Det første skridt i at forstå biomolekyle-uorganisk fast fase interaktion afslører grundlæggende fysisk-kemiske konstanter, der kan evalueres ved at etablere adsorption isotermer. Adsorption fra væskefasen begrænses af kinetik, overfladekapacitet, pH og konkurrencedygtig adsorption, som alle bør overvejes med forsigtighed, før der angives et adsorptionseksperiment.
Grundlæggende elementer i uorganisk-organiske interaktioner er af afgørende betydning for opdagelsen og udviklingen af nye biogrænseflader, der kan udnyttes i bioteknologi og medicin. Nylige undersøgelser tyder på, at proteiner interagerer med overflader gennem begrænsede adsorptionssteder. Proteinfragmenter som aminosyrer og peptider kan bruges til interaktionsmodellering mellem komplekse biologiske makromolekyler og uorganiske overflader. I løbet af de sidste tre årtier er der udviklet mange gyldige og følsomme metoder til at måle de grundlæggende fysiske kemiforhold i disse interaktioner: isotermisk titreringskatotri (ITC), overfladeplasmonresonans (SPR), kvartskrystalmikrobalance (QCM), total intern refleksionsfluorescens (TIRF) og svækket total reflektorspektroskopi (ATR).
Den enkleste og mest overkommelige teknik til måling af adsorption er udtyndingsmetoden, hvor ændringen i sorbatkoncentrationen (udtynding) efter kontakt med opløsningsdispergeret sorbent beregnes og antages at være adsorberet. Adsorptionsisotermer baseret på udtyndingsdata giver alle grundlæggende fysisk-kemiske data. Adsorption fra opløsninger kræver dog længere ligevægtstider på grund af kinetiske begrænsninger og sorbenter med et højt specifikt overfladeareal, hvilket gør det næsten uanvendeligt på makroskopiske faste planoverflader. Desuden bør faktorer såsom ustabilitet af sol, nanopartikel aggregater, sorbent krystallinitet, nanopartikel størrelse sfordeling, pH af opløsningen, og konkurrence om adsorption, bør overvejes, mens de studerer adsorbing peptider. Udtømning data isotherm konstruktion giver omfattende fysisk kemi data for bogstaveligt talt hver opløselig sorbat endnu forbliver den mest tilgængelige metode, da det ikke kræver dyre opsætninger. Denne artikel beskriver en grundlæggende protokol for den eksperimentelle undersøgelse af peptid adsorption på uorganisk oxid og dækker alle kritiske punkter, der påvirker processen.
I de sidste 50 år har samspillet mellem uorganiske overflader og peptider tiltrukket en masse opmærksomhed på grund af dens store betydning inden for materialevidenskab og medicin. Biomedicinsk forskning er fokuseret på kompatibilitet og stabilitet af bioinorganiske overflader, som har direkte konsekvenser for regenerativ medicin, vævsteknik1,2,3og implantation4,5,6,7. Moderne bioresponsive anordninger, såsom sensorer og aktuatorer, er baseret på funktionelle proteiner, der er immobiliseret på oxidhalvledende overflader8,9,10,11,12,13. Moderne rensningspraksis for proteinproduktion er ofte afhængig af biomolekyleinteraktionsegenskaber i downstream-rensning og separation14.
Blandt flere uorganiske oxider er titandioxid den mest anvendte i kombination med biologisk relevante substrater15,16. Forskning inden for TiO2-baseredebiogrænseflader har koncentreret sig om at etablere en stærk og specifik binding af proteiner og peptider uden at ændre deres biologiske og strukturelle egenskaber. I sidste ende er det vigtigste mål et lag af biomolekyler med høj overfladetæthed med høj stabilitet og øget funktionalitet, som vil fremme oprettelsen af titaniumbaserede bioteknologiske og medicinske anvendelser17.
Titanium og dets legeringer har været anvendt i udstrakt grad som et kirurgisk implantat materiale i mindst seks årtier, fordi en overflade TiO2 lag med en tykkelse på et par nanometer er korrosionsbestandig og udviser en høj grad af biokompatibilitet i mange in vivo applikationer18,19,20. Titandioxid betragtes også bredt som et uorganisk substrat produceret i biomineralisering, hvor nukleation og uorganisk fasevækst ledsaget af proteiner og peptider kan give materialer med lovende katalytiske og optiske egenskaber21,22,23,24.
I betragtning af den høje relevans af samspillet mellem uorganiske materialer og biomolekyler i almindelighed og protein-TiO2 interaktioner i særdeleshed, har der været en masse forskning for at løse manipulation og kontrol af adsorption af proteiner på TiO2. På grund af disse undersøgelser, nogle grundlæggende egenskaber af denne interaktion er blevet afsløret, såsom adsorption kinetik, overfladedækning, og biomolekyle kropsbygning, hvilket giver betydelig støtte til yderligere fremskridt i biogrænseflader5,13.
Men protein kompleksitet tilføjer betydelige begrænsninger på fuld bestemmelse og forståelse af et proteins molekylære niveau interaktion med uorganiske overflader. Antages det, at biomolekyler ne interagerer med de uorganiske overflader gennem begrænsede steder, er nogle proteiner med kendte strukturer og aminosyresekvenser blevet reduceret til deres komponenter-peptider og aminosyrer, som undersøges separat. Nogle af disse peptider har vist betydelig aktivitet, hvilket gør dem til et unikt emne for adsorptionsundersøgelser uden behov for tidligere proteinseparation25,26,27,28,29,30.
Kvantitativ karakterisering af peptidadsorption på TiO2 eller andre uorganiske overflader kan opnås ved hjælp af fysiske metoder, der er blevet tilpasset specielt til biomolekyler i de sidste par årtier. Disse metoder omfatter isothermal titrering kalorimetri (ITC), overflade plasmon resonans (SPR), kvarts krystal mikrobalance (QCM), total intern refleksion fluorescens (TIRF), og svækket total reflektansspektroskopi (ATR), som alle giver mulighed for påvisning af adsorptionsstyrken ved at give centrale termodynamiske data: Den bindende konstant Gibbs, fri energi, enthalpy, og entropi31.
Adsorptionen af biomolekyler til det uorganiske materiale kan opnås på to måder: 1) ITC samt udtømningsmetoden bruger partikler, der er spredt i en opløsning, der binder sig til faste makroskopiske overflader; 2) SPR, QCM, TIRF, og ATR bruge makroskopiske overflader modificeret med uorganisk materiale, såsom guld-belagt glas eller metal chips, kvarts krystaller, zink sulfid krystaller, og PMMA chips, hhv.
Isotermisk titreringskatotri (ITC) er en etiketfri fysisk metode, der måler den varme, der produceres eller forbruges ved titrering af opløsninger eller heterogene blandinger. Følsomme kalorimetriske celler registrerer varmeeffekter så små som 100 nanojoule, hvilket gør måling af adsorptionsvarme på nanopartikeloverflader mulig. Termisk adfærd af sorbat under kontinuerlig tilsætning- titrering, giver en fuld termodynamisk profil af samspillet afslører enthalpi, bindende konstant, og entropi ved en given temperatur32,33,34,35,36.
Spektroskopi (Surface plasmon resonance) er en overfladefølsom optisk teknik baseret på måling af mediets brydningsindeks i nærheden af den undersøgte overflade. Det er en real-time og label-fri metode til overvågning reversible adsorption og adsorberet lagtykkelse. Bindingskonstanten kan beregnes ud fra tilknytnings- og dissociationsraten. Adsorptionsforsøg udført ved forskellige temperaturer kan give oplysninger om aktiveringsenergiens temperaturafhængighed og sekventialt andre termodynamiske parametre37,38,39.
Kvarts krystal mikrobalance (QCM) metode måler ændringen i oscillerende frekvens af piezoelektriske krystaller under adsorption og desorption processer. Bindingskonstanten kan evalueres ud fra forholdet mellem adsorptions- og desorptionshastighedskonstanterne. QCM anvendes til relative massemålinger og behøver derfor ingen kalibrering25,27,40. QCM anvendes til adsorption fra både gas og væske. Den flydende teknik gør det muligt at bruge QCM som analyseværktøj til at beskrive aflejring på forskelligt modificerede overflader41.
Total intern refleksion fluorescens (TIRF) er en følsom optisk interfacial teknik baseret på måling af fluorescens af adsorbere fluorophores ophidset med internt reflekterede evanescent bølger. Metoden gør det muligt at påvise fluorescerende molekyler, der dækker overfladen med tykkelser i størrelsesordenen snesevis af nanometer, hvilket er grunden til det anvendes i studiet af makromolekylær adsorption på forskellige overflader42,43. In situ-overvågning af fluorescensdynamikken ved adsorption og desorption giver adsorptionskinetik og dermed termodynamiske data42,43.
Svækket total reflektans (ATR) blev brugt af Roddick-Lanzilotta til at etablere lysin adsorption saothermer baseret på lysin spektralbands på 1.600 og 1.525 cm-1. Det er første gang, at bindingskonstanten for et peptid på TiO2 bestemmes ved hjælp af en in situ infrarød metode44. Denne teknik var effektiv til at etablere adsorptionsisotermer for polylysinpeptider45 og sure aminosyrer46.
I modsætning til ovennævnte metoder, hvor adsorptionsparameteren måles in situ, måles mængden af adsorberede biomolekyler i et konventionelt eksperiment ved koncentrationsændringen, efter at overfladen har kontaktet opløsningen. Da koncentrationen af en sorbat henfalder i langt de fleste adsorptionstilfælde, kaldes denne metode udtømningsmetoden. Koncentrationsmålinger kræver en valideret analyseanalyse, som kan være baseret på en iboende analytisk egenskab af sorbaten eller baseret på mærkningen47,,48,49,,50 eller derivatisering51,52.
Adsorptionsforsøg ved hjælp af QCM, SPR, TIRF eller ATR kræver særlig overfladeforberedelse af de chips og sensorer, der anvendes til adsorptionsundersøgelser. Forberedte overflader bør anvendes én gang og kræver ændringer ved skift af adsorbat, på grund af den uundgåelige hydrering af oxidoverfladen eller mulig chemisorption af en sorbat. Kun én prøve ad gangen kan køres ved hjælp af ITC, QCM, SPR, TIRF eller ATR, mens man i udtyndingsmetoden kan køre snesevis af prøver, for hvilke mængden kun er begrænset af termostatkapaciteten og den sorbente tilgængelighed. Dette er især vigtigt ved behandling af store prøvepartier eller biblioteker af bioaktive molekyler. Det er vigtigt, at udtømningsmetoden ikke kræver dyrt udstyr, men udelukkende en termostat.
Men på trods af dens åbenlyse fordele kræver udtyndingsmetoden komplekse proceduremæssige træk, der kan synes besværlige. Denne artikel præsenterer, hvordan man udfører en omfattende fysisk-kemisk undersøgelse af dipeptid adsorption på TiO2 ved hjælp af udtynding metode og løser spørgsmål, som forskerne kan stå over for, når de udfører relevante eksperimenter.
Adsorption fra løsninger til isotermerkonstruktion kræver længere tid til ekvilibrering på grund af kinetiske restriktioner og sorbenter med et højt specifikt overfladeareal. Desuden bør ustabilitet af sol, nanopartikel aggregater, krystallinitet, nanopartikel størrelse sfordeling, pH af opløsningen, og konkurrence om adsorption overvejes, mens adsorbing aminosyrer. Men adsorption isotherm konstruktion ved hjælp af udtynding metode forbliver den mest tilgængelige metode, fordi det ikke kræver dyre opsætninger…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet økonomisk af den russiske fond for grundforskning (Grant No. 15-03-07834-a).
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |