब्स के लिए उपयुक्त सेलुलर नमूने तैयार करने के कठिन मुद्दे को हल करने में मदद करता है। इन दृष्टिकोणों को कोशिकाओं के गहन सहसापेक्ष रासायनिक और संरचनात्मक इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्षमताओं के साथ मिलाया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
नैनो-इमेजिंग बीमलाइन ID16A पर प्रयोगESRF प्रस्तावLS2430, LS2303, और LS2765 के फ्रेम में किए गए थे ।
Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05×0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane…) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco… |
Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |