Summary
Närvarande här är ett detaljerat protokoll för användning av zebrafisk embryon Tg(vtg1: mCherry) för påvisande av östrogena effekter. Protokollet omfattar förökning av fisk och behandling av embryon, och betonar detektion, dokumentation och utvärdering av fluorescerande signaler som orsakas av hormonstörande föreningar (EDC).
Abstract
Det finns många hormonstörande föreningar (EDC) i miljön, särskilt östrogena ämnen. Detektion av dessa ämnen är svårt på grund av deras kemiska mångfald. Därför används allt mer effekt-upptäcka metoder, såsom östrogena effekt-känsliga biomonitor/bioindicator organismer. Dessa biomonitoring organismer inkluderar flera fiskmodeller. Detta protokoll omfattar användning av transgen linje zebrafisk Tg(vtg1: mCherry) som en bioövervakningsorganism, inklusive förökning av fisk och behandling av embryon, med tonvikt på detektion, dokumentation och utvärdering av fluorescerande signaler som induceras av EDC. Målet med arbetet är demonstration av användningen av Tg (vtg1: mCherry) transgena linje embryon för att upptäcka östrogena effekter. Detta arbete dokument användningen av transgena zebrafisk embryon Tg(vtg1: mCherry) för upptäckt av östrogena effekter genom att testa två östrogena ämnen, α- och β-zearalenol. Det beskrivna protokollet är endast en grund för att utforma analyser. Testmetoden kan varieras beroende på testslutpunkterna och proverna. Dessutom kan det kombineras med andra analysmetoder, vilket underlättar den framtida användningen av den transgena linjen.
Introduction
Det finns ett betydande antal hormonstörande föreningar (EDC) som är bland de farligaste ämnena i vår miljö. Dessa är främst östrogena föreningar som förorenar vatten från naturresurser. Den kemiska mångfalden av de ämnen som tillhör gruppen gör det svårt att testa deras närvaro, eftersom det krävs olika analysmetoder för att de ska kunna upptäckas. Baserat på deras kemiska struktur är det mycket svårt att avgöra om ett ämne faktiskt kan fungera som ett östrogen. Dessutom förekommer dessa ämnen aldrig i ren form i miljön, så deras effekter kan påverkas av andra föreningar, för1. Detta problem kan lösas genom effekt-upptäcka metoder, såsom användning av biomonitor/ bioindicator organismer som visar östrogena effekter2,3,4,5.
Nyligen, en mängd celllinje6 och jäst-baserade testsystem2,3 har utvecklats för att upptäcka östrogena effekter. Emellertid, dessa är i allmänhet endast kunna upptäcka bindning av ämnet till östrogenreceptorn2,3. Dessutom kan de inte modellera komplexa fysiologiska processer i organismen, eller att upptäcka hormonkänsliga faser av livsstadier; därför leder de ofta till falska resultat.
Det är känt att vissa gener reagerar känsligt på östrogen i levande organismer7. Detektion av genprodukter genom molekylärbiologiska metoder är också möjligt på protein- eller mRNA-nivå8,9, men innebär vanligtvis djuroffer. Djurskyddslagar har blivit strängare, och det finns en växande efterfrågan på alternativa testsystem som minimerar antalet och lidandet hos djur som används i experiment eller ersätter djurmodellen med ett annat modellsystem10. Med upptäckten av fluorescerande proteiner och skapandet av biomarkörlinjer ger transgen teknik ett bra alternativ11. Med dessa linjer, aktivering av en östrogen-känslig gen kan testas in vivo.
Bland ryggradsdjur är fiskens potential i miljöriskbedömningen enastående. De erbjuder många fördelar jämfört med däggdjursmodeller: att vara vattenlevande organismer, de kan absorbera föroreningar genom hela kroppen, producera ett stort antal avkommor, och några av deras arter kännetecknas av kort generationstid. Deras endokrina system och fysiologiska processer visar stora likheter med andra ryggradsdjur och även med däggdjur, inklusive människor12.
Flera gener för att upptäcka östrogena effekter hos fisk är också kända. De viktigaste är östrogenreceptorerna aromatas-b, choriogenin-H och vitellogenin (vtg)7,13. Nyligen har flera östrogenproducerande biosensorlinjer också skapats från fiskmodeller som används i laboratoriet, till exempel från zebrafiskar (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Den största fördelen med zebrafiskar i att skapa biosensor linjer är den genomskinliga kroppen av embryon och larver, eftersom fluorescerande reporter signal kan sedan lätt studeras in vivo utan att offra djuret10. Förutom djurskydd är det också en värdefull funktion eftersom det gör det möjligt att studera reaktionen hos samma individ vid olika tidpunkter av behandlingen18.
Dessa experiment använder en vitellogenin reporter transgena zebrafisk linje15. Transgenen konstruktion som används för utveckling av Tg (vtg1:mCherry) har en lång (3,4 kbp) naturlig vitellogenin-1 promotor. Östrogenreceptorn (ER) är ett förstärkare protein som aktiveras av ligander som är en representant för steroid/nukleära receptorn superfamilj. ER binder till specifika DNA-sekvenser som kallas östrogen svarselement (EREs) med hög affinitet och transaktiverar genuttryck som svar på östradiol och andra östrogena ämnen, så ju mer ERE i promotorn orsakar ett starkare svar19. Det finns 17 ERE platser i promotorn regionen Tg (vtg1:mCherry) transgen konstruktion och de förväntas efterlikna uttrycket av den infödda vtggenen 15. Det finns ett kontinuerligt uttryck för fluorescerande signal hos sexuellt mognade kvinnor. Hos män och embryon syns dock uttrycket i levern endast vid behandling med östrogena ämnen (figur 1).
Figur 1: Röd fluorescerande signal i levern av vtg1:mRenasgen vuxen zebrafisk och 5 dpf embryon, efter 17-ß-estradiol (E2) induktion. Hos hona och hos hanar som behandlats med E2 (25 μg/L exponeringstid:48 timmar) syns stark fluorescens i levern även genom den pigmenterade huden. Ingen lysrörssignal syns hos obehandlad hane (A). Efter E2 induktion (50 μg/L exponeringstid: 0-120 hpf) kan en röd fluorescerande signal i levern på 5 dpf-embryon också observeras, vilket inte syns i kontrollembryon (B). Medan fluorescerande signal är kontinuerligt närvarande hos vuxna kvinnor, främst män och embryon i linjen är lämpliga för att upptäcka östrogena effekter. (BF: ljust fält, mCherry: röd lysrörsfiltervy, enkla vanliga bilder, Skalfält A: 5mm, skalstång B: 250 μm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I likhet med den endogena vitellogenin uttrycks mCherry-reportern endast i levern. Eftersom vitellogenin endast produceras i närvaro av östrogen, det finns ingen fluorescerande signal i kontrollerna. Eftersom uttrycket är bara i levern, utvärderingen av resultaten är mycket lättare15.
Känsligheten och användbarheten hos denna linjes embryon har undersökts på olika östrogena föreningsblandningar och även på miljöprover15,,20,och i de flesta fall dokumenterades dos-responsförhållanden (figur 2). När det gäller mycket giftiga, huvudsakligen hepatotoxiska, ämnen (t.ex. iver) får dock endast en mycket svag lysrörssignal vara synlig i levern hos behandlade embryon och den maximala lysrörssignal som orsakas kan uppnås inom ett mycket litet koncentrationsområde, vilket gör det svårt att fastställa doseffektförhållanden20.
Figur 2: Dosresponsdiagram (A) och fluorescerande bilder (mCherry) i levern (B) som utsätts för 17-α-ethynilestradiol (EE2), i 5 dpf vtg1:mCherry larver. Resultaten uttrycks som integrerad densitet som genereras från signalstyrkan och storleken på det drabbade området (±SEM, n = 60). 100% avser det observerade maximivärdet. Fluorescerande signalintensitet ökade gradvis med koncentration. Skala bar = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det finns flera östrogena ämnen som finns i miljön, såsom 17–β-estradiol (miljökoncentration: 0,1–5,1 ng/L)21,17–α-etynylestradiol (miljökoncentration: 0,16–0,2 μg/L)22, iveradon (miljökoncentration: 0,095–0,22 μg/L)23, bisfenol-A (miljökoncentration: 0,45–17,2 mg/L)24. Vid testning av dessa ämnen i ren aktiv form med hjälp av mCherry-transgena embryon var de lägsta koncentrationerna av observerade effekter (LOEC) för fluorescerande teckendetektering 100 ng/L för 17-ß-estradiol. 1 ng/L för 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L för iardon och 1 mg/L för bisfenol-A (behandling med 96–120 hpf), som ligger mycket nära eller inom intervallet för miljökoncentrationerna av ämnena15. Den Tg (vtg1:mCherry) transgen linje kan hjälpa till att upptäcka östrogenitet i avloppsvatten prover efter direkt exponering. Linjen är lika känslig som den vanliga jäst östrogen test, den bioluminiscent jäst östrogen (BLYES) analys15. Med hjälp av denna linje har de skyddande effekterna av beta-cyklodextriner mot iaralenoninducerad toxicitet bekräftats med hjälp av kemiska blandningar20.
I en färsk rapport demonstrerades in vivo-användningen av den transgena linjen med hjälp av två östrogena zearalenon (ZEA) metaboliter, α- och β-zearalenol (α-ZOL och β-ZOL)25. Protokollet baslinjen är lämplig att studera de östrogena effekterna av flera föreningar eller miljöprover på Tg (vtg1:mCherry) embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurprotokollet godkändes enligt den ungerska djurskyddslagen och alla studier slutfördes innan de behandlade individerna skulle ha nått det fria utfodringsstadiet.
1. Embryoskörd och behandling
- Håll zebrafiskar med 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, ledningsförmåga mellan 525 ± 50 μS/m, syrenivå ≥80 % mättnad och 14 timmar ljus och 10 timmar mörk cykel.
- Fyll parningstankarna med systemvatten och sätt upp fisken för parning på eftermiddagen innan du skördar ägg.
- Placera hane och kvinnlig fisk i tanken och separera dem med hjälp av en avdelare.
- Ta bort avdelaren från tankarna när lampan tänds nästa morgon. Kontrollera parningstankarna efter ägg var 15–20:e minut.
- Skörda alla embryon med hjälp av en tesil eller tätt vävda finmaskor och kombinera dem i en stor petriskål med E3-buffert (5 mM natriumklorid, 0,17 mM kaliumklorid, 0,33 mM kalciumklorid, 0,33 mM magnesiumsulfat) eller klart systemvatten.
- Placera embryona i inkubatorn inställd på 25,5 ± 0,5 °C.
- Efter 1–1,5 h, ta bort och kassera obefruktade eller otillräckligt dela ägg med en plast överföring pipet under ett dissekerande mikroskop.
OBS: Obefruktade ägg är ogenomskinliga; befruktade ägg är transparenta. För att starta behandlingen i ett senare utvecklingsstadium, var uppmärksam på den normala utvecklingen hos de individer som behandlas. - Placera de utvalda embryona i behandlingskärlen (t.ex. i petriskålar eller vävnadsodlingsplattor) som redan har märkts och fyllts med olika koncentrationer av testämnet.
- Inkubera embryona vid 25,5 ± 0,5 °C fram till slutet av försöket.
OBS: Embryon kan reagera med betydande individuell känslighet för olika östrogena föreningar, så det rekommenderas att använda minst 15 embryon i minst tre upprepade behandlingar för att utvärdera experimentet ordentligt. Vid val av behållare, tänk på att utvecklingen av ett embryo kräver minst 200 μl vatten26. I detta experiment inkuberades embryona till 120 hkf vid 25,5 ± 0,5 °C. - Uppdatera testlösningen om det är nödvändigt att bibehålla behandlingskoncentrationen. Var försiktig när du ändrar testlösningen för att undvika att embryona skadas.
OBS: Det är också möjligt att undersöka dödlighet eller subletala symtom under experimentet. De koncentrationer som används bör förbli så stabila som möjligt för att uppnå tillförlitliga resultat. Detta kan enkelt uppnås genom att uppdatera testlösningarna. Frekvensen av uppfriskande kan variera beroende på testämnet. Det är därför lämpligt att kontrollera testämnets koncentration genom analytiska mätningar för att bestämma frekvensen av lösningsuppdateringarna.
2. Larver förberedelse för fotografering
- Förbered 4% metylcellulosa med MS-222 (tricaine-metan-sulfonat) i förväg.
- För att göra detta, tillsätt 4 mg/ml MS-222 till 100 ml dubbeldestillerat vatten till en slutlig koncentration på 0,168 mg/ml och föra lösningen till 4 °C. Tillsätt sedan 4 g metylcellulosa. Rör om med en magnetisk omrörare och lämna den sedan i 4 °C över natten.
- Nästa dag, rör om igen och lösningen ska vara klar att använda. Om metylcellulosan inte är helt upplöst, sätt tillbaka den vid 4 °C och vänta några timmar till.
- Placera 5 dagar gamla larver i en 5 cm petriskål per behandlingsgrupp med en Pasteur pipett.
- Ta bort behandlingslösningen från larverna med en plastpipett och fyll sedan petriskålen med 2 ml 0,02% MS-222 anestesilösning.
ANestesi är vanligtvis effektivt på mindre än en minut. Larverna sövs om de inte simmar bort som svar på beröring. En överdos av MS-222 kan döda larverna. - Fyll varje kvadrat i en specialdesignad 10 cm petriskål med 4 % metylcellulosa med MS-222 (figur 3).
OBS: Limma två 1,5 x 1,5 cm fyrkantiga områden längst ner i petriskålen med hjälp av plastskivor (1 mm höjd, 5 mm breda). Tjugo larver kan placeras bredvid varandra i en fyrkant. Istället för en specialdesignad petriskål kan en annan låg kantbehållare användas för att fastställa embryonas position.
Figur 3: En 10 cm petriskål med limmad 1,5 x 1,5 cm bred, 1 mm tjocka plastlakansrutor för larverberedning för fotografering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Överför de sövda larverna till metylcellulosa med lite vatten i en av de två rutorna. Från den första torget överför larverna till det andra torget.
OBS: Med hjälp av denna överföring kommer de 4% metylcellulosa som används för fotografering inte att spädas ut och larverna kommer inte att rotera under avbildning. - I den andra torget, rotera och orientera larver till vänster sida och tryck försiktigt ner dem till botten av cellulosa med en mikroloader pipett spets skär upp till 2 cm.
OBS: Använd inte andra pipettspetsar eftersom de orsakar skador på larverna.
3. Mikroskopi
OBS: Fotografering dödar inte djuren. Djur kan väckas genom att ta bort dem från metylcellulosa och placera dem i sötvatten eller behandlingslösning, så att samma individ kan undersökas flera gånger under behandlingen.
- För att utvärdera signalen från den uttryckta reportern, bild embryon med samma uppfattning och inställningar.
OBS: Se steg 2.6 för optimal embryopositionering. Bilderna i manuskriptet togs under de beskrivna förhållandena. Ljust fält: 60x förstoring, 6 ms utläggning, Iris 100%, Gain:1.1, fluorescensbilder: 60x förstoring, 300 ms utläggning, Iris: 100%, Gain:1, mCherry filter, fluorescerande ljuskälla: kvicksilvermetallhalogenlampa. För foto tar en fluorescerande stereomikroskop, dedikerad kamera och programvara för mikroskop användes. - Placera petriskålen på mikroskopets scen.
- Fokusera på levern av embryot och fånga en ljus fältbild med hjälp av tillhörande programvara.
- Växla mikroskopet till mCherry-filtret och ta en fluorescerande bild av levern under lysrör med hjälp av tillhörande programvara.
OBS: Utför alla fluorescenssteg i mörker. Ändra inte förstoringen, fokus eller embryots position mellan att fånga det ljusa fältet och de fluorescerande bilderna, eftersom detta kommer att bidra till analysen av bilderna. - Upprepa steg 3.3 och 3.4 tills alla embryon i experimentet har avbildats.
4. Fastställande av integrerad densitet
OBS: En av de bästa indikatorerna för att jämföra fluorescerande signalstyrka är det integrerade densitetsvärdet (dvs. produkten av området och det genomsnittliga gråvärdet). Ett av de enklaste sätten att bestämma integrerad densitet är att använda ImageJ-programmet27. Programmet finns på internet och kan installeras på datorn.
- Öppna ImageJ och ladda sedan upp den fluorescerande bilden som ska analyseras genom att antingen dra och släppa bilden eller klicka på Arkiv| Öppna.
- Klicka på Bild| Färg| Dela kanaler för att dela bilden som gjorts av lysrörsfiltret enligt RGB-färgdiagrammet.
- Arbeta med det röda kanalbildsspektrumet, stäng de andra kanalerna.
- Ange ett liknande storlek elliptisk område i bilden så att falska signaler inte stör utvärderingen. Använd ovala verktyg, rita en ellips över det markerade leverområdet så exakt som möjligt.
- Om signalen är svag använd ljusmikroskopibilder (dvs. det ljusa fältparet på den fluorescerande bilden) för att bestämma var levern befinner sig.
- Klicka på Analysera| Mät för att bestämma signalstyrkan och storleken på det drabbade området. Det integrerade densitetsvärdet beräknas automatiskt av programvaran (IntDen-kolumnen i diagrammet).
- Fortsätt analysen genom att upprepa steg 4.1–4.6 tills alla fluorescerande bilder av alla embryon i behandlingsgruppen analyseras.
- Spara data och analysera sedan de integrerade densitetsvärdena.
Obs! Storleken på det område som ska analyseras beror på förstoring, bildupplösning, andra inställningar för fotografering, etc. Analysen kan påskyndas eller göras mer exakt med hjälp av personliga makron för analys. Makron kan till exempel användas för att säkerställa att det valda området alltid är detsamma i de undersökta bilderna. Detaljerade beskrivningar för att skapa makron som gör det möjligt att göra den bästa bildanalysen enligt vissa fotoinställningar finns på ImageJ:s webbplats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I experimentet presenteras i detta manuskript, effekterna av två östrogena ämnen testades vid fem koncentrationer börjar vid befruktning i 5 dagar på Tg (vtg1:mCherry) zebrafisk embryon. Vi undersökte om fluorescerande signaler dök upp i levern av fisk i slutet av exponeringstiden på grund av ämnena och om det fanns skillnader i östrogenitet av de två ämnena. Resultaten utvärderades på grundval av fluorescerande bilder och integrerade densitetsvärden. I allmänhet, båda ämnena inducerade uttryck av transgenen i slutet av exponeringstiden vid de testkoncentrationer vid vilka individer överlevde. När det gäller obehandlad kontroll fisk, ingen fluorescerande signal var synlig.
När det gäller α-ZOL dog alla individer vid den högsta testkoncentrationen (8 μM), så i detta fall kunde lysrörssignalen inte undersökas. Vid lägre koncentrationer (0,5 μM–4 μM) observerades en stark fluorescerande signal i embryonas lever (figur 4A). Ingen signifikant skillnad observerades i fluorescensintensiteten och storleken på fluorescerande områden (p < 0,05). De integrerade densitetsvärdena α-ZOL (figur 4C) visar att ämnet inducerade uppkomsten av en fluorescerande signal. Ingen signifikant skillnad konstaterades mellan de integrerade densitetsvärdena och mellan behandlingarna (p < 0,05). Den genomsnittliga integrerade densiteten varierade mellan 31,26 ± 13,95 (0,5 μM) och 34,25 ± 15,36 (4 μM).
Ingen dödlighet dokumenterades under behandlingen med β-ZOL och ämnet inducerade transgenaktivitet vid alla behandlingskoncentrationer. Fluorescensintensiteten och lysrörsområdets storlek ökade i takt med att koncentrationen ökade, vilket framgår av fluorescerande bilder (figur 4B). Om man jämför fluorescerande bilder av α- och β-ZOL visuellt var både signalstyrkan och storleken på det fluorescerande området synbart svagare för β-ZOL vid samma behandlingskoncentrationer av de två ämnena. Studera de integrerade värdena för β-ZOL (figur 4D), den genomsnittliga integrerade densiteten värde nästan fördubblats mellan de lägsta och högsta behandling koncentrationer. När det gäller β-ZOL fanns det dock ingen signifikant skillnad mellan de integrerade densitetsvärdena för de enskilda koncentrationerna (p & 0,05). Den genomsnittliga integrerade densiteten varierade mellan 15,86 ± 4,08 (0,5 μM) och 21,73 ± 5,94 (8 μM).
Figur 4: Presentation av integrerade densitetsvärden som härrör från intensiteten av fluorescerande signaler i levern och från storleken på det drabbade området som orsakas av α- och β-zearalenolbehandling på 5 dagar gamla Tg(vtg1:mCherry) transgena zebrafiskembryon. I experimentet behandlades östrogenkänsliga embryon från biomarkör zebrafisklinjen (20 larver per grupper i tre replikat i varje behandlingskoncentration) med 0,5 μM–8 μM-koncentrationer av α- och β-ZOL från befruktning och framåt i 5 dagar. Bilder av fisklever för α-ZOL (A) och β-ZOL (B) visar tydligt att ämnena inducerade lysrörets utseende. Integrerade densitetsdata presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD = felstång). Data analyserades med deterativa Grubbs för identifiera avvikare, som uteslöts. Data kontrollerades för normalitet med Shapiro-Wilk normalitetstest och överensstämmelse med kraven för parametriska metoder fastställdes. Statistiska analyser utfördes med hjälp av en enkelriktad ANOVA följde ett Dunnetts test. Studera de integrerade densitetsvärdena, ingen signifikant skillnad hittades mellan behandlingarna i fall av α-ZOL (C) och β-ZOL (D) (p < 0,05). Skalbar = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Genom att undersöka de integrerade densitetsvärden som erhållits från samma behandlingskoncentrationer av de två ämnena (figur 5) presenterade α-ZOL medelvärden med högre integrerad densitet i varje enskilt fall i förhållande till β-ZOL, vilket är förenligt med skillnaderna mellan signalstyrkor som observerats i de fluorescerande bilderna. När det gäller alla behandlingskoncentrationer hittades signifikanta skillnader (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; och 4 μM, p = 0,0325).
Figur 5: Jämförelse av α- och β-zearalenol-värden för integrerad densitet. Integrerade densitetsdata presenteras som medelvärde ± standardavvikelse SD = felstång. Data analyserades med iterativa Grubbs för att identifiera extremvärden, som uteslöts. Data kontrollerades för normalitet med Shapiro-Wilk normalitetstest och överensstämmelse med kraven för parametriska metoder fastställdes. Betydande skillnader kontrollerades vid obetalt t-test mellan α-ZOL och β-ZOL för varje koncentration (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329 och 4 μM, p = 0,0325). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av biomonitorer/bioindikatorer för östrogena effekter har spridit sig i toxikologiska studier. In vivo-modeller spelar en enastående roll, eftersom de till skillnad från in vitro-tester inte bara ger information om svaret från en cell eller en receptor, utan också möjliggör undersökning av komplexa processer i organismen. Flera transgena linjer för att studera östrogena effekter har framställts från zebrafisk, varav en Tg(vtg1:mCherry) användes för dessa studier. Den metod som beskrivs här illustrerar ett protokoll för testning av embryon av denna linje för att upptäcka östrogen aktivitet in vivo i rena, aktiva ingredienser.
Män och embryon av linjen är också lämpliga för att upptäcka östrogena effekter, men embryon har flera fördelar som främjar deras användbarhet. I synnerhet är kroppen transparent, så den fluorescerande signalen i levern kan lätt observeras. Zebrafisklever börjar utvecklas 6 timmar efter befruktning (6 hpf) och börjar arbeta efter 50 timmar (50 hpf). Först bildas den vänstra loben i levern, och vid 96 timmar (96 hpf) visas också den högra loben i levern. Den slutliga formen av levern utvecklas av runt dag 5 (120 hpf)28,29. Levern kan producera endogena vitellogenin från 2-3 års ålder av ett embryo14, vilket sammanfaller med utseendet på fluorescerande signalen i Tg(vtg1:mCherry) linje15. Vid utformningen av experiment bör det därför beaktas att en fluorescerande signal endast kan förväntas i embryolevern från den tiden. Levern hos de 5 dagar gamla embryona är redan väldefinierad i ett relativt stort område, där lysrörssignalen lätt kan detekteras under ett stereomikroskop. Detta gör det möjligt att utveckla testprotokoll som inte omfattas av djurskyddslagar. Vitellogenin, och på samma sätt fluorescerande protein, produceras av den vänstra loben av embryona lever15. Därför är embryonas rumsliga orientering viktig för att upptäcka den starkaste signalen när man undersöker lysrörssignalen eller fotograferar. Det är därför embryon lades till vänster i protokollet. Som framgår av de representativa resultaten, den östrogena effekten av ett testprov är tydligt indikeras av fluorescerande signal i levern, så resultaten kan utvärderas visuellt också. Om kvantifieringen av resultaten behövs är det integrerade densitetsvärdet som definieras av ImageJ-programmet lämpligt. För korrekt utvärdering är det dock nödvändigt att bilder tas med samma inställningar under experimentet, och att storleken på de markerade fluorescerande områdena är densamma i varje bild. Tillsammans med den exakta placeringen av embryona är dessa de mest kritiska stegen i protokollet. Det är viktigt att nämna att när det gäller embryon visar transgens uttryck, på samma sätt som produktionen av endogenous vitellogenin, en stor spridning och skillnader i individuell känslighet. I vissa fall kan detta orsaka stora variationer i resultaten, vilket bör beaktas vid utformningen av experimenten.
En viktig aspekt vid bestämning av behandlingskoncentrationer är att cellerna i embryona, och därmed levercellerna, kan skadas av höga koncentrationer av mycket giftiga ämnen, vilket kan leda till en nedgång i vitellogeninininduktion. Därför bör tester utföras vid koncentrationer under LC1015.
Att jämföra känsligheten hos östrogenkänsliga fisklinjer mot varandra är en svår uppgift, eftersom de linjer som beskrivits hittills har testats enligt olika protokoll5,14,15,16. Den linje som testas i detta protokoll kan upptäcka dos-effekt relationer i fall av rena aktiva ingredienser, blandningar och miljöprover, och de erhållna resultaten korrelerade väl med resultat med BLYES tester och HeLa celler15,20.
Nyttan av embryona på linjen för testmedel har bevisats, inklusive iaralenon15. I detta arbete testades två metaboliter av toxinet, α- och β-zearalenol. Enligt litteraturdata är α-ZOL giftigare än β-ZOL30 och dess östrogenitet är också högre31. Dessa resultat bekräftas av våra studier. Således, studier på embryon av linjen är också lämpliga för att jämföra de östrogena effekterna av andra östrogena ämnen.
Mykotoxinkontaminering i livsmedelskedjan är ett globalt problem, så flera förfaranden har förbättrats för att minska mykotoxinnivåerna i djurfoder och livsmedel25,32. En av de mest lovande lösningarna är mykotoxin biologisk nedbrytning av mikroorganismer eller av deras enzymer. Det kan vara en viktig postharvest metod för att minska eller eliminera mykotoxin dekontaminering. ZEA förnedrande förmåga många bakteriestammar har testats i litteraturen hittills, men nya forskningsresultat som visar hög nedbrytning av toxinet anger sällan den negativa effekten av metaboliter33. Eftersom embryona i denna linje är teoretiskt lämpliga för att testa de östrogena effekterna av prover med organiskt material innehåll15, ett behandlingsprotokoll kan utvecklas som kan hjälpa till att testa de biologiska nedbrytningsprodukterna av ZEA och kvalificeringen av de förnedrande stammarna.
Detta protokoll kan ändras på många sätt beroende på de planerade testslutpunkterna (t.ex. exponeringsdebut och längd) och till de prover (t.ex. blandningar eller miljöprover) som kommer att testas och som kan kompletteras med andra testmetoder (t.ex. molekylära metoder). Således hoppas vi att användningen av Tg (vtg1:mCherry) linje kommer att bli en modell av östrogenitet tester och för standard testmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Research, Development and Innovation Office (NKFIH) från National Research, Development and Innovation Fund (NKFIA); Bidragsavtal: projektet NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 som medfinansieras av Europeiska unionen och det tematiska excellence-programmet NKFIH-831-10/2019 vid Szent István University, som delas ut av ministeriet för teknik för innovation och innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
