Summary
Här presenteras ett protokoll för cellodling på kiselnitridmembran och djupfrysning före röntgenfluorescensavbildning med en synkrotron kryogen röntgennanosond. När endast nano-analys av rumstemperatur tillhandahålls kan de frysta proverna frystorkas ytterligare. Dessa är kritiska steg för att få information om den intracellulära elementära sammansättningen.
Abstract
Mycket lite är känt om distributionen av metalljoner på subcellulär nivå. Emellertid, dessa kemiska element har viktiga reglerande funktioner och deras störd homeostas är inblandade i olika sjukdomar. State-of-the-art synkrotron röntgen fluorescens nanosonder ger erforderlig känslighet och rumslig upplösning för att belysa den tvådimensionella (2D) och tredimensionell (3D) distribution och koncentration av metaller i hela celler på organellnivå. Detta öppnar nya spännande vetenskapliga områden av utredning på rollen av belägger med metall i physiopatologin av cellen. Den cellulära beredningen är en viktig och ofta komplicerad procedur, särskilt för grundläggande analys. Även om röntgenfluorescensmetoder nu är utbredda och olika beredningsmetoder har använts, har mycket få studier undersökt bevarandet av elementarhalten i celler i bästa fall, och inga stegvisa detaljerade protokoll för frys reparation av anhängare celler för röntgen fluorescens nanoprober har släppts hittills. Detta är en beskrivning av ett protokoll som ger den stegvisa cellulära beredningen för snabb kryofixering för att möjliggöra synkrotron röntgen fluorescens nano-analys av celler i ett fryst hydrerat tillstånd när en kryogen miljö och överföring är tillgänglig. Om nano-analys måste utföras i rumstemperatur, finns ytterligare ett förfarande för frystorkning av den kryofasta anhängare cellulär preparationen. De föreslagna protokollen har framgångsrikt använts i tidigare verk, senast i att studera 2D-och 3D-intracellulär distribution av en organometallisk förening i bröstcancerceller.
Introduction
Nydesignade nanosonderna synkrotron X-ray fluorescens (SR-XRF) möjliggör visualisering av subcellulär distribution av element på ett fullständigt kvantitativt sätt. Som ett exempel, denna analytiska förmåga möjliggör utredning av upptaget av nanopartiklar1 eller Metallorganisk molekyler såsom osmium-baserade komplex2, ger insikt i den intracellulära upptaget av metallbaserade molekyler med potenta cancer egenskaper. Som en multielement teknik, SR-XRF3 med en nanoprobe ger ett sätt att samtidigt kvantifiera och lokalisera intracellulärt mest biologiskt viktiga element, inklusive fosfor, svavel, kalium, kalcium, järn, koppar, och zink. Faktum är att användningen av hård röntgen ger stora penetrationsdjup till bilden hela frysta-hydrerade celler i en etikett-fri mode. Dessutom ger tillgång till K-kanten av de flesta delar av intresse, är röntgen fluorescens upphetsad mest effektivt. Användningen av kryogena metoder kan minska strålningsskador och optimering av bevarandet av cellstruktur och elementär distribution.
De flesta tillgängliga rumsligt lösta analytiska tekniker för att studera metaller i celler är yttekniker som kräver mycket tunna och platta delar av celler som skall produceras. Detta omfattar främst scanning transmissionselektronmikroskopi med energi-dispersiv röntgen analys (STEM – EDX), energifiltrerad transmissionselektronmikroskopi (EF-TEM) och nanoskala sekundär Jon masspektrometri (Nanosimer). Den senare kan inte utföras på frysta, hydrerade cell sektioner medan Cryo-analys kan göras med elektronmikroskopi med oöverträffad rumslig upplösning men dålig elementär känslighet. Partikel-inducerad X-ray emission (PIXE) har tillåtit studiet av elementär distributioner i hela celler. Den har fördelen av att vara helt kvantitativ med en rättvis elementär känslighet på micron skalan och även på submicron resolution4, men lider av strålningsskador och brist på kryogena förmåga att studera frysta-hydrerade celler. Alla dessa analytiska tekniker kompletterar varandra i elementarbilden av celler, men för alla tekniker är prov berednings förfarandet ett avgörande steg. Det bör hållas enkelt att begränsa eventuella föroreningar samt elementär omfördelning och/eller läckage för att få meningsfulla resultat. Som demonstreras i elektronmikroskopi, en kryogen arbetsflöde, inklusive Cryo-immobilisering av cellen och kryotransfer till en kryoscanning skede, möjliggör en optimal elementär bevarande på subcellulära nivåer så nära som möjligt till Native State5,6,7,8,9,10. Denna förståelse har framgångsrikt implementerats i utvecklingen av synkrotron Cryo-Soft röntgen mikroskopi (t. ex. full fält Mikroskop och scanning Mikroskop) för att producera ultrastrukturella avbildning av hela frysta hydrerade celler i 2D eller 3D. Olika kryogena arbetsflöden utvecklades11 för Soft X-ray Mikroskop på fd 2,1 (XM-2) av den avancerade ljuskällan på Lawrence Berkeley National Laboratory12, fd U41-XM på elektron lagrings ringen BESSY II (Tyskland)13, fd Mistral i Alba ljuskälla (Spanien)14, och på fd B24 i Diamond Light källa15, bland annat. Ett liknande arbetsflöde har nyligen visat sig vara den mest pålitliga förberedelse-och konserverings metoden för intracellulär elementaranalys med röntgen mikrosonder16,17.
Även röntgen nanoprobe tekniker börjar allmänt användas för cellulära elementär analys, särskilt med tillkomsten av kryogena SR-XRF kapacitet, har ingen stegvis protokoll sprids hittills till forskarvärlden. Här ges ett detaljerat förfarande för beredning av kryofixerade sittande celler odlade som enskiktslager på silikonnitridmembran som skall analyseras under kryogena förhållanden. Ett frys torknings steg som skall appliceras efter protokollet om röntgen analysen skall utföras vid rumstemperatur finns också. Medan det föreslagna protokollet har framgångsrikt använts med mänskliga bröstcancerceller MD-MB-2312 och frystorkning visades bland annat på mus nervceller18,20,21, det kan lätt utvidgas till olika typer av mänskliga eller animaliska celler.
Protocol
Experimentella procedurer godkändes av djur hälso kommittén vid CEA: s Life Sciences Division (CETEA, A14-006). De genomfördes i enlighet med den franska lagstiftningen och Europeiska gemenskapens rådsdirektiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG).
1. silikon nitrid (SI3N4) förberedelse av membran stöd
Anmärkning: eftersom membranet är bräcklig och delikat, dess stöd (200 μm tjock kisel ram) måste hanteras försiktigt, helst med en tunn kol pincett eller Dumont pincett #5, raka självstängande fina tips. Detta protokoll används kiselnitrid membran med en ram av 5 mm x 5 mm och en Membranstorlek på 1,5 mm x 1,5 mm. Membranet bör förberedas ungefär 12 h innan försöket påbörjas (dvs. cell sådd). Membran kan förberedas i slutet av dagen och vänster torkning över natten under en klass II laminärt flöde huva så att de är redo att använda nästa morgon. En kisel Rams tjocklek på 200 μm är standard för de flesta företag som säljer kisel nitrid fönster. Om den produkt som används i detta protokoll inte är tillgänglig kan en Membranstorlek i intervallet 0,5 − 1,5 mm användas med en standardram storlek på 5 mm x 5 mm. Den större membran storleken är att föredra när röntgen tomografi kommer att användas. TEM Grid typ kisel nitrid fönster med en Membranstorlek på 0,5 mm och en tjocklek på 50 nm kan också användas.
- Öppna kapseln som innehåller stöd för si3N4 -membranet (figur 1). Pressa försiktigt kapseln för att lätt lossa på stödet.
- Håll ett av hörnen på kisel ramen med den tunna pincetten. Var försiktig så att du inte vidrör si3N4 -membranet i mitten. Den 200 eller 500 Nm tjockt membran kan lätt skadas.
- Använd den tunna pincetten och placera försiktigt si3N4 -membranstödet i ett sterilt glas petriskål, Plant yta av silikonnitridfönstret vänd uppåt (dvs. håligheten vänd mot botten av skålen).
- Ta bort locket på petriskål och lämna membranen under UV-ljus i 25 − 30 min under laminärt flöde skåpet.
Obs: UVC-lampan (254 nm) är normalt inställd på 200 μW/cm2. - Sätt 10 μL Poly-L-lysin på membranet. Droppen ska täcka si3N4 -membranet väl och kan spridas lite över kisel ramen. Lämna den vid 37 ° c i 25 minuter i standard vävnadsodling inkubator på 100% relativ luftfuktighet och 95% luft, 5% CO2.
Anmärkning: i detta fall en poly-L-lysin beläggning användes för MDA-MB-231 bröstcancerceller. Beroende på vilken typ av cell linjen, olika beläggningar kan användas, och detta steg bör optimeras i enlighet med detta. - Fyll olika brunnar med 200 − 250 μL ultrarent och Ultra-trace vatten filtrerat genom ett sterilt 0,22 μm filter i en steril 48-platta. Vanligtvis kan varje brunn användas för att skölja upp till 2 − 3 membran. Med fin pincett, plocka upp membranet stöd i ett hörn av sin kisel ram. Skölj membranet försiktigt genom att sänka det vertikalt 10 s i tre på varandra följande brunnar.
Anmärkning: membran stöd tas ut ur inkubatorn och kan bearbetas i rumstemperatur, med den temperatur och den fuktighet som definieras av en klass II laminärt flöde huva. - Sätt membranet stöd vertikalt i en tom brunn av en steril 96 väl plattan, täck den, och låt den torka över natten under en klass II laminär Flow Hood.
2. cell sådd
- I en steril 4 väl tallrik, placera membranen med sin plana sida vänd uppåt.
- MDA-MB-231 celler upprätthålls i en enskiktslager kultur i DMEM med fenol röd/glutamax i, kompletteras med 10% fetalt kalv serum och 1% penicillin och streptomycin vid 37 ° c i en 5% Co2 luft fuktad inkubator.
- När cellerna når 60 − 70% confluency bort mediet från skålen eller kolven.
- Tvätta 1x med 10 ml av Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning utan ca2 + eller mg2 +.
- Tillsätt 3 ml/T75 kolv med 0,05% trypsin/EDTA-lösning och se till att hela enskiktslager täcks med trypsinlösningen.
- Inkubera i 3 − 5 minuter vid 37 ° c tills cellerna börjar lossna. Försiktighet bör iakttas för att inte över-trypsinize cellerna och inte tvinga cellerna att lossna i förtid.
- Tillsätt 8 ml DMEM kompletterat med 10% fetalt kalv serum och 1% penicillin och streptomycin eller kompletta medier och samla in cellerna genom pipettering. Serumet i massmedia ska neutralisera trypsinen.
- Snurra på 250 x g i 3 min vid rumstemperatur. Aspirera på supernatanten.
- Tillsätt 8 ml färskt komplett material till 15 ml-röret som innehåller cellpelleten, och Pipettera cellerna upp och ner tills cellerna är spridda i en enda cellsuspension.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern och späd till en koncentration av 5 x 106 celler per ml i kompletta medier (DMEM med fenol röd/1% av en 200 mm L-alanyl-L-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl lösning kompletteras med 10% fetalt kalv serum och 1% penicillin och streptomycin).
- Ta 10 μL av cellsuspensionen MDA-MB-231 och deponera den på membranet. Detta motsvarar 50 000 celler/10 μL för MDA-MB-231. Droppen ska täcka si3N4 -membranet väl och kan spridas lite på kisel ramen. Försiktighet bör iakttas för att inte beröra si3N4 -membranet med spetsen på mikropipetten.
Beroende på vilken typ av cellinjer och experiment eller mätningar, CELLTÄTHETEN kan variera och bör testas i enlighet med detta. Här hittades den föreslagna CELLTÄTHETEN för sådd av Si3N4 -membranet optimalt för försöksbetingelserna och ytterligare SR-XRF nano-analys av MDA-MB-231-cellerna2. - För Hippocampus nervceller (HN), ta bort Hippocampus hjärnvävnad från embryonala dag 18,5 möss och smälta den i 0,25% trypsin i Hepes-Hbss (5,3 mm KCL, 0,44 mm KH2Po4, 137,9 mm NaCl, 0,34 mm NaH2Po4, 5,56 mm glukos) vid 37 ° c för 15 min18,19.
- Använd en P1000-pipett med en P1000 spets och en P200-spets för att utföra den mekaniska dissociationen genom att dra och släppa kon innehållet med pipetten flera gånger. Under detta steg, vara noga med att inte skapa luftbubblor i mediet, eftersom luftbubblor är giftiga för neuroner.
- Vänta några minuter tills aggregatet lägger sig i botten av röret.
- Överför supernatanten som innehåller de dispergerade cellerna till ett sterilt Eppendorf-rör. Lämna ~ 25 μl odlingssubstrat som innehåller aggregatet.
- Räkna dissocierade celler med hjälp av en hemocytometer. Isolerade HN nervceller är klädd i en koncentration av 7 x 104 celler cm-2 på Poly-l-lysin (1 mg/ml Poly-l-lysin)-belagda kisel nitrid membran.
- Endast för membran med HN, inkubera nervceller i första DMEM kompletteras med 10% foster bovint serum. En h efter plätering HN i DMEM, mediet ändras till neurobasal plating media (200 mm L-alanyl-L-glutamin dipeptid i 0,85% NaCl lösning, och B27 tillägg d = 1/50 utspädd i neurobasal)18,19.
- För de MDA-MB-231 celler, sätta membran stöd vid 37 ° c i inkubatorn (100% relativ luftfuktighet, 95% luft och 5% CO2) för 25 min. Detta gör att cellerna att bosätta sig och börja fästa till underlaget. Detta kan anpassas beroende på vilken cell linje som används.
- Tillsätt 1 mL av det nödvändiga kompletta odlingsmediet (DMEM med fenolrött/1% av en 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl-lösning kompletterad med 10% fetalt kalv serum och 1% penicillin och streptomycin) i varje brunn av MDA-MB-231 celler genom att sätta pipettspetsen mot väggen i plasten väl och frigöra mediet mycket långsamt medan det täcker membranet.
- Sätt membranet vertikalt mot väggen på 4-brunnen plattan för att ta bort eventuella luftbubblor fångade i brunnen hålighet i si3N4 membran (figur 2). För att göra det, Använd fin pincett och tryck bort bubblan mycket försiktigt, flytta parallellt med Si3N4 baksidan ram för att undvika att röra och skada membranet.
- Sätt membranet tillbaka horisontellt på botten av brunnen och lämna 4 väl plattan i inkubatorn för önskad tid beroende på tillväxttakten i den cell linje som används. De MDA-MB-231 celler inkuberades över natten.
3. behandling eller medelstor förändring
- Ta bort mediet från den 4 brunnen plattan.
- Skölj en gång med 1 mL PBS-lösning vid 37 ° c. Kassera PBS och tillsätt 1 mL värmda komplett färskt medium i närvaro eller i frånvaro (kontroller) av önskad behandling med en 1 mL pipett spets, frigöra vätskan mycket långsamt mot väggen i brunnen plattan. Si3N4 -membranet ska vara långsamt nedsänkt utan några störningar för att undvika membran rörelse eller lyft.
4. Cryo-immobilization av den cellulära beredningen genom att störta-frysning
Anmärkning: vid slutet av den erforderliga inkubationstiden, i närvaro eller frånvaro av behandling, måste cellerna noga sköljas och kryofixas. Runt 30 min innan du börjar att skölja och blot den cellulära beredningen innan störta-frysning, första set-up och kyla ner den automatiska dykmaskinen. När du manipulerar Kryogener krävs användning av lämpliga kryogena handskar, skyddsglasögon, stängda skor och en laboratorie kappa. Flytande kväve måste transporteras i lämpliga Dewars, och arbetsplatsen bör vara tillräckligt ventilerad med närvaron av en syrgas Monitor. Idealet är att en låg hygrometrinivå på 20 − 30% hjälper till att begränsa iskontaminering av material, Dewars och Kryogener, vilket är skadligt för förglasningen av proverna (dvs. ett amorft islager). I idealfallet kan, beroende på forskarens erfarenhetsnivå, upp till 10 − 12 prover för en enda session förberedas med samma sekundära cryogen Liquid etan Cup för förglasning. Mellan sessioner, den automatiska dykfrysen kräver en 1 h automatisk Bake-out förfarande. Helst bör proverna bearbetas med identiska inkubationsförhållanden. Kontroller kan fortfarande bearbetas först, följt av proverna med ett visst behandlings tillstånd.
Anmärkning: för Plunge-frysning följande steg gäller både MDA-MB-231 eller HN celler.
- Ställ in kryokolven för snabb kryofixering av celler.
- Slå på den automatiska dykfrysen.
- Ange parametrarna (t. ex. temperatur, procent fuktighet, blotting tid om automatisk blotting används, och position för att lyfta provet till ytan av kryogen för att underlätta överföring till en kryogen behållare) direkt från konsolen och parametrar menyn Inställningar. I förevarande fall var luftfuktighets kammarens parametrar inställda på 37 ° c och 80% luftfuktighet.
Obs: bättre förglasning resultat erhölls för detta protokoll och röntgenbildtagning med snabb och noggrann manuell blotting. Således använder protokollet inte ett automatiskt blotting Sequence program. - Fäst luftfuktare kammaren och för att bevara fuktigheten först fylla den med hjälp av en spruta med 60 mL dubbeldestillerat vatten, och sedan 20 mL som kallas för på den automatiska dykfrysen konsolen.
Obs: Undvik att använda ultrarent vatten eftersom det kan skada spridare systemet. Stäng ventilen och låt slangen fästas på baksidan av befuktaren. - Montera den svarta etan-koppen i hållaren och täck den med plastkåporna.
- Fyll Dewar av den kalla kammaren med LN2, föra den till nivån på nätet inom arbetsområdet.
- Placera en särskild Cryo-box för att förvara membranen efter kryofixering i överförings behållaren som hålls på den dedikerade platsen i EM-GP-arbetsområdet och nära till etan-Mugghållaren.
Obs: den särskilda Cryo-Box är en egen utveckling på nanoprobe fd ID16A av den europeiska synkrotron strålningen i Grenoble. Ritningar med specifikationer finns tillgängliga på begäran (figur 3). De kan förvaras fyra i taget i ett 50 mL koniskt rör för långtidsförvaring i en LN2 Dewar. En alternativ möjlighet består i att använda en liten 0,2 mL regelbunden PCR tunna vägg röret med Dome CAPS för att lagra en enda si3N4 membran stöd. Du kommer att behöva borra ett ~ 2 mm hål i den övre delen av väggen röret med en uppvärmd spruta nål för att låta LN2 att fylla röret. - Fyll överförings behållaren med LN2 och täck den med det dedikerade aluminium locket. Fortsätt att fylla den kalla kammaren med LN2 (typiskt ~ 2 L behövs) hålla på 100% av LN2 nivå Monitor visas på konsolen. Vänta tills den slutliga nödvändiga temperaturen har uppnåtts.
- Ta bort plastlocket och täck etan-koppen med likriktaren som är ansluten till etan flaskan. Vänta tills temperaturen på etan-koppen motsvarar temperaturbörvärdet. När du nått, börja använda den sekundära kryogen (dvs., flytande etan).
Anm.: det börvärde som används var-180 ° c, något över etan Smältpunkt (-182,8 ° c). Du behöver inte kyler etan likriktaren eftersom det kan vara en källa till frostbildning och kontaminering av etan koppen. - Öppna huvudventilen för etan med hög renhet och öppna tryckregulatorn mycket långsamt tills du får en långsam dimma av etan. Håll detta mycket låga flöde tills flytande etan byggs upp. Fyll koppen till dess övre kant. Stäng tryckregulatorn och huvudventilen på etan flaskan. Ta försiktigt bort Leica-likriktaren och lämna den åt sidan på en liten polystyrenstöd under draghuven. Håll arbetsområdet löst täckt med den svarta polystyren locket som medföljer maskinen för att förhindra frost förorening av arbetsområdet och etan behållaren.
- Strax före manuell blotting av provet, ta bort svart polystyren locket och från menyn på konsolen tryck på "nedre kammaren", vilket innebär att miljö kammaren i kontakt med kryogena arbetsområdet.
- Förbered att blot-provet.
- Förbered den lämpliga bufferten för att avlägsna spår av salter från odlingsmediet. För detta protokoll användes ammoniumacetatbuffert för att skölja MDA-MB-231-cellerna.
Anmärkning: Ammoniumacetatbuffert är lämplig för de flesta celltyper, och det tillför inte till röntgen fluorescens signal (med tanke på element med Z > 9). Vissa särskilda cellinjer som neuronala celler kan kräva användning av en dedikerad buffert. Till exempel, för primära kortikala neuroner, en saltlösning som består av 1,8 volym 0,5 M na2HPO4 och 1,9 volym av 0,5 m NaH2Po4 kan användas15. Å andra sidan kommer fosfor eller klor som finns i bufferten att bidra till XRF-spektrumet. Denna begränsning av falska röntgenutsläppslinjer måste hållas i åtanke beroende på vilka delar av intresset som ska upptäckas. - Förbered en 150 mm ammoniumacetat lösning från ammoniumacetat ultrarent lösning och kontrollera pH (7,0 – 7.3) och osmolaritet (270 – 300 mOsm/kg)
Anmärkning: ovan nämnda osmolaritet motsvarar Dulbecco s fosfatbuffert saltlösning (D-PBS) utan kalcium och magnesium och kan kontrolleras med hjälp av en mikro-Osmometer. - Fyll i erforderligt antal brunnar från en 12 väl plastplåt med ammoniumacetatbufferten.
- Skär en fjärdedel av filterpapper för blotting, antingen från nr 1 filterpapper med ett precut hål, eller från manuellt stansade filterpapper med en 55 mm diameter med ett 15 mm centralt hål.
- Ta ut det erforderliga provet som förvaras i inkubatorn vid 37 ° c i sista stund innan sköljning och djupdykning-frysning av membranet.
- Lås upp pincetten med den svarta kläm ringen i Quick-Release-tånageln (typiskt en Dumont-klämring med högprecisions medicinsk pincett) och greppa si3N4 -membranstödet från kultur brunnen.
Obs: ta tag i mitten av kisel ramen, hålla spetsen på pincetten nära membranet. Flytta den svarta kläm ringen ner till de första ränderna för att låsa pincetten. - Sänk ner si3N4 -membranstödet vertikalt i ammoniumacetatbuffertlösningen som hålls vid 37 ° c i ~ 5 s.
Obs: stödet ska förbli vertikalt i bufferten. Observera att buffertlösningen i varje brunn på plattan kan användas för upp till tre membran för samma inkubationsförhållanden. - Blot manuellt med filterpapper för att tömma ut överflödig buffert från membran sköljnings lösningen (figur 4) för att lämna ett tunt och homogent skikt av ammoniakacetat vattenlösning som täcker cellerna.
ANMÄRKNINGAR: för att göra det, Tryck först på baksidan av fönstret på filterpapperet för att ta bort nästan all vattenbuffert som återstår i brunnen och baktill på membranet. För det andra, blot den främre sidan, med början från båda sidor av pincetten, sedan varje sida av ramen (figur 4). Vidrör aldrig membranet. Överskottet av bufferten dräneras kan övervakas med Gloria bildas på filtrerpapper. - Öppna luckan till miljö kammaren och montera pincetten snabbt, Skjut in den i tång låset och Stäng luckan (figur 5).
- Tryck på "blot/A Plunge". Den pincett som håller si3N4 -membranet kommer att snabbt störtas in i kryogen.
- Ta bort locket på överförings behållaren med förtryckta pinps.
- Tryck på "transfer". Si3N4 -membranet kommer att flyttas något uppåt över kryogen.
- I en enda snabb rörelse, koppla bort pincetten genom att skjuta dem ur tånaglainterlock och lätt luta sig ur Interlock för att få direkt in i en tom plats i Cryo-boxen i överförings behållaren fylld med LN2. Lossa den svarta kläm ringen för att frigöra membranet (figur 5).
Obs: överförings behållaren ska alltid täckas med LN2. När en påfyllning krävs ska du täcka etan-koppen med det plastlock som medföljer maskinen för att undvika att blanda LN2 och etan. - Täck över överförings behållaren med ett lock och Använd en liten vit polystyren kopp fylld med LN2 för att överföra den till en polystyren låda fylld med ln2.
Anmärkning: Cryo-boxen eller röret som innehåller membranen kan sedan förvaras i 50 mL koniska rör fyllda med LN2 och överföras till långtidsförvaring LN2 Dewar. Innan du börjar att störta frysa nästa prov, värma upp alla kalla och frostat pincett med en hårtork eller en värmeplatta/kryotools torktumlare (45 ° c) för att undvika kontaminering med iskristaller.
- Förbered den lämpliga bufferten för att avlägsna spår av salter från odlingsmediet. För detta protokoll användes ammoniumacetatbuffert för att skölja MDA-MB-231-cellerna.
5. frystorkning av djupfrysta celler odlade på silikonnitridmembran
Anmärkning: för frystorkning gäller följande steg för både MDA-MB-231 och HN-celler. För att kyla ner frys torken, måste du vänta runt 40 min till 1 h.
- Ställ in frys torkaren
- Slå på strömmen med vippbrytaren som sitter på instrumentets baksida.
- Börja med att ange parametrarna efter LCD-menyn: segment 1 = 2 h vid-120 ° c; Segment 2 = 2 h ramp från-120 ° c till-80 ° c; Segment 3 = 2 h vid-80 ° c; Segment 4 = 2 h ramp från-80 ° c till 50 ° c; Segment 5 = 2 h vid-50 ° c; Segment 6 = 6 h ramp från-50 ° c till 30 ° c.
- I slutet av parameterinställningen, spara inställningarna, Stäng kammar locket och tryck på "StarT".
- Enheten kommer att pumpa ner till 1,10-5 mbar. När detta tryck nås, kommer kommandoraden på displayen att Visa "börja kyla nu, börja att fortsätta".
- Fyll flytande kväve Dewar regelbundet för att kyla ner scenen under temperaturen trippelpunkt inställning.
Obs: steg temperaturen för trippelpunkten är inställd på-140 ° c. Före lastning provet för detta protokoll, är det bäst att vänta ca 1 h och ett temperatur skede-160 ° c. - Displayen visar "Tryck på ENTER" när du är redo att "Ladda prov".
- Kyl ner till flytande kväve temperatur i en LN2 fylld polystyren Dewar, provet överförings hållaren tillhandahålls av leverantören, och de två extra mässing cylindriska si3N4 membran hållare.
- Montera den si3N4 membran mässing hållaren ovanpå provet överförings hållaren som tillhandahålls av leverantören i polystyren Dewar (figur 6A). Håll nivån på LN2 till ca 1 − 2 mm under den övre kanten av den första mässings biten.
- Plocka upp en SI3N4 membran prov stöd från Cryo-Box eller PCR-röret med förtryckta självstängande pincett i Inox eller Teflon-belagda.
- Deponera membranet med cellerna provsidan vänd uppåt i mässing hållaren numrerade hålighet.
- Täck monteringen med det andra mässings stycket som lock (figur 6C).
Obs: vi designade två mässings skivor vardera med en tjocklek av 5 mm, en diameter på 50 mm, och ett centralt hål på 11 mm diameter. Den första mässing skivan har 14 bearbetade rektangulära (8 mm x 6 mm) platser för att rymma stöd (5 mm x 5 mm). Varje slot har en platt och polerad brunn med ett djup på 2 mm. Den andra mässing skivan är platt för att täcka si3N4 membran mässing stöd och fungerar som en kall fälla hölje. - Precool överförings staven i LN2 fyllda polystyren skum låda och använda den för att låsa i hela församlingen (figur 6D, E).
- Tryck på "ENTER" på frys torkens frontpanel.
- Turbo och roterande pumpar kommer att stanna och kammaren rensats med torr kväve gas för att öppna locket på kammaren.
- Överför omedelbart prov överföringsenheten med den fjäderbelastade överförings staven till frys torkens kammare och klipp den på koppar LN2 kallt skede.
Obs: lämna hela monteringen med överförings staven i kammaren. - Stäng omedelbart locket till frys torkkammaren och tryck på "StarT" för att fortsätta med frys tork cykeln.
- Fyll upp LN2 behållaren för frys torken manuellt varje 2 h.
Obs: en automatisk LN2 fyllningssystem kan anslutas till denna reservoar. - Vid slutet av frystorkning cykeln, tryck på "stoP" för att ventilera kammaren, och ta bort hela monteringen för att få tillgång till de frystorkade proverna.
Representative Results
En typisk optisk video Mikroskop bild av frysta hydrerade MDA-MB-231 celler som sub-odlade på en poly-L-lysine belagda si3N4 membran stöd visas i figur 7a. Den optiska vyn av provet i vakuumkammaren erhölls i reflektions läge med hjälp av dedikerad online video Mikroskop av ID16A fd av ESRF22. Medan elektron eller mjuk röntgen mikroskopi kräver isskiktet bädda in cellen för att vara så tunn som möjligt (vanligtvis < 0,5 μm), hårda röntgenstrålar (> 10 keV) har fördelen av en mycket högre penetrationsdjup och lägre dos deposition. Isen tjocklek kan därför vara större, typiskt < 10 μm inklusive cellen så att isen bädda in cellen är några μm i tjocklek. Detta kan uppskattas genom den uppmätta röntgenintensiteten i transmission jämfört med intensiteten utan provet, med hänsyn tagen till absorptionen av 500 Nm tjockt si3N4 -membran. Denna is tjocklek kan uppnås genom manuell blotting som beskrivs i detta protokoll. I Newton ringar regionen, isen tjocklek kan vara ännu tunnare (inte mätt).
Röntgen fluorescens elementära kartläggning av den frusna hydrerade cellen visas i figur 7B med representativa fördelningar av fysiologiska element såsom kalium (K), svavel (S) och zink (Zn). Dessa kartor representerar elementär areal massan (dvs. elementär projicerad massa). Även om det inte görs i det aktuella fallet, kan sådana kartor normaliseras genom Röntgenspridning-baserad faskontrast avbildning som ger uppskattningen av provet projicerade massan23. Som rapporterats av många studier, den mycket diffus K ion i celler bevarade i deras nära-infödda tillstånd antogs vara homogent distribueras i hela cellen23,24,16. Som visas i 2D röntgen fluorescens elementära bilder i figur 7B, den tätt bundna element S var jämnt fördelade i cellen, på samma sätt som K, och utgör en bra uppskattning av cellulära massa profil. Zn-distributionen hade en högre signal i kärnan än i cytosolen och tydligt redogjorde för kärnan. Det kan noteras att små Zn-anrikade regioner kan upptäckas vid den rumsliga upplösningen (50 nm) i kärnkrafts regionen.
De befintliga röntgen nanosonderna eller de som ska byggas uppfyller inte nödvändigtvis kryogena egenskaper. I detta fall, det bästa alternativet för att få röntgen fluorescens bilder av celler vid sub-100 nm rumsliga upplösningar är att utföra en frystorkning förfarande som beskrivs i detta protokoll efter djupfrysning av cellen. Figur 8a visar en typisk ljus fält mikroskopi syn på resulterande frystorkad primär mus Hippocampus nervceller direkt odlade på Si3N4 membranet. I detta fall, om de förvaras i en ren, desiccerad kammare, kan proverna beredas 1 − 2 veckor i förväg och observeras med ett vanligt upprätt optiskt mikroskop för registrering av intresseområden. Försiktighet bör iakttas för att förhindra exponering för omgivande luftfuktighet eftersom det kan fångas upp av det frystorkade provet och leda till skador under röntgen nanobeam. Denna procedur tillämpades framgångsrikt på mycket känsliga celler (dvs neuronala celler) och ännu bättre resultat erhölls med andra mer robusta typer av celler, såsom cancerceller. När det gäller djupfrysta celler, röntgen fluorescerande bilder av K, S och Zn på hela frystorkad cell visas liknar de som beskrivs ovan. De är representativa för de elementära distributioner som finns i olika typer av frystorkade celler vid 50 − 100 nm rumslig upplösning. Medan frystorkning hela celler är ett alternativ till att bevara elementär integritet, är det på bekostnad av en perfekt bevarande av cellmorfologin16, särskilt cellmembran.
Figur 1: typiskt prov stöd för nanoanalys av röntgen fluorescens. Ett si3N4 -membran stöd i sin skyddande kapsel. Denna typ av substrat kan användas både för rumstemperatur analys (Plunge-frys cellulära förberedelse följt av låg temperatur och lågvakuum frystorkning process) eller för kryogen röntgenfluorescens analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av kisel nitrid-Fönstren efter cell sådd. Cellerna odlas direkt på Poly-L-lysine belagda plana ytan av Si3N4 membran stöd. Ibland luftbubblor kan fastna i baksidan hålighet av Si3N4 membran stöd och måste avlägsnas enligt beskrivningen i protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: egenutvecklade 3D-tryckta Cryo-box för långtidslagring av djupfryst si3N4 membran stöd i flytande kväve Dewar. A) Cryo-Box demonteras med behållaren och locken (nedre delen) och (B) den monterade kryo-boxen med låsta lock. Locken kan manipuleras med pincetten, öppning eller låsning genom rotation. En detaljerad plan för 3D-utskrifter finns på begäran från ESRF ID16A. Designen har gjorts för att rymma kisel nitrid TEM rutnät. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: blottning av celler odlade på Si3N4. Före Plunge-frysning cellen enskiktslager odlade på en SI3N4 membran måste sköljas i ammoniumacetatlösning (a) och försiktigt manuellt utplånas med hjälp av filterpapper (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: automatisk Plunge-frysning EM-GP-maskin. (A) den automatiska dykfrysen. Bmiljökammare med pincetten inlåst.Cden etan-kopp som är täckt med Leica-likriktaren ansluten till en etan-flaska. D) den djupfryst kapsling som visar den svarta koppen som är full av flytande etan och Cryo-boxen för ytterligare förvaring i LN2 av de förglasade si3N4 -membranen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: prov kryotransferenhet för frystorkning. (A) den första mottagaren av mässing för si3N4 -membran monteras ovanpå prov överförings hållaren som tillhandahålls av frys torkens leverantör. (B) och (C) visar att den andra platta mässings skivan används som täckmantel och fungerar som ett kallt fälla hölje som skall sättas in i vakuum höljet av frys torken. D) hela monteringen med den fjäderbelastade överförings staven. E) den provhållare som transporterar den förglasade cellulära beredningen som odlas på Si3N4 -membranet måste införas ytterligare i LN2-kyld frys tork. Alla steg för montering av monteringen görs i LN2 i en frigolit låda. För tydlighetens skull producerades alla bilder i avsaknad av LN2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Cryo-röntgen fluorescens bilder av en fryst hydrerad cell med hjälp av hård röntgen nanosond. (A) typisk online-vy i reflektions läge med hjälp av det dedikerade optiska video mikroskopet i ESRF ID16A beamline. Efter manuell blotting uppnåddes en total is tjock lek på ca 5 − 10 μm som ger en klar bild av de frusna hydrerade cellerna. En region med Newton ringer indikativt av även mycket tunnare is är märkbar. Brepresentativa kryoröntgenfluorescens cellulära distributioner av fysiologiska element kalium (K), svavel (S) och zink (Zn). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: röntgen fluorescens bilder av en frystorkad neuronala cell med hjälp av hård röntgen nanosond. (A) typisk ljus fälts mikroskopi syn på resulterande frystorkade primära kortikala neuronala celler direkt odlade på Si3N4 -membranet. Skalstapel = 200 μm (B) representativ rumstemperatur X-strålfluorescens bilder av en enda frystorkad Hippocampus neuron som visar fördelningen av fysiologiska element kalium (K), svavel (S) och zink (Zn). Scale bar = 2 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Cryo-Electron mikroskopi (Cryo-EM) vann 2017 Nobel priset i kemi och som sådan den utveckling som J. dubochet på vitrifiering av biologiskt material för högupplöst strukturbestämning av biomolekyler i lösning25. Som rapporterats av Dubochet i hans Nobel föreläsning "att veta hur man vitrify en droppe vatten är en sak, förbereder ett biologiskt prov för biologisk observation är en annan"25. Cryopgottgörelse steg nu anses vara standardteknik för att lindra strålning dos skador och studera celler nära deras hemland. Förberedelserna är dock långtråkigt. Detta beror på att elektronmikroskopi, på grund av dess oöverträffade rumsliga upplösning, är känslig för alla ultrastrukturella artefakter som uppstår under provet preparatet. Den synkrotron cryonanosonder närmar sig nu liknande svårigheter att gå ner till rumsliga upplösningar så lågt som 13 nm i den höga energi X-ray Range26. Hard röntgen Mikroskop kan analysera hela celler medan elektronmikroskopi lider av den dåliga penetrationsdjupet av elektroner som gör att endast mycket tunna cell skivor observeras.
Monolayers av celler är tunna nog så att genom att störta-frysning i flytande etan, den erforderliga kylningen för vatten vitrifiering uppnås. I teorin, kylning priser så höga som 108 K/s är möjliga att använda högtrycks frysning27 som gör att förglasning av prover för tjocka för att störta frysning. En kylhastighet på 105 K/s, som krävs för att möjliggöra full förglasning av provet vid omgivningstryck28, uppnås med hjälp av den automatiska dykmaskinen och parametrarna som presenteras här. Detta gör det möjligt för en forskare att vitrify tunna biologiska prover (< 10 μm) såsom en enskiktslager av celler12,13,14,15,29,30 genom att störta-frysning i flytande etan.
En viktig utmaning med detta protokoll är också att så mycket som möjligt bevara den kemiska integriteten hos det intracellulära innehållet för att ge pålitliga elementära distributioner inom cellen i 2D eller 3D. Som offentliggjorts på annat håll2,16,17,31, när det gäller elementär avbildning på subcellulär nivå, bör analysen av frysta hydrerade celler övervägas. Annars, kombinationen av Plunge-frysning och frystorkning av celler kan användas för rumstemperatur analys. För den senare, den amorfa isen avlägsnas genom processen för sublimering, medan de bundna vattenmolekylerna avlägsnas genom processen för desorption. Denna process kan vara långt ifrån perfekt jämfört med frysta hydratiserade prover på grund av den eventuella förändringen av cellmembranen och morfologin av vissa subcellulära strukturer32. Också, för artbildning studier, vattenutvinning kan leda till metall artbildning artefakter. Ändå har det varit framgångsrikt och det bästa alternativet till frysta hydratiserade prover för elementär avbildning vid sub-100 nm nivåer2,16,17,18,20,33,34,35,36.
Eftersom det har rapporterats37, kvaliteten på kryopreserverade cellulära preparat kan utvärderas genom kalium-till-natrium K/na förhållandet. Tyvärr kan det ännu inte bestämmas med den hårda röntgen-nanoprobe som används här, på grund av den låga energi cut-off av kisel drift detektor används för att upptäcka röntgen fluorescens fotoner av elementen (E ≥ 1,3 keV magnesium). Faktum är att ett högt K/na-förhållande (> 10) som kan mätas med hjälp av TOF-Sims, epma eller nukleär mikrosond Pixe16,37 är ett tecken på den bevarade kemiska integriteten hos cellen jämfört med den förväntade K/na på 25 i en levande cell37. Detta kan stödjas av en samtidig låg cl/K ratio38. Fortfarande, ofullkomliga förglasning, särskilt om hastigheten på provet kylning är för låg, kan leda till bildandet av stora iskristaller som kan skada cellmembran och organeller, följaktligen förändra distributionen av kemiska element. Även om det inte finns något rutinmässigt förfarande för att övervaka denna potentiella skador och inverkan på den intracellulära distributionen, ovanstående elementärt nyckeltal och möjligheten att bilden cellen med hög upplösning med röntgen faskontrast eller Cryo-mjuk röntgen mikroskopi kan vara de bästa metoderna för att stödja god bevarande av intracellulära fack med samtidig bevarande av elementär integritet. Kombinationen av dessa tekniker och användningen av nya kryokorrelativa fluorescens optiska mikroskop kommer att bidra till att bedöma i vilken utsträckning denna skada uppstår och påverkar den intracellulära elementära distributionen.
Övergripande, ett detaljerat och omfattande protokoll för att förbereda cellulära prover för synkrotron röntgen fluorescens nanoanalys presenteras. Det är en bra utgångspunkt för forskarsamhället, hjälper till att lösa den svåra frågan om hur man förbereder lämpliga cellulära prover för 2D och 3D Elemental Imaging på (Cryo) hård röntgen nanosonder. Dessa metoder kan slås samman med optisk fluorescens och elektronmikroskopi kapacitet för djupgående korrelativa kemisk och strukturell avbildning av celler.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Experimenten på nano-Imaging fd ID16A utfördes inom ramen för ESRF-förslagen LS2430, LS2303 och LS2765.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Acetate solution, BioUltra, for molecular biology, ~5M in H2O | SIGMA | 09691-250mL | One can prepare the required solution from high-grade ammonium acetate powder and ultrapure water, pH and osmolarity needs to be adjusted anyway. |
| B27 supplement, 50x | Life Technologies, Invitrogen | 17504-044 | for hippocampal neuron culture |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, DPBS, ([-] CaCl2, [-] MgCl2) | GIBCO | 14190-094 | cell culture |
| DMEM with Phenol Red/Glutamax I (Medium ATCC modification) | GIBCO | 21885025 | cell culture |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Life Technologies, Invitrogen | 31966-02 | for hippocampal neuron culture |
| Dumont Tweezers #5, Straight Self-closing, 0.05x0.01mm Tips, Biology | World Precision Instrument | 501202 | |
| Emitech K750X Peltier-Cooled EM Freeze Dryer | Quorum Technology | EK3147 | |
| Ethane N45 | Air Liquid | p0505s05r0a001 | C2H6 > 99,995 % |
| Fetal Bovine Serum, Performance Plus, certified One Shot format, US origin | GIBCO | A31604-02 | cell culture |
| HBSS 10x | Life Technologies, Invitrogen | 14185-052 | for hippocampal neuron culture |
| Leica GP quick-release forceps | Leica | 16706435 | |
| MDA-MB-231 cell line, an epithelial, human adenocarcinoma breast cancer cell | ATCC | ATCC HTB-26 | cell culture |
| Neurobasal medium | Life Technologies, Invitrogen | 21103-049 | for hippocampal neuron culture |
| Nunc 4-Well Plate | Thermo Fisher | 176740 | cell culture |
| Osmo1 Single-Sample Micro-Osmometer | Advanced Instruments | Osmo1 | Alternative can be found at Fisher scientific (Wescor Inc. VAPRO® Vapor Pressure Osmometer) |
| Penicillin-Streptomycin | SIGMA | P4333 | cell culture |
| poly-L-lysine | SIGMA | P4707 | Other type of coating can be used that is dependent of the cell type to be cultured on the membrane, other adhesion factors such as fibronectin, collagen, polyornithine can be tested accordingly. Cell can be cultured directly on silicon nitride membrane, but the latter are slightly hydrophobic and adhesion factors are recommended unless the membrane are processed to be hydrophilic (glow plasma discharged). |
| Plunge freezing robot Leica EM GP main unit | Leica | 16706401 | Alternative for automated plunger are the Vitrobot Mark IV (FEI), CryoPlunge 3 (Gatan), MS-002 Rapid Immersion Freezer (EMS). Manual home-made system can be used but an environment-controlled chamber is an asset for plunge-freezing. |
| Silicon nitride membrane (Si3N4) | Silson Ltd. | SiRN-5.0(o)-200-1.5-500-NoHCl | The proposed silicon nitride membrane type is optimised for analysis at ID16A ESRF X-ray nanoprobe, The 500 nm thickness of the membrane was chosen being more robust for cellular manipulation and cryofixation detailed within this protocol. Membrane with thickness of 200 nm or below can also be used although quite fragile, and other design of silicon nitride membrane can be purchased (for example TEM compatible membrane...) from Sislon or other company such as Norcada, SPI supplies, Ted Pella, EMS, LabTech, Neyco... |
| Trypan blue solution 0.4% | GIBCO | 15250061 | cell culture |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | GIBCO | 25300-054 | cell culture |
| Ultratrace Elemental Analysis Grade, Ultrapure Water | Fisher Chemicals | W9-1 | MilliQ water can be used but has to be tested for trace element level of contamination using for example ICP-MS analysis. |
| Whatman No. 1 filter paper with precut hole | Leica | 16706440 | Alternative filter paper may be used and must have an outer diameter of 55 mm, the Punch for filter paper system from Leica (ref.16706443) can be used. |
References
- Lewis, D. J., et al. Intracellular synchrotron nanoimaging and DNA damage/genotoxicity screening of novel lanthanide-coated nanovectors. Nanomedicine. 5 (10), 1547-1557 (2010).
- Fus, F., et al. The intracellular localization of osmocenyl-tamoxifen derivatives in hormone-independent breast cancer cells revealed by 2D and 3D nano X-ray fluorescence imaging. Angwendte Chemie. , (2019).
- Janssens, K., Adams, F., Rindby, A. Microscopic X-Ray Fluorescence Analysis. , Wiley. Chichester, UK. (2000).
- Carmona, A., et al. Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. Neurotoxicology. 68, 177-188 (2018).
- Leapman, R. D., Hunt, J. A., Buchanan, R. A., Andrews, S. B. Measurement of low calcium concentrations in cryosectioned cells by parallel-EELS mapping. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 225-234 (1993).
- Saubermann, A. J., Echlin, P., Peters, P. D., Beeuwkes, R. Application of scanning electron microscopy to X-ray analysis of frozen hydrated sections. I. Specimen handling techniques. Journal of Cell Biology. 88 (2), 257-267 (1981).
- Saubermann, A. J., Heyman, R. V. Quantitative digital X-ray imaging using frozen hydrated and frozen dried tissue sections. Journal of Microscopy. 146, Pt2 169-182 (1987).
- Wroblewski, J., Roomans, G. M. X-ray microanalysis of single and cultured cells. Scanning Electron Microscopy. , Pt 4 1875-1882 (1984).
- Wroblewski, J., Müller, R. M., Wroblewski, R., Roomans, G. M. Quantitative X-ray microanalysis of semi-thick cryosections. Histochemistry. 77 (4), 447-463 (1983).
- Zierold, K. Cryopreparation of mammalian tissue for X-ray microanalysis in STEM. Journal of Microscopy. 125, Pt2 149-156 (1982).
- Harkiolaki, M., et al. Cryo-soft X-ray tomography: Using soft X-rays to explore the ultrastructure of whole cells. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 81-92 (2018).
- McDermott, G., Le Gros, M. A., Knoechel, C. G., Uchida, M., Larabell, C. A. Soft X-ray tomography and cryogenic light microscopy: the cool combination in cellular imaging. Trends in Cell Biology. 19 (11), 587-595 (2009).
- Schneider, G., et al. Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy. Nature Methods. 7 (12), 985-987 (2010).
- Sorrentino, A., et al. MISTRAL: a transmission soft X-ray microscopy beamline for cryo nano-tomography of biological samples and magnetic domains imaging. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (4), 1112-1117 (2015).
- Carzaniga, R., Domart, M. C., Duke, E., Collinson, L. M. Correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray tomography of adherent cells at European synchrotrons. Methods in Cell Biology. 124, Academic Press. 151-175 (2014).
- Perrin, L., Carmona, A., Roudeau, S., Ortega, R. Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 30 (12), 2525-2532 (2015).
- Jin, Q., et al. Preserving elemental content in adherent mammalian cells for analysis by synchrotron-based x-ray fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 265 (1), 81-93 (2017).
- Daoust, A., et al. Impact of manganese on primary hippocampal neurons from rodents. Hippocampus. 24 (5), 598-610 (2014).
- Daoust, A., et al. Manganese Cytotoxicity Assay on Hippocampal Neuronal Cell Culture. Bio-protocol. 5 (1), 1368 (2015).
- Gibon, J., et al. The over-expression of TRPC6 channels in HEK-293 cells favours the intracellular accumulation of zinc. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1808 (12), 2807-2818 (2011).
- Hasna, J., Bohic, S., Lemoine, S., Blugeon, C., Bouron, A. Zinc Uptake and Storage During the Formation of the Cerebral Cortex in Mice. Molecular Neurobiology. , 1-13 (2019).
- Villar, F., et al. Nanopositioning for the ESRF ID16A Nano-Imaging Beamline. Synchrotron Radiation News. 31 (5), 9-14 (2018).
- Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. Journal of Structural Biology. 177 (2), 239-247 (2012).
- Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Applied Physics Letters. 78, 3544-3546 (2001).
- Dubochet, J. On the Development of Electron Cryo-Microscopy (Nobel Lecture). Angwendte Chemie. 57 (34), 10842-10846 (2018).
- Da Silva, J. C., et al. Efficient concentration of high-energy X-rays for diffraction-limited imaging resolution. Optica. 4 (5), 492-495 (2017).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high-pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
- Moor, H. Theory and pratice of high pressure freezing. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer. 175-191 (1987).
- Gilkey, J. C., Staehelin, L. A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Journal of Electron Microscopy Techniques. 3 (2), 177-210 (1986).
- Ferreira, J. L., Matthews-Palmer, T. R., Beeby, M. Electron Cryo-Tomography. Cellular Imaging. , Springer, Cham. 61-94 (2018).
- Colvin, R. A., Jin, Q., Lai, B., Kiedrowski, L. Visualizing metal content and intracellular distribution in primary hippocampal neurons with synchrotron X-ray fluorescence. PLoS One. 11 (7), 0159582 (2016).
- Vavpetič, P., et al. Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. 348, 147-151 (2015).
- Guerquin-Kern, J. L., Bordat, C. Cryo-preparation procedures for elemental imaging by sims and eftem. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , CRC Press. 499-536 (2008).
- Gramaccioni, C., et al. Nanoscale quantification of intracellular element concentration by X-ray fluorescence microscopy combined with X-ray phase contrast nanotomography. Applied Physics Letters. 112 (5), 053701 (2018).
- Perrin, L., et al. Zinc and Copper Effects on Stability of Tubulin and Actin Networks in Dendrites and Spines of Hippocampal Neurons. ACS Chemical Neurosciences. 8 (7), 1490-1499 (2017).
- Ortega, R., et al. α-synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1925-1934 (2016).
- Fartmann, M., et al. Quantitative imaging of atomic and molecular species in cancer cultures with TOF-SIMS and Laser-SNMS. Applied Surface Sciences. 231 (2), 428-431 (2004).
- Pålsgård, E., Lindh, U., Roomans, G. M. Comparative study of freeze-substitution techniques for X-ray microanalysis of biological tissue. Microscopy Research and Techniques. 28 (3), 254-258 (1994).
