Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה

Published: November 18, 2019 doi: 10.3791/60493
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1, 4, 1,2, 5, 5, 5, 5, 6, 1,2, 5
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

Summary

כדי לכמת את זרימת מיקרונימי הדם ממהירות גבוהה מהירות רצף נימי תמונה, פיתחנו צוות (ניתוח זמני מרחבי של זרימת שפילד) תוכנה. מעבר לשדה התמונה המלא ולאורך הזמן, הצוות מעריך מהירויות זרימה ומייצר רצף של מפות מרחבית בצבע לצורך הדמיה ותפוקה טבלאית עבור ניתוחים כמותיים.

Abstract

שינויים במהירות זרימת הדם והפצה חיוניים לשמירה על רקמות ואיברים בתגובה לצרכים סלולריים שונים. עוד, המראה של פגמים במיקרו מחזור יכול להיות מחוון העיקרי בפיתוח של פתווגיות מרובות. ההתקדמות בהדמיה אופטית הפכה את מיקרוסקופ הטרטל (IVM) לגישה מעשית, המתיר הדמיה ברמה התאית והתאית בבעלי חיים במהירות גבוהה לאורך זמן. ובכל זאת, למרות החשיבות של שמירה על הרקמה הנאותה, השונות המרחבית והטמפורלית בזרימה קפילר מתועדת לעיתים רחוקות. בגישה הסטנדרטית, מספר קטן של מגזרי נימים נבחרים להדמיה במשך זמן מוגבל. כדי לכמת באופן מקיף את זרימת נימי בצורה בלתי משוחדת פיתחנו בניתוח זמני מרחבי של שפילד תזרים (צוות), מאקרו עבור תוכנות הקוד הפתוח של פיג'י תוכנת ניתוח. באמצעות רצפי תמונות במהירות גבוהה של שדות מלאים של זרימת הדם בתוך נימים, צוות מייצרת תמונות המייצגות תנועה לאורך זמן הנקרא kymographs עבור כל מרווח זמן עבור כל פלח כלי דם. מצוות kymographs מחשבת המהירויות ממרחק כי בתאי הדם האדומים לנוע עם הזמן, והתפוקות את נתוני המהירות כרצף של מפות מרחבי צבע מקודד עבור ויזואליזציה ופלט טבלאי עבור ניתוחים כמותיים. בתוך כבדי העכבר הרגילים, הצוות מנתח את ההבדלים העמוקים במהירות הזרימה בין אזורי כלקרום הלב והשער הפנימי שבתוך הלובולים. אפילו יותר בלתי צפוי הם ההבדלים מהירות הזרימה לראות בין sinusoids כי הם בצד ותנודות לראות בתוך מגזרים בודדים כלי הדם לאורך שניות. הצוות הינו כלי חדש ורב עוצמה המסוגל לספק תובנות על ידי הפעלת הדינמיקה הטמפורלית המורכבת של זרימת קפילר.

Introduction

המיקרוקובלטורה ממלא תפקיד קריטי בפיזיולוגיה, ומבטיח הפריה אפקטיבית של רקמות בתנאים שמשתנים. מיקרוכלי דם תפקוד מיקרו משויך תנאים רבים כולל תחלואה וכלי דם לטווח ארוך ותמותה, פיתוח של דמנציה, ומחלות של הכבד והן הכליות ולכן הוא גורם מפתח של עניין במגוון רחב של חקירות ביו1,2,3,4,5. בעוד טכניקות מרובות נעשה שימוש כדי להעריך את הפרזיה רקמות, רק מיקרוסקופ intravital מאפשר איסוף נתונים בזמן וברזולוציה מרחבית הדרושים כדי לאפיין את זרימת הדם ברמה של נימים בודדים.

זרימה מיקרוכלי דם ניתן לדמיין במיקרוסקופיה פלואורסצנטית או על ידי התנועה של מיקרוספירות פלורסנט או על ידי התנועה של כדוריות הדם האדומות נגד הרקע של ממברנה-ציוויים סמנים פלורסנט (g., כגון תוספי התווית או אלבומין)6,7. ניתן לעשות שימוש בזרימה מיקרוסקולרית בשכבות תא שטחיות בעזרת מיקרוסקופ שטח, או לעומק באמצעות מיקרוסקופ מרובה או מיקרופוטון. עם זאת, שיעורי זרימת נימי הם כאלה כי מעבר של כדוריות הדם האדומות לא ניתן בדרך כלל להילכד במהירויות פחות מ 60 מסגרות/s. מאז ביותר בדיקת מיקוד לייזר מיקרוסקופ multiphoton דורשים 1 – 5 s כדי לסרוק את שדה התמונה מלא, מהירות זו יכולה בדרך כלל רק על ידי הגבלת שדה התצוגה, לפעמים קו סריקה אחת8. התהליך של הגבלת מדידות לפלחי נימים נבחרים (1) יש את הפוטנציאל להציג הטיית בחירה ו-2) מאפשר ללכוד את הטרוגניות המרחבי והזמני בשיעורי זרימת הדם נימי. לעומת זאת, תמונות של רשתות קפילר ניתן לאסוף במהירויות יעלה 100 fps באמצעות מיקרוסקופים דיגיטלית רחבת שדה מצויד מדעי מוליך למחצהמדעית תחמוצת מתכת (scmos)מצלמות 9,10. אלה מערכות זולות, נפוץ במעבדות ביו-רפואית טיפוסי לאפשר להזרים מיקרונימי התמונה על פני רשתות דו ממדיות שלמות, למעשה ברציפות. הבעיה אז הופך להיות אחד מציאת גישת ניתוח כי הוא מסוגל לחלץ נתונים כמותיים משמעותיים מתוך נתוני תמונה מסיבית ומורכבת שנוצרו על ידי מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה.

כדי לאפשר ניתוח של נתוני זרימה בשדה מלא פיתחנו צוות, ניתוח תמונה הרומן תוכנה שיכולה ברציפות למדוד זרימה מיקרוכלי דם בכל שדות מיקרוסקופ שלמים של סדרת תמונות שנאספו במהירות גבוהה11. הגישה מתאימה למגוון של מערכות נסיוניות ושיטות דימות שונות, ותוכנת ניתוח התמונה של הצוות מיושמת ככלי מאקרו המוגדר עבור הטמעת ה-פיג'י של ImageJ12. העיקרון הבסיסי המשמש כאן כדי להמחיש זרימה מיקרוכלי דם היא כי הראשון, יש לספק כמה ניגודיות כדי להיות מסוגל לדמות את כדוריות הדם האדומות בתוך נימים. במחקרים שלנו, ניגודיות מסופק על ידי בדיקה פלורסנט בתפזורת כי הוא נשלל על ידי כדוריות הדם האדומות. מהירות הזרימה יכול להיות לאחר מכן לכמת מן העקירה של כדוריות הדם האדומות המופיעות ככתם שלילי בתוך הפלזמה המסומן באמצעות פלואורוסקופים בתמונות שנאספו במהירות גבוהה מחיה חי8. לאחר מכן אנו משתמשים בצוות כדי ליצור חלקות של מרחק לאורך כל קטע נימי על מרווחי זמן מרובים הנקראים kymographs, לאחר מכן לזהות את המדרונות הנמצאים kymographs13, וממדרונות אלה לחשב את שיעורי הזרימה microvascular. הגישה ניתן להחיל על תמונות שנאספו מכל מיטה נימי כי ניתן לגשת להדמיה. כאן אנו מתארים את היישום של IVM ואת הצוות למחקרים של זרימת הדם בכבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ניסויי בעלי החיים אושרו ונערכו על פי הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשתמש בהנחיות של אוניברסיטת אינדיאנה, והוא דבק במדריך NRC לטיפול ולשימוש בבעלי חיים.

1. הכנה כירורגית למיקרוסקופיה

הערה: . זה לא ניתוח הישרדות פעם בסעיף 1 "הכנה כירורגית למיקרוסקופיה" מתחילה, לא ניתן להשהות את העבודה עד להשלמת סעיף 2 "מיקרוסקופ אינטרטל".

  1. האקזה 9 – 10 גבר בן C57BL/6 עכברים, לפחות 4 ימים ומהר עבור 16 h לפני הלימודים.
  2. שוקלים את החיה, תרופת הרגעה עם 5%. מקום על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף השתמש בקצב זרימת חמצן של 1 – 2 L/min ולשמור על הרגעה עם 1-2% isofלוריאן. בדוק רפלקסים על ידי צביטה בבוהן. לעקוב אחר טמפרטורה באמצעות מד חום רקטלי. הצג קצב פעימות לב ונשימה חזותית.
  3. כאשר הרדמה יציבה, לגלח את האזור מיקום צינורית הצוואר ואת האזור מתחת לכלוב הצלעות לחשיפת הכבד.
  4. לצינורית עורק הצוואר, לעשות 1 ס מ החתך הגחוני השמאלי 1 – 2 ס מ מתחת ללסת של העכבר. לנקות את כל השומן והfascia סביב וריד הצוואר. לקשור את הקצה הקדמי של ווריד הצוואר באמצעות מחרוזת תפר 06 כדי למנוע דימום.
    1. לעשות ניק זעיר בווריד העורק ולהחליק את הצינורית (30 G x 1/2 ב, מחט), מחזיק המחט וצינורות פוליאתילן (0.011 x 0.024 אינצ'ים2 מצורף מתאם Stub luer ו מלא עם 0.9% מלוחים) בערך 1 ס מ, ומאובטח בקצה האחורי של וריד הצוואר באמצעות מחרוזת תפר 0-6.
  5. באמצעות צינורית עורק הצוואר לספק 70 kda fluorescein תוספי (למינון של 30 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה של 0.1 mL של 9 מ"ג/mL תמיסת מלח).
  6. לחשוף את הכבד לדימות על ידי ביצוע חתך של 4 – 6 ס"מ על פני הגוף, 1 – 2 ס מ מתחת לאמצע של כלוב הצלעות.
  7. המקום רטוב (ספוגה ב 0.9% מלוחים) 2 x 2 אינצ'ים2 ספוג גזה מתחת לאונה השמאלית של הכבד הרוחבי. הקלטת מקום על הפריפריה של חלון הזכוכית של צלחת 40 מ"מ coverslip ולהחיל דבק ציאנואקרילי לקלטת. לחץ על הצלחת זכוכית לכבד באמצעות כותנה מכשיר המוליך ללחוץ גזה לתוך הדבק על הקלטת כדי למזער את תנועת הרקמה עבור מיקרוסקופ.
  8. להעביר חיה לשלב המיקרוסקופ. הוסף סטרילי 0.9% תמיסת מלח לתוך הצלחת התחתית coverslip כדי לשמור על הכבד לח לאורך המפגש הדמיה. שמרו על טמפרטורה של 36 – 37 ° צ' באמצעות משטחי חימום הנטענים על הבמה, משטח חימום הממוקם על החיה ומחמם אובייקטיבי.

2. מיקרוסקופ אינטרטל

  1. לבצע מיקרוסקופ הפוך על המיקרוסקופ epiפלואורסצנטית הפוכה מצויד מצלמת וידאו מסוגל לכידת תמונה במהירות גבוהה.
    הערה: כאן, מנורת קשת קסנון, fluorescein מסוים עירור (480 – 500 ננומטר) ופליטה (507 – 543 nm) מסננים, תוכנית Fluor 20 x, N.A. 0.75 מים המטרה טבילה, ו מצלמה במהירות גבוהה sCMOS שימשו.
  2. בחר את אזור העניין עבור ניתוח זרימת דם קפילר באמצעות תאורה מינימלית.
  3. הגדר את זמן החשיפה קצר מספיק עבור המצלמה כדי להיות מסוגל לרכוש 100 fps. הגדר את רמת התאורה כדי להמחיש בבהירות את הצללים של תא דם אדום ואת הטופולוגיה של ואצלב תוך הימנעות פוטורעילות והלבנת של לווין פלורסנט.
  4. לאסוף תמונות בקצב של 100 fps. הגדר את רזולוציית הפיקסל של המצלמה בין ~ 0.65 ו-~ 1.3 μm/פיקסל. הגדר גודל מסגרת בין 512 x 512 ו 1024 x 1024 פיקסלים. קבע עומק סיביות בין 8 ל-16 סיביות. השתמש ברזולוציה הגבוהה ביותר, גודל המסגרת ועומק הסיביות שעדיין מאפשר 100 fps אוסף תמונות במערכת.
  5. שמור קובץ סדרת זמן (s) כרצף של קבצי TIF או כמו מצלמה מקורית/בפורמט מיקרוסקופ אם Bio-פורמטים14 בפיג יכול לפתוח את הקבצים בפורמט יליד.
  6. תמונה באזורים מרובים לאורך זמן. לשמור על העכבר על הבמה במיקרוסקופ עד 2 h. המתת חסד העכבר בסוף הדמיה.
    הערה: משך סדרת הזמן יהיה מבוסס על איזון הצורך בתמונה עבור מרווח זמן המחבק את השונות, בעוד לא להשפיע על הכדאיות של הרקמה. המשך של סידרת הזמן עשוי גם להיות מוכתב על-ידי שיקולים של גודל קובץ; סדרה של 1 דקות זמן של 1024 x 1024 פיקסל 16-bit תמונות שנאספו ב 100 fps יפיק קובץ שהוא 12 GB בגודל. שיקולים של גודל קובץ עשויים גם להכתיב גודל מסגרת ועומק סיביות בשימוש. אין מגבלות גודל מפורשות בתוך צוות.

3. להגדיר את רשת כלי הדם באמצעות TrakEM2 בפיג

הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שמירת העבודה בכל נקודה שהיא בסעיף 3.

  1. הורד והתקן פיג'י מ-https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    הערה: גירסה 1.51 n של פיג'י שימש עבור פרוייקט זה, וניתן להורידו מ-https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. שים לב כי ב-Windows, יש להתקין את פיג'י במרחב המשתמש ולא בקבצי תוכניות.
  2. פתח את קובץ הסרט בפיג באמצעות קובץ > פתיחה או שימוש בקובץ > ייבוא > רצףתמונות. בחרו תמונה בודדת מהתמונות היציבות בין התמונות שבהן קל לראות את הטופולוגיה של רשת כלי הדם. בחר ' תמונה ' > שכפל ושכפל את התמונה הבודדת שנבחרה (לא את המחסנית) ושמור את התמונה בתיקיה חדשה. אל תכלול רווחים בשמות קבצים או תיקיות.
  3. הגדר פרוייקט TrakEM2 ריק חדש על-ידי בחירת קובץ > חדש > TrakEM2 (ריק). בחר את התיקיה החדשה המכילה את התמונה הבודדת מהסרט כתיקיית הפרוייקט. חלונות הTrakEM2 יפתחו.
  4. לחצו לחיצה ימנית באזור העבודה הראשי ובחרו ' יבא > ייבוא תמונה'. נווטו לתמונה הבודדת שנשמרה בשלב 3.3 ובחרו בה.
  5. לחצו לחיצה ימנית באזור העבודה הראשי שוב ובחרו ' הצג > שינוי גודל בד ציור/ערכת שכבות '. לחץ שמאלה בחלון העבודה הראשי. התמונה תמלא את אזור העבודה.
  6. כדי לבחור את האזורים בתמונה המכילים את הרשת של כלי הדם, בחירת רשימת הגדרות אזור ההתקנה ב-TrakEM2. בחלון TrakEM2 קטן יותר (תבנית, אובייקטים של פרוייקט, שכבות) לחץ לחיצה ימנית על "• כל דבר". בחר בהוסף רשימת אזורי> צאצא חדשה.
  7. בחלון TrakEM2 קטן יותר, גרור "תבנית > כל דבר" אל "אובייקטי פרוייקט > פרוייקט". לאחר מכן גרור "תבנית > כל דבר > • רשימת אזורים" אל "אובייקטי פרוייקט > פרוייקט > דבר". תחת "אובייקטי פרוייקט > פרוייקט > כלום", רשימת האזורים יהיו נוכחים כעת.
  8. בחלון TrakEM2 הראשי תחת הכרטיסיה מרחב Z, נוצרה רשימת אזורים בעלי תווית עמודה. לחץ כדי לבחור בו. בחלון TrakEM2 הראשי בחר גם בכלי מברשת צבע. הקש Shift וגלגל את גלגל העכבר כדי לבחור גודל מתאים עבור מברשת הצבע, לדוגמה, קטן יותר מקוטר הכלי. כדי לשמור את בקרת הTrakEM2 לעיתונות + S מפתחות.
  9. צבעו את רשת כלי הדם בעזרת הכלי מברשת צבע. כדי למחוק הקישו Alt תוך שימוש בכלי מברשת צבע. אין לכלול אזורים מחוץ לפוקוס. שמור לעתים קרובות באמצעות Control + S.
  10. כאשר התוויות של הרשת כלי הדם הושלמה, לחץ לחיצה ימנית בחלון TrakEM2 הראשי ובחר ייצוא ≫ אריאליסטים כתוויות (tif). בחלון המוקפץ בחר את קנה המידה 100% וייצא את כל רשימת האזורים. סגור חלונות TrakEM2 ובחר כן לשמירת הפרוייקט.
  11. דמותה של האריאליסטים תיפתח ועשויה להופיע כתמונה שחורה ריקה. בתפריט הראשי של פיג'י, בחר בתמונה > התאים > בהירות/ניגודיות. בחלון B & C לחץ על לחצן אוטומטי והארבליסט יהפוך לגלוי. בתפריט הראשי של פיג ' י בחר בתמונה > טבלאות בדיקת מ> היפוך lut. שמור תמונה זו של תוויות שחורות על רקע לבן וסגור את התמונה.
  12. פתח את קובץ התוויות בפיג. בחר תוספים > שלד > ששלד. שמור את התמונה השלד כטיף. . השתמש בשלד הקובץ tif כאחד מקבצי הקלט הדרושים להפעלת ניתוח זרימת הצוות. בעת שמירת הקובץ, אל תשתמש ברווחים בשם הקובץ.
  13. ערוך באופן ידני את קובץ השלד בהתאם לצורך, על-ידי הצבת פער (באמצעות הכלי צבע) בציור הקו לדוגמה, במיקומים שבהם הסניפים בתוך היישום לא נלכדו, מכיוון שהם יוצאים ממישור התמונה.

4. הכן את רצף הסרטים לניתוח סגל

  1. פתח את קובץ הסרט בפיג באמצעות קובץ > פתוח או קובץ > ייבוא > רצף תמונות. בחרו תקופת זמן של רצף התמונות לניתוח זרימה (יכולות להיות שניות לדקות, מאות לעשרות אלפי מסגרות), בהן מיקום הרקמה נשאר יציב לאורך זמן, למעט במהלך הנשימה.
  2. בחר תמונה ≫ שכפל ושכפל את החלק שנבחר ברצף על-ידי הקלדה במספרים של מסגרות ההתחלה והסיום. בדוק את מרחבי התמונה וכיול זמני תחת מאפייני תמונה > ותקן במידת הצורך. שמור את קובץ התמונה כ-TIF (או כAVI לא דחוסה). . הסרט הזה tif דרוש כקובץ קלט להפעלת ניתוח צוות. אל תכלול רווחים בשם הקובץ.

5. התקנת מאקרו של צוות בפיג

הערה: (חשוב) תיקיות מרובות בתוך ספריות המשנה של התיקיות של פיג'י יש שמות קבצים דומים, חלק באותיות גדולות, חלק לא. ודא שהתיקיות הנכונות נבחרות בעת התקנת צוות.

  1. הורד את פקודות המאקרו של הצוות מ-https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. כדי להתקין, פתח תחילה את תיקיית ה-פיג'י.
    1. ב-Windows מצא את התיקיה בה מותקנת פיג'י במרחב המשתמש, הנפוץ ביותר בשולחן העבודה. ב-MacOS מצא את הסמל של פיג'י בתיקייה יישומים, לחץ לחיצה ימנית ובחר פתח.
  3. בתיקיה פיג'י, פתח את תיקיית התוספים. בתוך תיקיית התוספים, פתח את התיקיה ' פקודות מאקרו '. העתק צוות. ijm לתוך תיקיה זו של פקודות מאקרו: השתמש בפקודה.
  4. בתיקיה פיג'י, פתח את תיקיית התוספים. העתק STAFF_Dir. jar לתוך תיקיית התוספים הזאת: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. jar.
  5. בתיקיה פיג'י, פתח את תיקיית פקודות המאקרו. בתוך תיקיה זו של פקודות מאקרו, פתח את תיקיית ההפעלה האוטומטית. העתק STAFF_Loader. ijm לתוך תיקיית ההפעלה האוטומטית הזאת: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader. ijm.
  6. הפעל את פיג'י וודא התקנת מאקרו. כדי לאמת את ההתקנה, בחר באפשרות תוספים > פקודות מאקרו. כאשר מותקן כראוי את התפריט הנפתח יכלול: פתח-ליצור פרוייקט, שלד לנתח, לערוך מרווחי זמן, לנתח זרימה ולייצר מפה מרחבית.
  7. אם פקודות אלה אינן קיימות בתפריט ' פקודות מאקרו ', בחר באפשרות תוספים > פקודות מאקרו > התקן, פתח את התיקיה fiji\ps\usns, בחר בקובץ. ijm ולאחר מכן לחץ על לחצן אישור . הפקודות אמורות להופיע כעת בתפריט התוספים > פקודות מאקרו .

6. לכמת את זרימת כלי הדם באמצעות צוות

  1. צור פרוייקט חדש.
    1. בחר בתוספים > פקודות מאקרו > פתח את Project ועקוב אחר ההנחיות כדי ליצור או לעדכן קובץ תצורה.
    2. בתפריט ' פתח את פרוייקט ', נווט אל ובחר את מדריך הכתובות של project, את תיקיית קובץ הקלט ואת קבצי הקלט הסרט.. טיף ושלד. טיף ערוך את שמות קבצי הפלט המיושבים באופן אוטומטי אם יש צורך בכך.
    3. ערכי קלט עבור אורך הקטע הקצר ביותר (20 μm), מהירות מקסימלית נמדדת (2,000 μm/s) ומהירות מקסימלית ממופה (1,000 μm/s).
      הערה: התוצר של אורך הקטע הקצר ביותר ומסגרות לשנייה מעניקה את מהירות הזרימה המרבית שניתן תיאורטית למדוד. מהירויות זרימת הקפילר הגבוהה ביותר שדווחו בספרות הן סביב 2,000 μm/s15. בכבד, הבחנו כי זרימת נימי מהירויות ממוצעים בדרך כלל סביב 300 μm/s ולעתים רחוקות חריגה 1,000 μm/s.
    4. הקלידו את הערכים בגודל פיקסל וקצב מסגרות לרצף התמונות (ממטא-נתונים של תמונה או מהערות נסיוניות). ערכים אלה מחייבים קלט מהמשתמש. בדוק את תיבת תיקון הבהוב אם לתמונות יש הבהוב בעוצמת הרקע המחזורית.
    5. בחר פרמטרים עבור ההדמיה הטובה ביותר של הנתונים. בחר מהירות מרבית הממופה כדי לכלול כ-95% מהנתונים כך שהנתונים ימופו לאורך הטווח המלא של סרגל הצבעים. צוות מפות במהירות גבוהה החוצה לקצה במהירות גבוהה של סולם הצבעים.
  2. . לנתח את השלד
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > לנתח שלד. . השלד קובץ tif ייפתח ומנהל אזור הריבית (ROI) ייפתח ויפעל.
      הערה: שלד לנתח מסווג כל פיקסל על ידי מספר השכנים שלה כמו בנקודת קצה, בצומת, או בתוך קטע. עבור כל פלח מספר מזהה (מספר ID), אורך ענף מכויל והקואורדינטות המרחבית של קצות ההסתעפות נרשמות.
    2. המתן להופעת מזהי מקטע בשלד, רשימת הפלחים תופיע במנהל הROI, ומוקפץ המציין שקובץ ה-ROI Manager עבור השלד נשמר. לחץ על אישור.
    3. לוודא כי בין תנועות נשימה, השלד נשאר על המקום שבו כדוריות הדם האדומות לעבור דרך נימי (למשל, לא את הקצה ולא מחוץ לנימים). הצג את המקטעים המסומנים ככיסוי בסרט, על-ידי פתיחת קובץ הסרט ולאחר מכן גרירת קובץ ה-zip של ROI אל הסרט הפתוח. הפעל את הסרט עם המקטעים המצופים.
  3. בחר מרווחי זמן.
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > בחר מרווחיזמן. המתן בזמן שהמאקרו יוצר kymograph ממקטע אחד במשך הזמן הכולל עבור הסרט. מתוך kymograph זה, המשתמש בוחר מרווחי זמן לניתוח. השתמש בבקרה + + מפתחות כדי להגדיל את הגודל של kymograph במידת הצורך.
    2. הכלי בחירת המלבן מופעל באופן אוטומטי. צייר מלבן מסביב לכל מרווח זמן. נקודת התחלה טובה עבור אורך מרווח זמן הוא 1-2 מרווח בין הנשימות, אשר גלויים כאזורים מטושטשים אופקיים ב-kymograph.
    3. לחץ על מקש T או על הלחצן הוסף במנהל הROI כדי להקליט בחירות של מרווחי זמן. חזור על הפעולה עבור מרווחי זמן רבים ככל הנדרש. בצע בחירות ברצף מלמעלה (או משמאל) לתחתית (או ימינה) של kymograph.
    4. הערכת אפשרויות של פרמטרים (מתוך פרוייקט פתוח-יצירה) על-ידי בחירה במספר קטן של מרווחי זמן (3 עד 4) והשלמת ניתוח עבור מרווחים אלה בלבד, מאחר שניתוח זרימה (השלב הבא) יכול להימשך שעות עבור ערכות נתונים גדולות.
    5. לחץ על אישור ב הפוך ROI עבור כל חלון מרווח זמן כאשר תסיים. חלון מוקפץ מופיע כאשר המרווחים שנבחרו נשמרו בתיקיית הפרוייקט. לחץ על אישור.
  4. . לנתח את הזרימה
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > נתח זרימה ותיבת הדו נתח את פרמטרי הזרימה פותח ומציג את הערכים שהוזנו בשלב הפתוח של פרוייקט. ערוך אם יש צורך ללחוץ על אישור.
    2. תיבת הדו ' שמות קבצים של פלט ' נפתחת ומציגה את השמות שהוזנו בשלב פתיחה-יצירה של פרוייקט. ערוך אם יש צורך ללחוץ על אישור.
    3. תיבת דו-שיח תיפתח ותישאל אם המשתמש מוכן להתחיל בניתוח. לחץ על אישור והניתוח יתחיל. המתן לתיבת דו-שיח שתיפתח כדי לציין מתי ניתוח הזרימה יושלם.
      הערה: הזמן הדרוש תלוי במהירות המעבד ובגודל של ערכת הנתונים.
    4. ודא שקבצי התוצאות אוחסנו כקבצי גליונות אלקטרוניים של תבנית. csv בתיקיית הפרוייקט.
      הערה: קבצי פלט כוללים: segment_velocities. csv מכיל ערכי מהירות בעלי ערכים חיוביים ושליליים המציינים כיוון זרימה. תאים המייצגים מקטעים פחות מהאורך המינימלי מכילים את הטקסט SHORT. תאים בעלי ערכי מהירות הגדולים מהמהירות המרבית שנמדדו מכילים את הטקסט OUT (עבור הסטה). kym_ang. csv מכיל זוויות kymograph הנמדד על ידי תוסף הכיווניות בפיג. good_fit. csv מכיל טוב של התאמה של עקומה להתפלגות של זוויות הנמדד מכל kymograph. הטוב ביותר של התאמה (< 0.8) יכול להצביע על נקודות מוסתרים הסתעפות בקטע, לשנות מהירות במהלך מרווח זמן, מנורה או חדר הבהוב אור.
    5. בדוק כדי לוודא שsegment_velocities. csv מכיל ערכים מועטים. אם יש מספר גדול של ערכי OUT, ודא שאורך הקטע המינימלי לניתוח אינו קטן מ-15-20 μm, ולאחר מכן הפעל מראש את הזרימה. אם ה-segment_velocities. csv החדש עדיין מכיל חלק גדול מערכי OUT, בדוק את תיבת התיקון של הבהוב ולאחר מכן הפעל שוב את ' נתח זרימה'.
  5. מייצרים מפות מרחבית.
    1. בחר תוספים > פקודות מאקרו > הפיק מפה מרחבית וחלון הפרמטרים של המפה המרחבית ייפתח, ויציג את הערכים שהוזנו בשלב הפתיחה ליצירת פרוייקט. ערוך במידת הצורך, או כדי להמשיך בבחירה ב'אישור'.
    2. צפה כרצף הזמני של מפות מרחבית של המהירויות זרימה נוצרת עם צבע המציין מהירות זרימה. הפלט נמצא בצורת מחסנית תמונה מסוג. tif עם תמונה אחת עבור כל מרווח זמן. גלול במחסנית. tif כדי להמחיש וריאציה מרחבית וטמפורלית בזרימה. שמור את המחסנית כקובץ AVI (לא דחוס לניידות מרבית) כדי לשתף כסרט.

7. ניתוח כמותי באמצעות פלט צוות

  1. פתח את הקובץ segment_velocities. csv בתוכנית גיליון אלקטרוני או ניתוח סטטיסטי. ערכים אלה כוללים סימן חיובי או שלילי המציין את כיוון הזרימה ביחס לנקודות ההתחלה/עצירה של קטע זה (שנרשמו בקובץ ROI של פלח).
  2. הפוך דף גיליון אלקטרוני חדש המכיל את הערכים המוחלט של כל ערכי המהירות. השתמש בערכים אלה כדי לחשב מהירות זרימה כוללת ממוצעת, מהירות זרימה ממוצעת עבור כל מקטעי כלי הדם לאורך זמן, מהירות זרימה עבור כל פלח כלי דם לאורך זמן, ולהפוך היסטגרמות של הפצות מהירות.
  3. חישוב ערכים סביב אזורים מורפולוגיים מסוימים או אזורי עניין אחרים על-ידי מציאת הקטעים הרלוונטיים הספציפיים בשלד המסומן בתווית ולאחר מכן ביצוע ניתוחים במקטעים הנבחרים הללו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח הצוות יוצר מפקד שלם של מהירויות מיקרוכלי דם על פני שדות מיקרוסקופ שלמים בתקופות של זמן הארכה משניות לדקות. תוצאות הנציג מוצגות באיור 1, איור 2, איור 3 ואיור 4. איור 1 מציג דוגמה של סדרת זמן של הרשת microvascular בכבד של העכבר, הדור של התמונה השלד המהווה משמש להגדיר את ציר הזרימה של מיקרוכלי דם, ואת המפה שנוצר על ידי צוות של פלחי כלי דם בודדים המזוהים עבור כימות. הצוות משתמש בתמונה השלד כדי לשבור את הרשת microvascular למטה למקטעים בודדים, ולאחר מכן יוצר תמונות של kymographs עבור כל קטע. תמונות אלה מסופקות למשתמש, יחד עם כלים כדי לזהות את מרווחי הזמן לשימוש עבור ניתוח kymograph (איור 2). לאחר מכן, הצוות משתמש בשלד, ומרווחי הזמן המסופקים על-ידי המשתמש כדי לשבור את הקימוגרף של כל קטע לתוך מרווחי זמן מקטע בודדים. לאחר מכן מזהה הצוות את הזווית הדומיננטית בקימוגרף מכל מרווח זמן מקטע ומספק מדידות מהירות כקבצי נתונים מסוג. csv (איור 3) ובצורת ערימות של תמונות מיפוי מהירות בצבע (איור 4). על מנת לתמוך בחיפושי של צינור ניתוח נתונים, הצוות מספק גם קבצי. csv המכילים את כל מדידות זווית kymograph וערכי טוב-התאמה.

Figure 1
איור 1: יצירת שלד כלי הדם. (א) תמונה מקורית של מסגרת בודדת מתמונות סדרת זמן שנאספו מהכבד של עכבר חי. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (ב) תמונה המוצגת בחלונית A עם ורידים מרכזיים (CV) וטריאדת הפורטל (PT) הצביעו, כדי לזהות כיוונים עיקריים של זרימת sinusoid. (ג) תמונה מלוח A עם כיסוי של TrakEM2 פילוח של sinusoids. (ד) תמונה בינארית של פילוח TrakEM2. (ה) סקלטונזציה של פילוח TrakEM2. (ו) צוות פלט של מקטעי כלי דם נפרדים עם תוויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח Kymograph. (א) תמונה מוגדלת של מקטעי כלי דם המוצגים באיור 1f. (ב) קיומוגרף אופייני מפלח אחד שנאסף לאורך שתי מרווחי זמן בין-נשימתי. תקופות של נשימה הם ציינו עם חיצים. (ג) kymographs עבור מקטעים 240, 252 ו 254 מ לוח A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מהירות ניתוח נתונים. (א, ב) טבלאות של מדידות מהירות של ארבעה מקטעים מעל 19 מרווחי זמן הביעו מהירות עם כיוון (א) או כמהירותמוחלטת(ב). (ג) היסטוגרמה המציגה הפצת ערכי מהירות מוחלטים על פני השדה כולו במשך כל 20 הזמן. (ד) גרף המהירויות של שלושת הקטעים שקימוגרפים שלהם מוצגים באיור 2c על פני התקופה השלמה של 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מפת מהירות. (א) תמונת פלט של הצוות של מפת המהירות המקודדת בצבע עבור מרווח זמן בודד עבור השדה המוצג באיור 1. (ב) המורכב ממפות מהירות לכל מרווחי הזמן המוצגים כאמצעי אחסון תלת-ממדי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, מיניטיזציה של התנועה במהלך הדמיה הקשה של הכבד הוא חיוני ליצירת סרטים הניתנים לשימוש עבור ניתוח זרימה קפילר באמצעות צוות. בשל הקרבה של הסרעפת, תקופות קצרות של תנועה המושרה נשימה מתרחשים, עם הכבד המאובטח חוזר למיקומו הראשוני אחרי כל נשימה. אבטחת הכבד חשוף בניתוח כנגד הצלחת התחתית coverslip באמצעות גזה, ואז הדמיה מלמטה באמצעות מיקרוסקופ הפוך משמש כדי לשתק את האיבר בין הנשימות16,17,18,19. שנית, מהירות רכישת תמונה של 100 fps מומלץ מאוד מכיוון שמהירות הזרימה שניתן למדוד היא פונקציה של מהירות רכישת התמונה ואת האורך המינימלי של מקטעים שבהם הזרימה נמדדת11. שלישית, הפקת שלד באיכות גבוהה, ייצוג קו הציור של רשת כלי הדם, הוא הצעד הקריטי הבא בהשגת מהירויות זרימה קפילר באמצעות צוות. מקטעי קו השלד צריך להיות ליד נקודת האמצע של הצינור בין הנשימות במהלך הזמן מנותח הסתעפות כלי הדם מהמטוס התמונה צריך להיות מזוהה. ניתן להסיק את מיקומי הענפים הנסתרים הללו לאורך קטע כלי הדם על-ידי הצגת הסרט, על-ידי בחינת הקימוגרף או בחינת ערכי המהירות לאורך זמן עבור קטע זה. הצגת הסרט, מקטעי כלי הדם האלה נראים גם כאשר זורם דו-כיווני, מתרחק או מתכנס לעבר המיקום של הענף בלתי נראה, או כשיש שינוי פתאומי במהירות הזרימה בנקודה זו לאורך קטע כלי הדם. המיקום של נקודות הסתעפות מוסתרים ניתן לזהות ב-kymographs כמיקום של שינוי בזווית המיוצר על ידי שינוי בכיוון זרימה או מהירות. בגיליון האלקטרוני, פלחי כלי דם עם מיקומי ענפים נסתרים עשויים לשנות כיוון (סימן) או לשנות את הערכים של שני המקטעים התורמים. אם סידרת הזמן כוללת נקודות מסתעפות רבות מדי הנמצאות מחוץ למישור התמונה, יש לחזור על ניתוח הצוות לאחר עריכת השלד באופן ידני, על-ידי הצבת פער (באמצעות כלי הצביעה) בציור הקו במיקומים של נקודות ההסתעפות החסרה.

גילינו בעיה נפוצה ברכישת תמונות שבדרך כלל הולכת ומלא מבחינים, אך הייתה השפעה חזקה על מדידת מהירויות הזרימה באמצעות הצוות. ברכישת תמונה, אי יציבות או "הבהוב" בעוצמת האור של מנורת התאורה אפינפרין או מתאורת השטח בחדר המיקרוסקופ יכול להתרחש. מכל מקור, פסים בהירים/כהים לאורך זמן עם תקופת ההבהוב מופיע בזווית אפס ב-kymographs. אם שיא זווית אפס הוא השיא העיקרי, אז גם אם את הזווית המיוצר על ידי תנועה של תאי הדם האדומים דרך הכלי שבו מהירות הזרימה נמדד ברור לעין האנושית, תוסף הכיווניות מתאים עיקול לשיא אפס ודוחות ערך מאוד קרוב אפס מעלות, כתוצאה מדידות מהירות כי הם גבוהים ביותר. גם אם שיא האפס-זווית אינו השיא העיקרי, הוא ישפיע על עקומת הכיווניות, כך שהמהירות המדווחת משתנה לערך גבוה יותר. כדי לטפל בבעיה זו, הצוות מספק אפשרות "תיקון הבהוב" המתעלמת מזוויות שיא המתרחשות ב-0 °. שינוי זה חיסל את ההשפעות של הבהוב המנורה מבלי להשפיע על כימות מהירות.

המגבלה העיקרית של קבלת מהירויות זרימה בעזרת מיקרוסקופ השטח היא שרכישת התמונה מוגבלת להכנות דקות כגון ויטלטורה, או כלי הקיבול הפנימי או השכבות השטוליות של האברים כגון כבד או כליה. שיכולה להיות מתחת לפני המוות

יתרון משמעותי של שימוש בצוות על שיטות הקיימות של כימות הזרימה הוא שהוא מאפשר זיהוי מהיר ובלתי משוחד של דפוסי זרימה מרחביים וזמני של זרימת כלי הדם. איסוף וניתוח של נתוני זרימה מיקרוכלי באמצעות מערכות סריקת רסטר מוגבלות בדרך כלל למדידות של משתמש יחיד נימים שנבחרו בכל פעם20,21,22,23. שיטות קיימות כדי לחלץ מהירויות זרימה על פני שדות24,25,26, אולם אף אחת מגישות אלה אינה תומכת בניתוח בכל השדות ובכל התחומים המחייבים עבודה. באמצעות צוות, ניתוח של כל קטע נימי לאורך זמן על פני כל שדה התמונה של ערכת נתונים עם עשרות אלפי תמונות ניתן להשיג בתוך יום. ניתוח ידני אפילו של ערכת נתונים אחת של זרימת כלי דם בשדה מלא ייקח חודשים עד שנים. לפיכך, ניתוח ידני אינו מעשי אפילו לאפיון של זרימה נורמלית וברור שאינו מתיר השוואה בין קבוצות טיפול מרובות.

הקלות של כימות הצוות של הניתוח הזמני של זרימת כלי הדם מספק את ההזדמנות למשתמשים עתידיים לקשר תצפיות מורפולוגיים כלי הדם להשפעות על מהירות זרימת נימי המהירות. על ידי הגדרת מערכת היחסים בין מורפולוגיה כלי הדם של מדדי הספינה וטופולוגיית הרשת כדי להזרים מהירות הדפוס נוכל לאחר מכן נוכל לחזות דפוסי זרימה מתוך מורפולוגיה כלי הדם. באופן דומה, הקשורות לזרימת כלי הדם ומורפולוגיה של כלי הדם עם אירועים כגון עיתוי, לוקליזציה והיקף של חדירת תאים חיסוניים, פגיעה ברקמות מחשיפה או מחלה של רעילות, או מעמד של הובלה תאיים, לא רק לתת לנו הבנה טובה יותר של מרכז הזרימה ותפקוד הסלולר בבריאות ומחלות, אך גם יספק מסגרת לזיהוי תרחישים פתופסלוגיים מזיקים במיוחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מדווחים על אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

מחקרים שהוצגו כאן היו נתמכים על ידי מימון המכון הלאומי לבריאות (NIH U01 GM111243 ו NIH NIDDK P30 DK079312). לימודי המיקרוסקופיה שנערכו במרכז אינדיאנה למיקרוסקופיה ביולוגית. אנו מודים לדוקטור מלגורזאטה קמיקל לקבלת סיוע טכני עם מיקרוסקופ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#5 forceps Fine Science Tools 11251-20 Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice Jackson Labs male 9-12 weeks old
Cannula Instech BTPE-10 Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches
CMOS camera Hamamatsu C11440-42U30 4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish Electron Microscopy Sciences WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran Thermo Fisher, Invitrogen D1822 Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge Fisher 22-415-504 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad Reptitherm RH-4 between mouse and stage
Heating pad Sunbeam 000732-500-000U over mouse
Inverted epifluorescence microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver Braun Aesculap GT420
Isofluorane Abbott GmbH PZN4831850
Luer stub adapter Fisher 14-826-19E Catheter adapter
Micro scissors Castro Viejo
Microscope objective Nikon Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle Fisher 30 G x1/2"
Needle holder Olsen-Hegar
Objective heater BioScience Tools MTC-HLS-025 Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer Braintree Scientific, INC TH-5A Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string Harvard Bioscience 723288 silk black suture, 6-0, spool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 153 נימי הומודינמיקה מיקרוסקופ אינניטל מיקרונימי מהירות תא דם אדום מיקרובילטורה
אנליזה מרחבית של תזרים שדות במיקרוvasקובלטורה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clendenon, S. G., Fu, X., Von Hoene, … More

Clendenon, S. G., Fu, X., Von Hoene, R. A., Clendenon, J. L., Sluka, J. P., Winfree, S., Mang, H., Martinez, M., Filson, A., Klaunig, J. E., Glazier, J. A., Dunn, K. W. Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature. J. Vis. Exp. (153), e60493, doi:10.3791/60493 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter