Summary
고속 모세관 유동 이미지 시퀀스에서 미세 혈관 흐름을 정량화하기 위해 STAFF(필드와이즈 흐름의 공간 시간 분석) 소프트웨어를 개발했습니다. 전체 이미지 필드와 시간이 지남에 따라 STAFF는 유속을 평가하고 정량분석을 위한 시각화 및 표 출력을 위해 색상으로 구분된 공간 맵 시퀀스를 생성합니다.
Abstract
혈액 흐름 속도 및 분포의 변화는 다양한 세포 요구에 반응하여 조직 및 장기 관류를 유지하는 데 필수적입니다. 또한, 미세 순환에 결함의 출현은 여러 병리의 발달의 주요 지표가 될 수 있습니다. 광학 화상 진찰에 있는 어드밴스는 살아있는 동물에 있는 세포와 sub cellular 수준에 있는 화상 진찰을 시간이 지남에 따라 고속으로 허용하는 실제적인 접근 (IVM) intravital 현미경 검사법 (IVM)를 만들었습니다. 그러나, 모세관 흐름에 있는 적당한 조직 관류, 공간 및 시간적인 가변성을 유지하는 중요성에도 불구하고 거의 문서화되지 않습니다. 표준 접근법에서는 제한된 시간 동안 이미징을 위해 소수의 모세관 세그먼트가 선택됩니다. Pii 의 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어용 매크로인 필드와이즈 플로우(STAFF)의 공간 시간적 분석을 편견 없는 방식으로 모세관 흐름을 포괄적으로 정량화했습니다. STAFF는 모세 혈관 내혈흐름의 전체 필드가 있는 고속 이미지 시퀀스를 사용하여 모든 혈관 세그먼트에 대해 시간 간격마다 kymographs라고 하는 움직임을 나타내는 이미지를 생성합니다. kymographs에서 STAFF는 적혈구가 시간이 지남에 따라 이동하는 거리에서 속도를 계산하고 정량 분석을위한 시각화 및 표 출력을위한 색상 코드 공간지도의 시퀀스로 속도 데이터를 출력합니다. 일반적인 마우스 간에서 STAFF는 소엽 내의 pericentral 및 periportal 영역 사이의 유속의 심오한 차이를 정량화분석합니다. 더 예기치 않은 것은 나란히 있는 정현파와 몇 초에 걸쳐 개별 혈관 세그먼트 내에서 보이는 변동 사이의 유속의 차이입니다. STAFF는 모세관 흐름의 복잡한 시공간 역학을 측정하여 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 강력한 새로운 도구입니다.
Introduction
미세 혈관 구조는 생리학에서 중요한 역할을하며 변화하는 조건하에서 조직의 효과적인 관류를 보장합니다. 미세혈관 기능 장애는 장기 심혈관 이환율 및 사망률, 치매의 발병, 간 및 신장 모두의 질병 등 무수한 조건과 연관되어 있으며, 따라서 광범위한 생체 의학 조사에서 관심의 핵심 요소인1,2,3,4,5. 여러 기술이 조직 관류를 평가하는 데 사용되었지만, 오직 분과 내 현미경 검사법만이 개별 모세혈관 수준에서 혈류를 특성화하는 데 필요한 시간적 및 공간 적 해상도에서 데이터 수집을 가능하게 합니다.
미세 혈관 흐름은 형광 현미경 검사법에서 형광 현미경 검사법에서 가시화 될 수 있습니다 또는 막 불과후형 형광 마커의 배경에 대한 적혈구의 움직임에 의해 (예를 들어, 형광 표지 dextran 또는 알부민)6,7. 현미경 혈관 흐름은 광시야 현미경 검사법을 사용하여 표면 세포 층에서, 또는 공초점 또는 다중 광자 현미경 검사법을 사용하여 깊이에서 심상할 수 있습니다. 그러나 모세관 유량은 적혈구의 통과가 일반적으로 60 프레임 / s 미만의 속도로 캡처 할 수 없도록합니다. 대부분의 레이저 스캐닝 공초점 및 다광자 현미경은 전체 이미지 필드를 스캔하기 위해 1-5s가 필요하기 때문에 이 속도는 일반적으로 시야를 제한하고 때로는 단일 스캔 라인8로만수행할 수 있습니다. 선택된 모세관 세그먼트(1)로 측정을 제한하는 과정은 선택 편향을 도입할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 (2) 모세관 혈류의 속도에서 공간및 시간적 이질성을 포착하는 것을 불가능하게 합니다. 이와 대조적으로, 모세관 네트워크의 이미지는 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라가 장착 된 광시야 디지털 현미경을 사용하여 100 fps를 초과하는 속도로 수집 할 수 있습니다9,10. 일반적인 생물 의학 실험실에서 흔히 볼 수 있는 이러한 저렴한 시스템은 본질적으로 지속적으로 전체 2차원 네트워크를 가로질러 미세 혈관 흐름을 이미지화할 수 있게 합니다. 문제는 고속 비디오 현미경 검사법에 의해 생성 된 거대하고 복잡한 이미지 데이터 세트에서 의미있는 정량적 데이터를 추출 할 수있는 분석 접근 방식을 찾는 중 하나가됩니다.
전체 필드 유동 데이터의 분석을 가능하게 하기 위해 고속으로 수집된 이미지 계열의 전체 현미경 필드에 걸쳐 미세 혈관 흐름을 지속적으로 측정할 수 있는 새로운 이미지 분석 소프트웨어인STAFF를 개발했습니다. 이 접근법은 다양한 다양한 실험 시스템 및 이미징 방식과 호환되며 STAFF 이미지 분석 소프트웨어는 ImageJ12의FIJI 구현을 위한 매크로 도구 세트로 구현됩니다. 미세 혈관 흐름을 시각화하기 위해 여기에 사용되는 기본 원리는 먼저, 일부 대비가 모세 혈관 내에서 적혈구를 이미지 할 수 있도록 제공되어야한다는 것입니다. 우리의 연구 결과에서, 대조는 적혈구에 의해 제외되는 대량 형광 탐사선에 의해 제공됩니다. 그런 다음 살아있는동물8로부터고속으로 수집된 이미지에서 형광표지된 플라즈마 내에서 음성 얼룩으로 나타나는 적혈구의 변위로부터 유동속도를 정량화할 수 있다. 그런 다음 STAFF를 사용하여 kymographs라는 여러 간격에 걸쳐 각 모세관 세그먼트를 따라 거리 플롯을 만들고 kymographs13에있는 경사를 감지하고 이러한 경사면에서 미세 혈관 흐름의 속도를 계산합니다. 접근은 화상 진찰을 위해 접근할 수 있는 어떤 모세관 침대에서 집합된 심상에 적용될 수 있습니다. 여기에서 우리는 간에서 혈류의 연구에 IVM과 STAFF의 적용을 기술합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 인디애나 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 승인 및 수행되었으며 동물의 관리 및 사용을 위한 NRC 가이드를 준수했습니다.
1. 생명 내 현미경 검사법에 대한 외과 준비
참고: 이것은 생존 수술이 아닙니다. 섹션 1 "분내 현미경 검사법에 대한 외과 적 준비"가 시작되면 섹션 2 "인트라 바이탈 현미경 검사법"이 완료 될 때까지 작업을 일시 중지 할 수 없습니다.
- 적응 9-10 주 오래 된 남성 C57BL/6 쥐, 적어도 대 한 4 일 및 빠른 16 연구 전에 시간.
- 동물의 무게를 측정하고 5 % 이소플루란으로 진정시키고 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 놓습니다. 1-2 L/min의 산소 유량을 사용하고 1-2%의 이소플루란으로 신분을 유지하십시오. 발가락 핀치로 반사 신경을 확인합니다. 직장 온도계를 사용하여 온도를 모니터링합니다. 심박수와 호흡을 시각적으로 모니터링합니다.
- 마취가 안정되면 경정맥 배치 부위와 간 노출을 위해 흉곽 아래 영역을 면도하십시오.
-
경정맥 통조림의 경우, 마우스 턱 아래 1~2cm 의 좌측 복부 절개를 합니다. 경정맥을 둘러싼 모든 지방과 근막을 제거하십시오. 출혈을 방지하기 위해 06 봉합사 끈을 사용하여 경정맥의 앞쪽 끝을 묶습니다.
- 경정맥에 작은 닉을 만들고 캐뉼라 (30G x 1/2 in, 바늘), 바늘 홀더 및 폴리에틸렌 튜브 (0.011 x 0.024 인치2 루어 스텁 어댑터에 부착하고 0.9 % 식염수로 채워진)를 약 1cm에 밀어 넣은 후 0-6 개의 현을 사용하여 경수의 후방 끝에 고정하십시오.
- 경정맥 캐뉼라를 사용하여 70 kDa 플루오레세인 덱스렌을 전달합니다 (식염수에 9 mg/mL 용액의 0.1 mL 주입을 통해 30 mg/ kg의 용량으로).
- 흉곽의 중간 아래 몸통을 가로 질러 4-6cm 절개를 함으로써 이미징을 위해 간을 노출하십시오.
- 젖은 (0.9% 식염수에 담근) 2 x 2 인치2 거즈 스폰지를 왼쪽 측측 엽 아래에 놓습니다. 40mm 커버 슬립 바닥 접시의 유리 창 주변에 테이프를 놓고 테이프에 시아노아크릴레이트 접착제를 바친다. 유리 판을 간으로 누르고 면 팁 어플리케이터를 사용하여 거즈를 테이프의 접착제에 눌러 현미경 검사법 조직의 움직임을 최소화합니다.
- 동물을 현미경 단계로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 움직인 커버슬립 바닥 접시에 멸균 0.9% 식염수를 추가하여 이미징 세션 내내 간을 촉촉하게 유지합니다. 무대에 장착 된 가열 패드, 동물 위에 배치 된 가열 패드 및 객관적인 히터를 통해 36-37 °C의 온도를 유지하십시오.
2. 활력 내 현미경 검사법
- 고속 이미지 캡처가 가능한 비디오 카메라가 장착된 반전 된 epifluorescence 현미경으로 intravital 현미경 검사를 수행합니다.
참고: 여기서, 제논 아크 램프, 플루오레세인 특이적 여기(480-500 nm) 및 방출(507-543 nm) 필터, 플랜 플루어 20x, N.A. 0.75 수분 침지 목표 및 고속 sCMOS 카메라가 사용되었다. - 최소한의 조명을 사용하여 모세관 혈류 분석을 위한 관심 영역을 선택합니다.
- 카메라가 100fps를 획득할 수 있을 만큼 노출 시간을 충분히 짧게 설정합니다. 형광 프로브의 광독성 및 광표백을 피하면서 적혈구 그림자와 혈관 의 토폴로지를 명확하게 시각화하도록 조명 수준을 설정합니다.
- 100fps의 속도로 이미지를 수집합니다. 카메라 픽셀 해상도를 ~0.65 ~ ~1.3 μm/픽셀 사이로 설정합니다. 프레임 크기를 512 x 512에서 1024 x 1024 픽셀 사이로 설정합니다. 비트 깊이를 8~16비트로 설정합니다. 시스템에서 100fps 이미지 수집을 허용하는 최고 해상도, 프레임 크기 및 비트 깊이를 사용합니다.
- 피지의 Bio-Formats14가 네이티브 포맷 파일을 열 수 있는 경우 TIF 파일의 시퀀스 또는 기본 카메라/현미경 형식으로 타임 시리즈 파일을 저장합니다.
- 시간에 따라 여러 영역을 이미지화합니다. 최대 2 시간 동안 현미경 단계에서 마우스를 유지.
참고: 시간시리즈의 지속 기간은 조직의 생존 가능성에 영향을 미치지 않는 동안 가변성을 포용하는 시간 간격동안 이미지에 대한 필요성의 균형을 기반으로 합니다. 시간계의 기간은 파일 크기 고려 사항에 따라 지정될 수도 있습니다. 100fps에서 수집된 1024 x 1024 픽셀 16비트 이미지의 1분 의 타임시리즈는 12GB 크기의 파일을 생성합니다. 파일 크기 고려 사항은 사용된 프레임 크기와 비트 깊이를 지정할 수도 있습니다. STAFF 에는 명시적인 크기 제한이 없습니다.
3. FIJI에서 TrakEM2를 사용하여 혈관 네트워크 정의
참고: 3절의 어느 지점에서나 작업을 저장한 후 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
- https://imagej.net/Fiji/Downloads FIJI를 다운로드하여 설치합니다.
참고: 피지의 버전 1.51n이 프로젝트에 사용되었으며, https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip 다운로드 할 수 있습니다. Windows에서는 프로그램 파일이 아닌 사용자 공간에 FIJI를 설치해야 합니다. - 파일 > 열기 또는 파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스를사용 하 여 피지에서 동영상 파일을 엽니다. 혈관 네트워크의 토폴로지가 쉽게 볼 수 있는 호흡 사이의 안정적인 이미지에서 단일 이미지를 선택합니다. 이미지 > 스택이 아닌 선택한 단일 이미지를 복제하고 복제하고 이미지를 새 폴더에 저장합니다. 파일 또는 폴더 이름에 공백을 포함하지 마십시오.
- 파일 > 새로운 > TrakEM2 (빈)를선택하여 새 빈 TrakEM2 프로젝트를 설정합니다. 동영상의 단일 이미지가 포함된 새 폴더를 프로젝트 폴더로 선택합니다. TrakEM2 창이 열립니다.
- 기본 작업 영역에서 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 가져오기 및 가져오기 이미지를선택합니다. 3.3단계에 저장된 단일 이미지로 이동하여 선택합니다.
- 기본 작업 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 캔버스/레이어 집합 표시 > 자동 크기 조정 을선택합니다. 기본 작업 창에서 왼쪽 클릭합니다. 이미지가 작업 영역을 채웁니다.
- 이미지에서 혈관 네트워크가 포함된 영역을 선택하려면 TrakEM2에서 설정 영역 목록 선택을 합니다. 작은 TrakEM2 창 (템플릿, 프로젝트 객체, 레이어)에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 "• 아무것도". 새 하위 및 영역 목록 추가를 선택합니다.
- 작은 TrakEM2 창에서 "템플릿 > 아무것도"프로젝트 개체 > 프로젝트"에 드래그합니다. 그런 다음 드래그 "템플릿 > 아무것도 > • 영역 목록" 에 " 프로젝트객체 > 프로젝트 > 아무것도". 아래 "프로젝트 개체 > 프로젝트 > 아무것도", • 영역 목록이 표시됩니다.
- Z 공간 탭아래의 기본 TrakEM2 창에서 막대 레이블이 지정된 영역 목록이 만들어졌습니다. 클릭하여 선택합니다. 메인 TrakEM2 창에서도 페인트 브러시 도구를 선택합니다. Shift를 누르고 마우스 휠을 굴려 페인트 브러시에 적합한 크기(예: 혈관 구조의 직경보다 작은 크기)를 선택합니다. TrakEM2 설정을 저장하려면 제어 + S 키를 누릅니다.
- 페인트 브러시 도구를사용하여 혈관 네트워크를 페인트합니다. 페인트 브러시 도구를 사용하는 동안 Alt를 길게 누를 때 지웁을 지웁습니다. 초점이 다른 영역은 포함하지 마십시오. 컨트롤 + S.
- 혈관 네트워크의 레이블이 완료되면 기본 TrakEM2 창을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 내보내기 를 선택하고 지역 목록을 레이블(tif)으로 선택합니다. 팝업 창에서 배율을 100% 선택하고 모든 영역 목록을 내보내기를선택합니다. TrakEM2 창을 닫고 프로젝트 저장에대해 예를 선택합니다.
- 지역 목록의 이미지가 열리고 빈 검은색 이미지로 나타날 수 있습니다. 메인 피지 메뉴에서 이미지를 선택 > 조정 > 밝기 / 대비. B&C 창에서 자동 버튼을 누르면 영역 목록이 표시됩니다. 메인 피지 메뉴에서 이미지 > 조회 테이블 > 반전 LUT를선택합니다. 흰색 배경에 검은 색 레이블의이 이미지를 저장하고 이미지를 닫습니다.
- 피지에서 레이블 파일을 엽니다. 플러그인 > 스켈레톤 > 스켈레톤.을 선택합니다. 스켈레톤화된 이미지를 tif로 저장합니다. staff 흐름 분석을 실행하는 데 필요한 입력 파일 중 하나로 skeleton.tif 파일을 사용합니다. 파일을 저장할 때 파일 이름에 공백을 사용하지 마십시오.
- 예를 들어 혈관구조의 분기가 이미지 평면에서 나가기 때문에 캡처되지 않은 위치에 선 그리기에 간격(페인트 도구를사용하여)을 배치하여 필요에 따라 골격 파일을 수동으로 편집합니다.
4. 직원 분석을 위한 동영상 시퀀스 준비
- 파일 > 열기 또는 파일 > 가져오기 > 이미지 시퀀스를사용 하 여 피지에서 동영상 파일을 엽니다. 호흡 중을 제외하고 시간이 지남에 따라 조직 위치가 안정적으로 유지된 흐름 분석을 위해 이미지 시퀀스의 기간(초에서 분, 수백~ 수만 프레임일 수 있음)을 선택합니다.
- 시작 및 끝 프레임의 숫자를 입력하여 이미지 > 중복 및 시퀀스의 선택한 부분을 복제합니다. 이미지 > 속성에서 이미지 공간 및 시간 보정을 확인하고 필요한 경우 수정합니다. 이미지 파일을 TIF(또는 압축되지 않은 AVI)로 저장합니다. 이 movie.tif는 STAFF 분석을 실행하기 위해 입력 파일로 필요합니다. 파일 이름에 공백을 포함하지 마십시오.
5. 피지에 직원 매크로를 설치
참고 : (중요)FIJI 폴더 하위 디렉토리 내의 여러 폴더에는 유사한 파일 이름이 있으며 일부는 대문자로 지정되어 있지 않습니다. STAFF를 설치할 때 올바른 폴더가 선택되었는지 확인하십시오.
- https://github.com/icbm-iupui/STAFF STAFF 매크로를 다운로드합니다.
-
설치하려면 먼저 FIJI 폴더를 엽니다.
- Windows에서 FIJI가 사용자 공간에 설치되어 있는 폴더를 찾을 수 있습니다. MacOS에서 응용 프로그램 폴더에서 FIJI 아이콘을 찾으면 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 열기를선택합니다.
- FIJI 폴더에서 플러그인 폴더를 엽니다. 플러그인 폴더 내부에서 매크로 폴더를 엽니다. 이 매크로 폴더에 STAFF.ijm을 복사: 피지 \플러그인\매크로\STAFF.ijm.
- FIJI 폴더에서 플러그인 폴더를 엽니다. 이 플러그인 폴더에 STAFF_Dir.jar 복사: 피지\플러그인\STAFF_Dir.jar.
- FIJI 폴더에서 매크로 폴더를 엽니다. 이 매크로 폴더 내에서 자동 실행 폴더를 엽니다. 이 자동 실행 폴더에 STAFF_Loader.ijm 복사: 피지\매크로\자동 실행\STAFF_Loader.ijm.
- FIJI를 시작하고 매크로 설치를 확인합니다. 설치를 확인하려면 플러그인 > 매크로를 선택합니다. 드롭다운 메뉴에 드롭다운 메뉴가 올바르게 설치되면 프로젝트 열기, 해골 분석, 시간 간격 편집, 흐름 분석 및 공간 맵 생성이 포함됩니다.
- 이러한 명령이 매크로 메뉴에 없는 경우 플러그인 > 매크로 > 설치를선택하고 Fiji\plugins\매크로 폴더를 열고 STAFF.ijm 파일을 선택한 다음 확인 버튼을 클릭합니다. 이제 플러그인 > 매크로 메뉴에 명령이 나타납니다.
6. 직원을 이용한 혈관 흐름 정량화
- 새 프로젝트를 만듭니다.
- 플러그인 > 매크로 > 프로젝트 열기-만들기를 선택하고 프롬프트를 따라 구성 파일을 만들거나 업데이트합니다.
- 프로젝트 열기 메뉴에서 프로젝트 디렉터리, 입력 파일 폴더 및 입력 파일 Movie.tif 및 Skeleton.tif로 이동하여 선택합니다. 필요한 경우 자동 채우기 출력 파일 이름을 편집합니다.
- 최단 세그먼트 길이(20 μm), 측정된 최대 속도(2,000 μm/s) 및 매핑된 최대 속도(1,000 μm/s)에 대한 입력 값입니다.
참고: 초당 가장 짧은 세그먼트 길이와 프레임의 곱은 이론적으로 측정할 수 있는 최대 유속을 제공합니다. 문헌에 보고된 가장 높은 모세관 유속은 약 2,000 μm/s15입니다. 간에서는 모세관 유속이 일반적으로 평균 약 300 μm/s이며 거의 1,000 μm/s를 초과하지 않는 것을 관찰했습니다. - 이미지 시퀀스(이미지 메타데이터 또는 실험 노트)의 픽셀 크기 및 프레임 속도 값을 입력합니다. 이러한 값에는 사용자 입력이 필요합니다. 이미지에 주기적인 배경 강도 가있는 경우 깜박임 보정 상자를 선택합니다.
- 데이터의 최상의 시각화를 위해 매개 변수를 선택합니다. 데이터가 컬러 배율의 전체 범위에 걸쳐 매핑되도록 매핑된 최대 속도를 선택하여 데이터의 약 95%를 포함합니다. STAFF는 고속 이상값을 컬러 스케일의 고속 끝에 매핑합니다.
- 골격을 분석합니다.
- 플러그인 > 매크로 및 스켈레톤 분석. skeleton.tif 파일이 열리고 관심 지역(ROI) 관리자가 열리고 실행됩니다.
참고: 스켈레톤 분석은 각 픽셀을 끝점, 교차로 또는 세그먼트 내의 인접 개수로 분류합니다. 각 세그먼트에 대해 식별 번호(ID 번호)가 보정된 분기 길이와 분기 끝의 공간 좌표가 기록됩니다. - 세그먼트 아이디가 스켈레톤에 표시될 때까지, 세그먼트 목록이 ROI 관리자에 표시될 때까지 기다립니다. 확인을 클릭합니다.
- 호흡 운동 사이에 적혈구가 모세관을 통과하는 곳 (예 : 가장자리가 아닌 모세관 외부)에 남아 있는지 확인하십시오. 동영상 파일을 연 다음 ROI zip 파일을 열린 동영상으로 드래그하여 레이블이 지정된 세그먼트를 동영상의 오버레이로 표시합니다. 세그먼트가 겹쳐진 동영상 재생합니다.
- 플러그인 > 매크로 및 스켈레톤 분석. skeleton.tif 파일이 열리고 관심 지역(ROI) 관리자가 열리고 실행됩니다.
- 시간 간격을 선택합니다.
- 플러그인 > 매크로 > 시간 간격을 선택합니다. 매크로가 동영상의 총 시간 동안 단일 세그먼트에서 kymograph를 생성하는 동안 기다립니다. 이 kymograph에서 사용자는 분석을 위해 시간 간격을 선택합니다. 필요한 경우 컨트롤 + + 키를 사용하여 kymograph의 크기를 늘립니다.
- 사각형 선택 도구가 자동으로 활성화됩니다. 각 시간 간격 주위에 사각형을 그립니다. 시간 간격 길이에 대한 좋은 출발점은 kymograph에서 수평 흐림 영역으로 명백한 호흡 사이의 1-2 s 간격입니다.
- 시간 간격 선택을 기록하려면 ROI 관리자에서 T 키 또는 추가 단추를 클릭합니다. 원하는 만큼 시간 간격으로 반복합니다. kymograph의 위쪽(또는 왼쪽)에서 아래쪽(또는 오른쪽)까지 순차적으로 선택합니다.
- 적은 수의 시간 간격(3~4)을 선택하고 흐름 분석(다음 단계)에 대해 큰 데이터 집합에 몇 시간이 걸릴 수 있기 때문에 이러한 간격에 대한 분석을 완료하여 프로젝트 열기에서 매개 변수 선택(프로젝트 열기)을 평가합니다.
- 완료되면 각 시간 간격 창에 대한 ROI 만들기에서 확인을 클릭합니다. 선택한 간격이 프로젝트 폴더에저장되면 팝업 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다.
- 흐름을 분석합니다.
- 플러그인 > 매크로 > 흐름 분석 및 유량 매개변수 분석 대화 상자가 열리고 프로젝트 열기 단계에 입력된 값을 표시합니다. 필요한 경우 편집한 다음 확인을클릭합니다.
- 출력 파일 이름 대화 상자가 열리고 프로젝트 만들기 시작 단계에 입력된 이름을 표시합니다. 필요한 경우 편집한 다음 확인을클릭합니다.
- 사용자가 분석을 시작할 준비가 되었는지 묻는 대화 상자가 열립니다. 확인을 클릭하면 분석이 시작됩니다. 흐름 분석이 완료된 시기를 나타내기 위해 열리는 대화 상자를 기다립니다.
참고: 필요한 시간은 데이터 집합의 프로세서 속도와 크기에 따라 다릅니다. - 결과 파일이 프로젝트 폴더에 .csv 형식 스프레드시트 파일로 저장되었는지 확인합니다.
참고: 출력 파일에는 다음과 같습니다: segment_velocities.csv에는 흐름 방향을 나타내는 양수 및 음수 값이 있는 속도 값이 포함되어 있습니다. 최소 길이보다 짧은 세그먼트를 나타내는 셀에는 SHORT 텍스트가 포함되어 있습니다. 속도 값이 최대 측정 속도보다 큰 셀에는 OUT 텍스트가 포함되어 있습니다(이상값의 경우). kym_ang.csv는 피지의 방향성 플러그인에 의해 측정 된 kymograph 각도가 포함되어 있습니다. good_fit.csv는 각 kymograph에서 측정 된 각도의 분포에 곡선의 적합의 장점을 포함하고 있습니다. 적합도가 좋지 않거나(&0.8)은 세그먼트의 숨겨진 분기점, 시간 간격 동안속도 의 변화, 램프 또는 실내 조명 깜박임을 나타낼 수 있습니다. - segment_velocities.csv에 OUT 값이 거의 포함되어 있는지 확인합니다. 많은 수의 OUT 값이 있는 경우 분석할 최소 세그먼트 길이가 15~20μm 이상인지 확인한 다음 흐름 분석을다시 실행합니다. 새 segment_velocities.csv에도 OUT 값의 큰 비율이 여전히 포함되어 있으면 깜박임 보정 상자를 확인한 다음 흐름 분석을다시 실행합니다.
- 공간 맵을 생성합니다.
- 플러그인 > 매크로 > 공간 맵 생성 및 공간 맵 매개변수 창이 열리고 프로젝트 열기 단계에 입력된 값이 표시됩니다. 필요한 경우 편집하거나 확인을계속 선택합니다.
- 유속의 공간 맵의 시간시퀀스가 유속을 나타내는 색상으로 생성되는 것으로 보봅니다. 출력은 각 시간 간격에 대해 하나의 이미지가 있는 .tif 이미지 스택의 형태입니다. .tif 스택을 스크롤하여 흐름의 공간 및 시간적 변화를 시각화합니다. 스택을 영화로 공유할 AVI 파일(최대 이식성을 위해 압축되지 않은 파일)으로 저장합니다.
7. STAFF 출력을 이용한 정량분석
- 스프레드시트 또는 통계 분석 프로그램에서 segment_velocities.csv 파일을 엽니다. 이러한 값에는 해당 세그먼트의 시작/정지 점(세그먼트 ROI 파일에 기록됨)을 기준으로 흐름 방향을 나타내는 양수 또는 음수 부호가 있습니다.
- 모든 속도 값의 절대 값을 포함하는 새 스프레드시트 페이지를 만듭니다. 이 값을 사용하여 전체 평균 유속, 시간에 따라 모든 혈관 세그먼트에 대한 평균 유속, 시간에 따라 각 혈관 세그먼트에 대한 유속을 계산하고 속도 분포의 히스토그램을 만듭니다.
- 먼저 레이블이 지정된 골격에서 특정 관련 세그먼트를 찾은 다음 선택한 세그먼트에 대한 분석을 수행하여 특정 형태학적 영역 또는 기타 관심 영역 주위의 값을 계산합니다.
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Representative Results
STAFF 분석은 초에서 분까지 연장되는 시간의 기간에 걸쳐 전체 현미경 필드에 걸쳐 미세 혈관 속도의 완전한 인구 조사를 생성합니다. 대표적인 결과는 그림 1, 그림 2, 그림 3및 그림 4에제시되어 있습니다. 도 1은 마우스의 간에서의 미세 혈관 네트워크의 시계열, 미세 혈관 흐름의 축을 정의하는 데 사용되는 스켈레톤화된 이미지의 생성, 및 정량화를 위해 확인된 개별 혈관 세그먼트의 STAFF 생성 맵의 예를 나타낸다. 그런 다음 STAFF는 스켈레톤화된 이미지를 사용하여 미세 혈관 네트워크를 개별 세그먼트로 분할한 다음 각 세그먼트에 대한 kymographs 이미지를 생성합니다. 이러한 이미지는 사용자에게 제공되며, 키모그래피 분석에 사용될 시간 간격을 식별하는 도구와 함께 제공된다(그림2). 그런 다음 STAFF는 스켈레톤을 사용하고 사용자가 제공한 시간 간격을 사용하여 각 세그먼트의 kymograph를 개별 세그먼트 시간 간격으로 분할합니다. 그런 다음 STAFF는 각 세그먼트 시간 간격에서 kymograph의 주요 각도를 식별하고 속도 측정을 .csv 데이터 파일(그림 3)과색상 으로 구분 된 속도 맵 이미지 의 스택 형태로 제공합니다(그림 4). 데이터 분석 파이프라인의 탐색을 지원하기 위해 STAFF는 모든 kymograph 각도 측정 및 적합도 값이 포함된 .csv 파일을 제공합니다.
그림 1: 혈관 골격을 생성한다. (A)살아있는 마우스의 간에서 수집 한 타임 시리즈 이미지에서 단일 프레임의 원본 이미지. 배율 막대 = 100 μm.(B)중앙 정맥 (CV) 및 포털 트라이아드 (PT)가 표시된 패널 A에 표시된 이미지는 정현파 흐름의 주요 방향을 식별합니다. (C)패널 A의 이미지와 정현파의 TrakEM2 세분화. (D)TrakEM2 분할의 이진 이미지. (E)TrakEM2 세분화의 스켈레톤화. (F)레이블이 있는 개별 혈관 세그먼트의 STAFF 출력 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 기모 그래프 분석. (A) 그림 1F에표시된 혈관 세그먼트의 확대 된 이미지. (B)한 세그먼트의 전형적인 키모그래피는 두 번의 호흡 간 시간 간격을 통해 수집하였다. 호흡 기간은 화살표로 표시됩니다. (C)패널 A에서 세그먼트 240, 252 및 254에 대한 Kymographs는이 그림의 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 속도 데이터 분석. (A, B) 19시간 간격에 걸쳐 4개의 세그먼트의 속도 측정 표는방향(A)또는 절대속도(B)로표현됩니다. (C)전체 20s 기간 동안 전체 필드에 걸쳐 절대 속도 값의 분포를 보여주는 히스토그램. (D)전체 20s 기간 동안 도 2C에 kymographs가 표시되는 세 세그먼트의 속도 그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 속도 맵. (A) 그림 1에표시된 필드에 대한 단일 시간 간격에 대한 색상 코딩 속도 맵의 STAFF 출력 이미지입니다. (B)3D 볼륨으로 표시되는 모든 시간 간격에 대한 속도 맵의 복합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에는 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 간내 영상 촬영 중 움직임을 최소화하는 것은 STAFF를 사용하여 모세관 유동 분석에 사용할 수 있는 영상을 생성하는 데 필수적입니다. 다이어프램의 근접성으로 인해 짧은 호흡 유발 운동이 발생하며, 안전한 간은 각 호흡 후 초기 위치로 돌아갑니다. 거즈를 이용한 커버슬립 바닥 접시에 대해 외과적으로 노출된 간을 고정한 다음, 거꾸로 된 현미경을 사용하여 아래에서 이미징하는 것은 호흡16,17,18,19사이의 장기를 고정시키는 역할을 한다. 둘째, 측정할 수 있는 유량의 속도는 이미지 수집 속도와 유량이 측정되는 세그먼트의 최소길이(11)의함수이기 때문에 100fps의 이미지 수집 속도를 강력히 권장합니다. 셋째, 고품질 골격을 생산하는, 혈관 네트워크의 라인 드로잉 표현은 STAFF를 사용하여 모세관 유속을 얻는 다음 중요한 단계이다. 골격 선 세그먼트는 분석되는 시간 과정 동안 호흡 사이의 혈관의 중간점 근처에 놓여야하며 이미지 평면에서 혈관 분기를 식별해야합니다. 혈관 세그먼트를 따라 숨겨진 이러한 분기의 위치는 영화를 보거나, kymograph를 검사하거나 해당 세그먼트에 대한 시간에 따른 속도 값을 검사하여 유추할 수 있습니다. 영화를 보면 이러한 혈관 세그먼트는 양방향 흐름을 가지거나, 보이지 않는 가지의 위치를 향해 멀리 방출되거나 수렴되거나, 혈관 세그먼트를 따라 해당 지점에서 유속이 급격히 변하는 것으로 보입니다. 숨겨진 분기점의 위치는 kymographs에서 유동 방향 또는 속도의 변화에 의해 생성되는 각도 변화의 위치로 식별할 수 있습니다. 스프레드시트에서 숨겨진 분기 위치가 있는 혈관 세그먼트는 두 기여 세그먼트의 값 간에 방향(기호)을 스퓨리어스로 변경하거나 변경할 수 있습니다. 타임계에 이미지 평면에 없는 분기점이 너무 많은 경우 누락된 분기점의 위치에 선 그리기에 간격(페인트 도구를 사용)을 배치하여 스켈레톤을 수동으로 편집한 후 STAFF 분석을 반복해야 합니다.
일반적으로 눈에 띄지 않지만 STAFF를 사용하여 유속을 측정하는 데 큰 영향을 미치는 이미지 수집의 일반적인 문제를 발견했습니다. 영상 획득에서, 에피 조명 램프 광원의 강도 또는 현미경 실에서의 영역 조명으로부터 의 불안정성 또는 "깜박임"이 발생할 수 있다. 어느 소스에서, 깜박임의 기간과 시간이 지남에 따라 빛 / 어두운 밴딩은 kymographs에서 제로 각도로 발생합니다. 영각 피크가 주요 피크인 경우, 유량 속도가 측정되는 혈관을 통해 적혈구의 움직임에 의해 생성된 각도가 인간의 눈에 명백하더라도 방향성 플러그인은 곡선을 0도에 맞고 매우 0도에 가까운 값을 보고하여 비현실적으로 높은 속도 측정을 초래합니다. 영각 피크가 주요 피크가 아니더라도 보고된 속도가 더 높은 값으로 이동되도록 방향성 곡선에 영향을 미칩니다. 이 문제를 해결하기 위해 STAFF는 0°에서 발생하는 피크 각도를 무시하는 "깜박임 보정" 옵션을 제공합니다. 이 수정은 속도 정량화에 영향을 주지 않고 램프 깜박임의 영향을 제거했습니다.
광시야 현미경 검사법을 사용하여 유속을 얻는 주요 제한은 이미지 수집이 장간막 혈관, 또는 제브라피시 간 또는 간 또는 같은 장기의 표면 층과 같은 얇은 제제로 제한된다는 것입니다. 외형화할 수 있는 신장.
기존의 유량 정량화 방법에 비해 STAFF를 사용하는 중요한 장점은 혈관 흐름의 공간 및 시간적 패턴을 신속하고 편향없이 감지할 수 있다는 것입니다. 래스터 스캐닝 시스템을 이용한 미세혈관 유량 데이터의 수집 및 분석은 일반적으로 한 번에 선택된 단일 모세혈관의 측정으로 제한된다20,21,22,23. 방법은 필드24,25,26에서흐름 속도를 추출하는 방법이 존재하지만 이러한 방법 중 어느 것도 전체 필드에 걸쳐 분석을 지원하지 않으며 모두 노동 집약적입니다. STAFF를 사용하면 수만 개의 이미지가 있는 데이터 집합의 전체 이미지 필드에 걸쳐 시간이 지남에 따라 모든 모세관 세그먼트를 하루 만에 분석할 수 있습니다. 전체 필드 혈관 흐름의 단일 데이터 집합에 대한 수동 분석은 수개월에서 수년까지 걸릴 수 있습니다. 따라서, 수동 분석은 정상 흐름의 특성화에도 비실용적이며 여러 치료 군의 비교를 허용하지 않습니다.
혈관 흐름의 주시학적 패터닝의 STAFF 정량화의 용이성은 미래의 사용자가 모세관 흐름 속도 패터닝에 미치는 영향에 혈관 형태 학적 관찰을 연결할 수있는 기회를 제공합니다. 혈관 직경과 네트워크 토폴로지의 혈관 형태 측정 사이의 관계를 정의하여 속도 패터닝을 통해 우리는 혈관 형태에서 흐름 패턴을 예측할 수 있습니다. 유사하게, 혈관 흐름 패터닝 및 혈관 형태와 타이밍, 국소화 및 면역 세포 침투의 범위, 독성 노출 또는 질병으로 인한 조직 손상 또는 세포 내 수송 상태와 상관 관계가 있을 뿐만 아니라 우리에게 건강과 질병에 있는 흐름 패터닝 그리고 세포 기능의 더 나은 이해, 그러나 또한 특히 유해한 병리생리학 시나리오를 확인하기 위한 틀을 제공할 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 이익을 보고하지 않습니다.
Acknowledgments
여기에 제시된 연구 결과는 건강의 국가 학회 (NIH U01 GM111243 및 NIH NIH NIDDK P30 DK079312)에서 자금조달에 의해 지원되었습니다. 생체 내 현미경 검사법 연구는 인디애나 생물 현미경 검사법 센터에서 수행되었습니다. 말고르자타 카모카 박사에게 현미경 검사법 기술 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
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