Summary
För att kvantifiera mikrovaskulära flödet från hög hastighet kapillär flöde bildsekvenser, vi utvecklade personal (spatial temporal analys av Fieldwise Flow) programvara. I hela bildfältet och över tid utvärderar personal flödeshastigheter och skapar en sekvens av färgkodade rumsliga mappningar för visualisering och tabellutdata för kvantitativa analyser.
Abstract
Förändringar i blodflödet hastighet och fördelning är avgörande för att upprätthålla vävnad och organ perfusion som svar på varierande cellulära behov. Vidare kan uppkomsten av defekter i mikrocirkulationen vara en primär indikator i utvecklingen av flera patologier. Framsteg inom optisk avbildning har gjort intravital mikroskopi (IVM) ett praktiskt tillvägagångssätt, vilket möjliggör avbildning på den cellulära och subcellulära nivå i levande djur vid hög hastighet över tid. Men, trots vikten av att upprätthålla adekvat vävnad perfusion, rumsliga och temporala variationer i kapillärflöde är sällan dokumenterat. I standardmetoden väljs ett litet antal kapillärsegment för avbildning under en begränsad tid. För att utförligt kvantifiera kapillärflödet i en opartisk sätt vi utvecklat spatial temporal analys av Fieldwise Flow (personal), ett makro för FIJI öppen källkod bildanalysprogram vara. Med hjälp av hög hastighet bildsekvenser av hela fält av blodflödet inom kapillärer, personal producerar bilder som representerar rörelse över tiden kallas kymographs för varje tidsintervall för varje vaskulär segment. Från kymographs personal beräknar hastigheter från det avstånd som röda blodkroppar rör sig över tiden, och matar ut hastighetsdata som en sekvens av färgkodade rumsliga kartor för visualisering och tabellutdata för kvantitativa analyser. I normal mus lever, personal analyser kvantifierade djupgående skillnader i flödet hastighet mellan pericentral och periportal regioner inom lobules. Ännu mer oväntade är skillnaderna i flödeshastighet ses mellan sinusoider som är sida vid sida och variationer ses inom enskilda vaskulära segment över sekunder. PERSONAL är ett kraftfullt nytt verktyg som kan ge nya insikter genom att möjliggöra mätning av den komplexa spatiotemporal dynamiken i kapillärflödet.
Introduction
Mikrovaskulaturen spelar en avgörande roll i fysiologi, vilket säkerställer effektiv perfusion av vävnader under förändrade förhållanden. Microvascular dysfunktion är förknippad med otaliga villkor inklusive långsiktig kardiovaskulär morbiditet och dödlighet, utveckling av demens, och sjukdom av både lever och njure och därmed är en viktig faktor i ett brett spektrum av biomedicinska undersökningar1,2,3,4,5. Medan flera tekniker har använts för att utvärdera vävnad perfusion, endast intravital mikroskopi möjliggör datainsamling vid den temporala och rumsliga upplösning som krävs för att karakterisera blodflödet på nivån för enskilda kapillärer.
Mikrovaskulära flödet kan visualiseras i fluorescens mikroskopi antingen genom förflyttning av fluorescerande mikrosfärer eller genom förflyttning av röda blodkroppar mot bakgrund av membran-oreglerade fluorescerande markörer (t. ex., fluorescently-märkt dextran eller albumin)6,7. Mikrovaskulära flödet kan avbildas i ytliga cellskikt med hjälp av widefield mikroskopi, eller på djupet med antingen konfokal eller multiphoton mikroskopi. Kapillärflödet är dock sådant att passage av röda blodkroppar i allmänhet inte kan fångas i hastigheter mindre än 60 frames/s. Eftersom de flesta laserskanning konfokala och multiphoton Mikroskop kräver 1-5 s för att skanna en hel bild fält, kan denna hastighet i allmänhet endast åstadkommas genom att begränsa synfält, ibland till en enda scan linje8. Processen för att begränsa mätningar till utvalda kapillärsegment (1) har potential att införa val bias och (2) gör det omöjligt att fånga rumsliga och temporala heterogenitet i de satser av kapillär blodflödet. Bilder av kapillärnät kan däremot samlas in i hastigheter över 100 fps med hjälp av widefield digitala Mikroskop utrustade med vetenskapliga komplementära metalloxid halvledare (sCMOS) kameror9,10. Dessa billiga system, vanligt i typiska biomedicinska laboratorier gör det möjligt att bilden mikrovaskulära flödet över hela tvådimensionella nätverk, i huvudsak kontinuerligt. Problemet blir då en av att hitta en analysmetod som kan utvinna meningsfulla kvantitativa data från den massiva och komplexa bild dataset som genereras av Höghastighetsvideo mikroskopi.
För att möjliggöra analys av full-Field Flow data vi har utvecklat personal, ny bildanalysprogram vara som kontinuerligt kan mäta mikrovaskulära flödet i hela mikroskopfält av bildserie som samlats in vid hög hastighet11. Tillvägagångssättet är förenligt med en mängd olika experimentella system och Imaging modaliteter och personal bildanalysprogram implementeras som ett makro verktygsuppsättning för FIJI genomförandet av ImageJ12. Den bakomliggande princip som används här för att visualisera mikrovaskulära Flow är att först, viss kontrast måste ges för att kunna bild de röda blodkropparna i kapillärerna. I våra studier, kontrast tillhandahålls av en bulk fluorescerande sond som utesluts av de röda blodkropparna. Hastigheten av flödet kan sedan kvantifieras från förskjutningen av de röda blodkropparna som visas som en negativ fläck inom fluorescerande märkta plasma i bilder som samlats in med hög hastighet från ett levande djur8. Vi använder sedan personal för att göra tomter på avstånd längs varje kapillär segment över flera tidsintervall av tid som kallas kymographs, sedan upptäcka backarna som finns i kymographs13, och från dessa sluttningar beräkna frekvensen av mikrovaskulära flödet. Tillvägagångssättet kan tillämpas på bilder som samlats in från någon kapillär säng som kan nås för avbildning. Här beskriver vi tillämpningen av IVM och personal till studier av blodflödet i levern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och genomfördes enligt den institutionella djuromsorg och användning kommittén riktlinjer för Indiana University, och anslutit sig till NRC guide för vård och användning av djur.
1. kirurgisk förberedelse för Intravital mikroskopi
Anmärkning: Detta är inte en överlevnads operation. När avsnitt 1 "kirurgisk förberedelse för intravital mikroskopi" påbörjas kan arbetet inte pausas förrän avsnitt 2 "Intravital mikroskopi" har slutförts.
- Acklimatisera 9 – 10 veckor gamla manliga C57BL/6 möss, i minst 4 dagar och snabb för 16 h före studierna.
- Väg djuret, stillsam med 5% isofluran och placera på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen. Använd ett syre flöde på 1 – 2 L/min och behåll sedering med 1-2% isofluran. Kontrollera reflexer från tå nypa. Övervaka temperaturen med en rektaltermometer. Övervaka hjärtfrekvens och andning visuellt.
- När anestesi är stabil, raka området för våldsam attack kanylering placering och området under bröstkorgen för exponering av levern.
-
För våldsam attack kanylering, gör en 1 cm vänster ventrala snitt 1 – 2 cm under musens käke. Rensa bort allt fett och fascia som omger halsvenen. Binda av den främre änden av våldsam attack med 06 suturen sträng för att förhindra blödning.
- Gör en liten nick i halsvenen och skjut kanylen (30 G x 1/2 i, nål), nål hållare och polyeten slangar (0,011 x 0,024 inches2 bifogas en Luer stub-adapter och fylld med 0,9% saltlösning) i ca 1 cm, och säkra i den bakre änden av våldsam attack med 0-6 sutur String.
- Med hjälp av våldsam attack kanyl leverera 70 kDa fluorescein dextran (till en dos av 30 mg/kg via injektion av 0,1 ml av en 9 mg/ml lösning i Saline).
- Exponera levern för avbildning genom att göra en 4-6 cm snitt över bålen, 1 – 2 cm under mitten av bröstkorgen.
- Placera en våt (indränkt i 0,9% saltlösning) 2 x 2 inches2 gasbinda svamp under den vänstra laterala leverlob. Placera tejpen i utkanten av Glasfönstret på en 40 mm täckglasbottnad skål och applicera cyanoakrylatlim på tejpen. Tryck på glasplattan till levern och använda bomull tippade applikatorer tryck på gasbinda i limmet på bandet för att minimera vävnad rörelse för mikroskopi.
- Flytta djur till mikroskopet skede. Tillsätt steril 0,9% saltlösning i den täckglasbottnade skålen för att hålla levern fuktig under hela bildsessionen. Bibehålla temperaturen vid 36 – 37 ° c via värmedynor monterade på scenen, en värmedyna placerad över djuret och en objektiv värmare.
2. intravital mikroskopi
- Utför intravital mikroskopi på ett inverterat epifluorescensmikroskop utrustat med en videokamera som kan ta bilder med hög hastighet.
Anmärkning: Här, en Xenon Arc lampa, fluorescein-specifik excitation (480-500 Nm) och emission (507-543 nm) filter, plan fluor 20x, N.A. 0,75 vatten nedsänkning mål, och en hög hastighet sCMOS kamera användes. - Välj intresseområde för kapillärblodflödesanalys med minimal belysning.
- Ställ in exponeringstiden tillräckligt kort för att kameran ska kunna förvärva 100 fps. Ställ in belysningsnivån att tydligt visualisera röda blodkroppar skuggor och topologin av kärl och samtidigt undvika fototoxicitet och photoblekning av fluorescerande sond.
- Samla bilder med en hastighet av 100 fps. Ställ in kamerans Pixel upplösning mellan ~ 0,65 och ~ 1,3 μm/pixel. Ställ in ramstorlek mellan 512 x 512 och 1024 x 1024 pixlar. Ställ in bitdjup mellan 8 och 16 bitar. Använd den högsta upplösningen, ramstorlek och bitdjup som fortfarande tillåter 100 fps Bildinsamling på systemet.
- Spara Time Series-fil (er) som en sekvens av TIF-filer eller som infödda kamera/Mikroskop format om bio-format14 i Fiji kan öppna de ursprungliga formatfilerna.
- Bild flera områden över tid. Håll musen på mikroskopet scenen för upp till 2 h. euthanize musen i slutet av Imaging.
Anmärkning: Varaktigheten av tidsserierna kommer att baseras på balansera behovet av att bilden för ett tidsintervall som omfamnar variationen, samtidigt som inte påverkar livskraften i vävnaden. Tidsseriens varaktighet kan också dikteras av överväganden om filstorlek. en 1 min tidsserie 1024 x 1024 pixel 16-bitars bilder som samlats in på 100 FPS kommer att generera en fil som är 12 GB i storlek. Fil storleks överväganden kan också diktera ramstorlek och bitdjup som används. Det finns inga uttryckliga storleksbegränsningar inom personalen.
3. definiera det vaskulära nätverket med TrakEM2 i FIJI
Anmärkning: Protokollet kan pausas efter att ha sparat arbete vid någon punkt i avsnitt 3.
- Ladda ner och installera FIJI från https://imagej.net/Fiji/Downloads.
Anmärkning: Version 1,51 n av Fiji användes för detta projekt, och kan laddas ner från https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Observera att i Windows, FIJI bör installeras i användarutrymmet och inte i programfiler. - Öppna filmfilen i FIJI med fil > Öppna eller använda fil > Importera > bildsekvens. Välj en enda bild från stabila bilder mellan respirationer där topologin av det vaskulära nätverket är lätt att se. Välj bild > duplicera och duplicera den valda enskilda bilden (inte stacken) och spara bilden i en ny mapp. Ta inte med mellanslag i fil-eller mappnamn.
- Skapa ett nytt tomt TrakEM2-projekt genom att välja arkiv > ny > TrakEM2 (tom). Välj den nya mappen som innehåller den enda bilden från filmen som projektmapp. TrakEM2 Windows öppnas.
- Högerklicka på huvudarbetsområdet och välj importera > Importera bild. Navigera till den enda bild som sparats i steg 3,3 och välj den.
- Högerklicka i huvudarbetsområdet igen och välj visa ≫ ändra storlek på canvas/Layer setautomatiskt. Vänsterklicka i huvudfönstret arbete. Bilden kommer att fylla arbetsområdet.
- För att välja de områden i bilden som innehåller det vaskulära nätverket, inställnings områdes lista urval i TrakEM2. I det mindre TrakEM2 fönstret (mall, projektobjekt, lager) högerklickar du på "• Anything". Välj Lägg till ny underordnad > områdes lista.
- I fönstret mindre TrakEM2 drar du "mall > något" till "projektobjekt > projekt". Dra sedan "mall > något > • områdes lista" till "projektobjekt > projekt > något". Under "projektobjekt > projekt > något", • områdes lista kommer nu att vara närvarande.
- I huvudfönstret TrakEM2 under fliken Z-utrymmeskapades ett fält med etiketten områdes lista. Klicka för att markera den. I huvudfönstret TrakEM2 väljer du även penselverktyget. Tryck på SKIFT och Rulla mushjulet för att välja en lämplig storlek för pensel, t. ex., mindre än diametern på vaskulaturen. För att spara TrakEM2 setup tryck Control + S tangenter.
- Måla vaskulära nätverket med hjälp av penselverktyget. Om du vill radera håll ned Alt medan du använder penselverktyget. Inkludera inte regioner utanför fokus. Spara ofta med CTRL + S.
- När märkning av vaskulära nätverket är klar, högerklicka i huvudfönstret TrakEM2 och välj exportera ≫ arealists som etiketter (TIF). I popup-fönstret väljer skala 100% och Exportera alla områdes lista. Stäng TrakEM2 Windows och välj Ja för Spara projekt.
- Bilden av AreaLists öppnas och kan visas som en tom svart bild. I de viktigaste FIJI menyn Välj bild > Justera ≫ ljusstyrka/kontrast. I B & C fönstret tryck på Auto-knappen och arealist kommer att bli synlig. I de viktigaste FIJI menyn Välj bild > uppslags tabeller > Invertera lut. Spara den här bilden av svarta etiketter på vit bakgrund och Stäng bilden.
- Öppna etikettfilen i FIJI. Välj Plugins > skelett > skeletonize. Spara den skeletterad bilden som en TIF. Använd filen Skeleton. tif som en av de indatafiler som behövs för att köra analys av personal flöde. När du sparar filen ska du inte använda blanksteg i filnamn.
- Redigera skelett filen manuellt efter behov genom att placera en lucka (med hjälp av färg verktyget) i linje ritningen, till exempel på platser där grenar i vaskulaturen inte har fångats eftersom de går ut ur bildplanet.
4. Förbered filmsekvensen för personalanalys
- Öppna filmfilen i FIJI med fil > öppna eller fil > Importera > bildsekvens. Välj en tidsperiod för bildsekvensen för Flödesanalys (kan vara sekunder till minuter, hundratals till tiotusentals ramar) där vävnads positionen har varit stabil över tid, utom under andningen.
- Välj bild > duplicera och duplicera den valda delen av sekvensen genom att skriva in siffrorna i början och slutet ramar. Kontrollera bildens rumsliga och temporala kalibrering under bild > Egenskaper och korrigera vid behov. Spara bildfilen som en TIF (eller som en okomprimerad AVI). Den här filmen. tif behövs som en indatafil för att köra personalanalys. Ta inte med mellanslag i filnamnet.
5. Installera personal makron i FIJI
Obs: (viktigt) flera mappar inom Fiji mappen underkataloger har liknande filnamn, några kapitaliserade, vissa inte. Var säker på att rätt mappar väljs vid installation av personal.
- Ladda ner personal makron från https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
-
För att installera, först öppna FIJI mappen.
- På Windows hitta den mapp där FIJI är installerat i användarutrymmet, oftast på skrivbordet. På MacOS hitta FIJI-ikonen i mappen program, högerklicka och välj Öppna.
- I FIJI-mappen öppnar du mappen plugins. I mappen plugins öppnar du mappen makron. Kopiera personal. IJM i denna makron mapp: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
- I FIJI-mappen öppnar du mappen plugins. Kopiera STAFF_Dir. jar i denna plugins mapp: Fiji\plugins\ STAFF_Dir. jar.
- I FIJI-mappen öppnar du mappen makron. I den här makron-mappen öppnar du AutoRun-mappen. Kopiera STAFF_Loader. IJM till denna AutoRun mapp: Fiji\macros\AutoRun\ STAFF_Loader. IJM.
- Starta FIJI och kontrollera makro installationen. Kontrollera installationen genom att välja plugin -program > makron. När den nedrullningsbara menyn är korrekt installerad kommer att innehålla: öppna-skapa projekt, analysera skelett, redigera tidsintervall, analysera flöde och producera spatial karta.
- Om dessa kommandon inte finns i makron-menyn, Välj Plugins > makron > Installera, öppna mappen FIJI\PLUGINS\MACROS, Välj personal. IJM-filen och klicka sedan på OK knapp. Kommandona ska nu visas i menyn plugin -program > makron .
6. kvantifiera vaskulär flöde med hjälp av personal
- Skapa ett nytt projekt.
- Välj plugin -program > makron ≫ Öppna-skapa projekt och följ anvisningarna för att skapa eller uppdatera en konfigurationsfil.
- Från Öppna-skapa projekt -menyn, navigera till och välj projektkatalogen, input File-mappen och indatafilerna Movie. tif och Skeleton. tif. Redigera de automatiskt ifyllda utdatafilnamnen om det behövs.
- Ingångsvärden för kortaste segment längd (20 μm), max hastighet mätt (2 000 μm/s) och max hastighet kartlagd (1 000 μm/s).
Anmärkning: Produkten av kortaste segment längd och bildrutor per sekund ger max flödeshastighet som teoretiskt kan mätas. De högsta kapillärflödeshastigheterna som rapporteras i litteraturen är runt 2 000 μm/s15. I levern observerade vi att kapillärflödeshastigheter i allmänhet i genomsnitt runt 300 μm/s och sällan översteg 1 000 μm/s. - Ange värdena för pixelstorlek och bildrutehastighet för bildsekvensen (från bildmetadata eller experimentella anteckningar). Dessa värden kräver indata från användaren. Kontrollera flimmer korrigering rutan om bilderna har periodiska bakgrundsintensitet flimmer.
- Välj parametrar för bästa visualisering av data. Välj max hastighet mappas för att inkludera cirka 95% av data så att data mappas över hela skalan av färgskalan. PERSONAL kartor hög hastighet extremvärden till den snabba änden av färgskalan.
- Analysera skelettet.
- Välj Plugins > makron > analysera skelett. Den Skeleton. TIF filen öppnas och regionen av intresse (ROI) Manager kommer att öppna och köra.
Anmärkning: Analysera skelett klassificerar varje pixel med antalet grannar som antingen vid en slutpunkt, vid en korsning eller inom ett segment. För varje segment registreras ett identifieringsnummer (ID-nummer), en kalibrerad grenlängd och de rumsliga koordinaterna för gren ändarna. - Vänta på att segment-ID: n ska visas på skelettet, segmentlistan ska visas i ROI-hanteraren och en popup som anger att ROI-hanterarens fil för skelettet sparas. Klicka på OK.
- Kontrollera att mellan andningsrörelser, skelettet förblir över där röda blodkroppar passerar genom kapillär (t. ex., inte kanten och inte utanför kapillär). Visa de märkta segmenten som ett överlägg på filmen genom att öppna filmfilen och sedan dra ROI-zip-filen till den öppna filmen. Spela upp filmen med segmenten överlagda.
- Välj Plugins > makron > analysera skelett. Den Skeleton. TIF filen öppnas och regionen av intresse (ROI) Manager kommer att öppna och köra.
- Välj tidsintervall.
- Välj insticksmoduler > makron > Välj tidsintervall . Vänta medan makrot genererar en kymograph från ett enda segment över den totala tiden för filmen. Från den här kymograph väljer användaren tidsintervall för analys. Använd CTRL + + tangenter för att öka storleken på kymograph om det behövs.
- Verktyget för rektangelmarkering aktiveras automatiskt. Rita en rektangel runt varje tidsintervall. En bra utgångspunkt för tidsintervall är intervallet 1 – 2 s mellan respirationerna, som är uppenbara som horisontella suddiga områden i kymografen.
- Klicka på T -tangenten eller knappen Lägg till i Roi-hanteraren för att registrera val av tidsintervall. Upprepa för så många tidsintervall som önskas. Gör val sekventiellt från toppen (eller vänster) till botten (eller höger) av kymograph.
- Utvärdera parameterval (från Open-Create-projekt) genom att välja ett litet antal tidsintervall (3 till 4) och slutföra analys för just dessa intervall, eftersom analysera flöde (nästa steg) kan ta timmar för stora datauppsättningar.
- Klicka på OK i fönstret gör en ROI för varje tidsintervall när du är klar. Ett popup-fönster visas när de valda intervallen har sparats i projektmappen. Klicka på OK.
- Analysera flöde.
- Välj plugin -program > makron > analysera flöde och dialogrutan analysera flödes parametrar öppnas och visar de värden som angetts i steget öppna-skapa projekt. Redigera vid behov och klicka sedan på OK.
- Dialogrutan utdatafilnamn öppnas och visar de namn som har angetts i steget öppna-skapa projekt. Redigera vid behov och klicka sedan på OK.
- En dialogruta öppnas där du tillfrågas om användaren är redo att påbörja analysen. Klicka på OK och analysen börjar. Vänta tills en dialogruta öppnas som anger när flödesanalysen är slutförd.
Anmärkning: Tid som behövs beror på processorhastigheten och storleken på datauppsättningen. - Bekräfta att resultatfiler har lagrats som CSV-format kalkylbladsfiler i projektmappen.
Anmärkning: Utdatafiler inkluderar: segment_velocities. csv innehåller hastighetsvärden som har positiva och negativa värden som indikerar flödesriktning. Celler som representerar segment som är mindre än den minsta längden innehåller texten kort. Celler med hastighetsvärden som är större än den maximala uppmätta hastigheten innehåller texten ut (för avvikare). kym_ang. csv innehåller kymograph vinklar mätt med Directionality plugin i Fiji. good_fit. csv innehåller godhet av passform av en kurva till fördelningen av vinklar mätt från varje kymograph. Stackars godhet Fit (< 0,8) kan indikera dolda gren punkter i ett segment, förändring i hastighet under tidsintervall, lampa eller rum ljus flimmer. - Kontrollera att segment_velocities. csv innehåller få ut värden. Om det finns ett stort antal ut värden, kontrollera att minsta segment längd att analysera är inte mindre än 15 – 20 μm, sedan köra analysera flödet. Om den nya segment_velocities. csv fortfarande innehåller en stor andel av ut värden, kontrollera sedan den flimmer korrigering rutan och kör sedan analysera flödet.
- Producera rumsliga kartor.
- Välj plugin -program > makron > skapa spatial karta och fönstret spatialkartparametrar öppnas och visar de värden som angetts i steget öppna-skapa projekt. Redigera om det behövs eller Fortsätt genom att välja OK.
- Titta på som en temporala sekvens av rumsliga kartor över flödeshastigheter genereras med färg som indikerar flödeshastighet. Utdata är i form av en TIF-bildstack med en bild för varje tidsintervall. Bläddra genom TIF-stacken för att visualisera rumsliga och temporala variationer i flödet. Spara stacken som en AVI-fil (okomprimerad för maximal bärbarhet) att dela som en film.
7. kvantitativ analys med hjälp av personalens resultat
- Öppna filen segment_velocities. csv i ett kalkylblads-eller statistik analysprogram. Dessa värden har positiva eller negativa tecken som anger riktningen för flödet i förhållande till start/stopp-punkter för det segmentet (som registrerats i segmentet ROI-fil).
- Skapa en ny kalkylblads sida med absoluta värden för alla hastighetsvärden. Använd dessa värden för att beräkna den totala genomsnittliga flödeshastigheten, genomsnittlig flödeshastighet för alla vaskulära segment över tid, flödeshastighet för varje vaskulär segment över tiden, och göra histogram av hastighets fördelningar.
- Beräkna värden runt specifika morfologiska regioner eller andra regioner av intresse genom att först hitta de specifika relevanta segmenten i det märkta skelettet och sedan utföra analyser på dessa utvalda segment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Personalanalys genererar en fullständig inventering av mikrovaskulära hastigheter över hela mikroskopfält över tidsperioder som sträcker sig från sekunder till minuter. Representativa resultat presenteras i figur 1, figur 2, figur 3och figur 4. Figur 1 visar ett exempel på en tidsserie av mikrovaskulära nätverket i levern av en mus, generering av skeletterad bilden som används för att definiera axeln av mikrovaskulära flödet, och den personalgenererade karta över enskilda vaskulära segment som identifierats för kvantifiering. Personal använder sedan skeletterad bilden för att bryta mikrovaskulära nätverket ner i enskilda segment, sedan genererar bilder av kymographs för varje segment. Dessa avbildningar tillhandahålls användaren, tillsammans med verktyg för att identifiera de tidsintervall som ska användas för kymograph-analys (figur 2). Personalen använder sedan skelettet, och de tidsintervaller som användaren har levererat för att bryta kymografen för varje segment i individuella segment tidsintervall. Personalen identifierar sedan den dominerande vinkeln i kymograph från varje segment tidsintervall och ger hastighetsmätningar som. csv-datafiler (figur 3) och i form av staplar med färgkodade hastighets kartbilder (figur 4). För att stödja utforskning av dataanalys pipeline, personal tillhandahåller också. csv-filer som innehåller alla kymograph vinkel mätningar och godhet-of-Fit värden.
Figur 1: generera vaskulära skelettet. (A) original bild av en enda bildruta från tidsserie bilder som samlats in från levern av en levande mus. Skalstapel = 100 μm. (B) bild som visas i panel A med centrala vener (CV) och Portal triader (PT) indicerat, för att identifiera huvudriktningar av sinuskurva flöde. (C) bild från panel A med överlagring av TrakEM2 segmentering av sinusoids. (D) binär bild av TrakEM2 segmentering. (E) skeletonization av TrakEM2 segmentering. F) personalens utgångs bild av enskilda vaskulära segment med etiketter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kymograph-analys. A) förstorade bilder av vaskulära segmentsomvisas i figur 1f. B) typisk kymograf från ett segment som samlats in under två interrespiratoriska tidsintervall. Perioder av andning noteras med pilar. C) kymografer för segmenten 240, 252 och 254 från panel A. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: analys av hastighetsdata. (a, B) Tabeller över hastighetsmätningar av fyra segment över 19 tidsintervall, uttryckta antingen som hastighet med riktning (a) eller som absolut hastighet (B). (C) histogram som visar fördelningen av absoluta hastighetsvärden över hela fältet under hela 20-års perioden. (D) diagram över hastigheter för de tre segmenten vars kymografer visas i figur 2C under hela 20 s-perioden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: hastighets karta. A) personalensutgångs bild av den färgkodade hastighets kartan under ett enstaka tidsintervall för det fält som visas i figur 1. (B) sammansatt av hastighets kartor för alla tidsintervall som presenteras som en 3D-volym. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera kritiska steg i det här protokollet. Första, minimering av rörelse under intravital avbildning av levern är viktigt för att generera filmer som är användbara för kapillärflöde analys med hjälp av personal. På grund av närheten av membranet, korta perioder av andning-inducerad rörelse inträffar, med säkrade levern återvänder till sitt ursprungliga läge efter varje andetag. Att säkra den kirurgiskt exponerade levern mot täckglasbottnad skålen med hjälp av gasväv, sedan Imaging underifrån med ett inverterat Mikroskop tjänar till att immobilisera orgeln mellan respirationer16,17,18,19. För det andra är en bild förvärvs hastighet på 100 fps rekommenderas starkt eftersom hastigheten på flödet som kan mätas är en funktion av hastigheten på bild förvärv och den minsta längden på de segment där flödet mäts11. För det tredje, producerar ett högkvalitativt skelett, linjen ritning representation av vaskulära nätverket, är nästa kritiska steg för att få kapillärflöde hastigheter med hjälp av personal. Skelett linjesegment bör ligga nära mittpunkten av kärlteckning mellan respirationer över tiden kursen analyseras och vaskulär förgrening ur bilden planet bör identifieras. Platserna för dessa dolda grenar längs ett vaskulärt segment kan härledas genom att titta på filmen, genom att undersöka kymograph eller undersöka hastighetsvärden över tid för det segmentet. Titta på filmen, dessa vaskulära segment ses antingen som har dubbelriktad flöde, utgår från eller konvergerar mot platsen för den osynliga grenen, eller som har en plötslig förändring i flödeshastighet vid den punkten längs vaskulära segmentet. Placeringen av dolda gren punkter kan identifieras i kymographs som platsen för en förändring i vinkeln som produceras av förändringen i flödesriktningen eller hastighet. I kalkylbladet kan vaskulära segment med dolda förgrenings platser ändra riktning (tecken) eller växla mellan värdena för de två bidragande segmenten. Om tidsserien innehåller för många förgrenings punkter som är utanför bildplanet, bör personalanalys upprepas efter manuell redigering av skelettet, genom att placera ett mellanrum (med hjälp av målarverktyget) i linje ritningen på platserna för de missade gren punkterna.
Vi avslöjade en gemensam fråga i bild förvärv som vanligtvis går obemärkt men hade en stark effekt på att mäta flödeshastigheter med hjälp av personal. Vid bild förvärv kan instabilitet eller "flimmer" i intensiteten hos EPI-belysningslampa ljuskälla eller från området belysning i Mikroskop rummet förekomma. Från endera källa, ljus/mörk banding över tid med tiden om flisa inträffa på noll vinkel i kymographs. Om Zero Angle Peak är den största toppen, då även om vinkeln som produceras av rörelse av röda blodkroppar genom kärlet där flödeshastigheten mäts är uppenbar för det mänskliga ögat, riktningen plugin passar en kurva till Zero Peak och rapporterar ett värde mycket nära noll grader, vilket resulterar i hastighetsmätningar som är orealistiskt höga. Även om noll-vinkel topp är inte den största toppen, kommer det att påverka riktningen kurvan passar så att den hastighet som rapporteras förskjuts mot ett högre värde. För att lösa detta problem, ger personalen en "flimmer korrigering" alternativ som ignorerar topp vinklar som inträffar vid 0 °. Denna modifiering eliminerade effekterna av lampflimmer utan att påverka hastighetskvantifikationer.
Den största begränsningen för att erhålla flödeshastigheter med hjälp av widefield-mikroskopi är att bild förvärvet är begränsat till tunna preparat som mesenterisk vasulatur, eller sebrafish intersegmentär kärl eller ytliga lager av organ som lever eller njure som kan exteriorized.
En betydande fördel med att använda personal över befintliga metoder för flödes kvantifiering är att det möjliggör snabb och opartisk detektion av rumsliga och temporala mönster av vaskulära flödet. Insamling och analys av mikrovaskulära Flow data med raster scanning system är i allmänhet begränsade till mätningar av enskilda användare utvalda kapillärer vid en tidpunkt20,21,22,23. Det finns metoder för att extrahera flödeshastigheter över fält24,25,26, men ingen av dessa metoder stöder analys över hela fält och alla är arbetsintensiva. Med hjälp av personal, analys av varje kapillärsegment över tiden över hela bildfält i en datauppsättning med tiotusentals bilder kan åstadkommas inom en dag. Manuell analys av även en enda datauppsättning av full-Field vaskulär flöde skulle ta månader till år. Således är manuell analys opraktiskt även för karakterisering av normalt flöde och uppenbarligen inte tillåter jämförelse av flera behandlingsgrupper.
Den lätthet av personal kvantifiering av spatiotemporal mönning av vaskulär flöde ger möjlighet för framtida användare att länka vaskulära morfologiska observationer till effekter på kapillär flöde hastighet mönkning. Genom att definiera förhållandet mellan de vaskulära morfologiska åtgärder av fartygs diameter och nätverkstopologin till flöde hastighet mönstrar vi kan då kunna förutsäga flödesmönster från vaskulär morfologi. På samma sätt korrelera vaskulär flödesmönster och vaskulär morfologi med händelser såsom timing, lokalisering och omfattningen av immun cell infiltration, vävnadsskada från toxiskt exponering eller sjukdom, eller status av intracellulär transport, skulle inte bara ge oss en bättre förståelse för flödesmönster och cellulär funktion i hälsa och sjukdom, men skulle också ge en ram för att identifiera särskilt skadliga patofysiologiska scenarier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Studier som presenteras här stöddes av finansiering från National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 och NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital mikroskopi studier utfördes vid Indiana centrum för biologisk mikroskopi. Vi tackar Dr Malgorzata Kamocka för teknisk assistans med mikroskopi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing 0.011 x 0.024 inches |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2x2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 G x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
