Studie van korte peptide adsorptie op oplossing verspreidanannnanodeeltjes met behulp van uitputting methode

Summary

De eerste stap in het begrijpen van biomolecule-anorganische vaste fase interactie is het onthullen van fundamentele fysisch-chemische constanten die kunnen worden geëvalueerd door het vaststellen van adsorptie isothermen. Adsorptie uit de vloeibare fase wordt beperkt door kinetiek, oppervlaktecapaciteit, pH en concurrerende adsorptie, die allemaal voorzichtig moeten worden overwogen voordat u een adsorptie-experiment instelt.

Abstract

Fundamenten van anorganische-organische interacties zijn van cruciaal belang bij de ontdekking en ontwikkeling van nieuwe bio-interfaces die gebruik kunnen maken in biotechnologie en geneeskunde. Recente studies geven aan dat eiwitten interageren met oppervlakken via beperkte adsorptiesites. Eiwitfragmenten zoals aminozuren en peptiden kunnen worden gebruikt voor interactiemodellering tussen complexe biologische macromoleculen en anorganische oppervlakken. In de afgelopen drie decennia zijn veel geldige en gevoelige methoden ontwikkeld om de fysische chemische fundamenten van die interacties te meten: isothermale titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), kwartskristalmicrobalans (QCM), totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) en verzwakte totale reflectantiespectroscopie (ATR).

De eenvoudigste en meest betaalbare techniek voor het meten van adsorptie is de uitputtingsmethode, waarbij de verandering in sorbaatconcentratie (uitputting) na contact met oplossingsverspreide sorbent wordt berekend en verondersteld te zijn geadsorbeerd. Adsorptieisotherms op basis van uitputtingsgegevens bieden alle basisfysisch-chemische gegevens. Echter, adsorptie van oplossingen vereist langere evenwichtstijden als gevolg van kinetische beperkingen en sorbents met een hoog specifiek oppervlak, waardoor het bijna niet van toepassing op macroscopische vaste vlak oppervlakken. Bovendien moeten factoren zoals de instabiliteit van solen, nanodeeltjesaggregaten, sorbent kristalliniteit, nanodeeltjesgrootteverdeling, pH van de oplossing en concurrentie voor adsorptie, worden overwogen tijdens het bestuderen van adsorbing peptiden. Uitputting stoomisotherm constructie biedt uitgebreide fysieke chemie gegevens voor letterlijk elke oplosbare sorbaat nog blijft de meest toegankelijke methodologie, omdat het geen dure opstellingen vereisen. Dit artikel beschrijft een basisprotocol voor de experimentele studie van peptide adsorptie op anorganisch oxide en behandelt alle kritieke punten die het proces beïnvloeden.

Introduction

In de afgelopen 50 jaar heeft de interactie tussen anorganische oppervlakken en peptiden veel aandacht getrokken vanwege het hoge belang ervan in de materiaalkunde en de geneeskunde. Biomedisch onderzoek is gericht op de compatibiliteit en stabiliteit van bioanorganische oppervlakken, die directe implicaties hebben voor⁴regeneratieve geneeskunde, weefseltechniek^21,,2^,3en implantatie 4^,5,6,7. Hedendaagse bioresponsieve apparaten, zoals sensoren en actuatoren, zijn gebaseerd op functionele eiwitten geïmmobiliseerd op oxide semigeleidende oppervlakken^{8,9,10,11,12,13}. Moderne zuiveringspraktijken voor eiwitproductie zijn vaak afhankelijk van biomolecuulinteractie-eigenschappen in downstream zuivering en scheiding¹⁴.

Van de meervoudige anorganische oxiden blijft titaniumdioxide het meest gebruikt in combinatie met biologisch relevante substraten^15,16. Onderzoek op het gebied₂van TiO 2-gebaseerde bio-interfaces heeft zich geconcentreerd op het vaststellen van een sterke en specifieke binding van eiwitten en peptiden zonder hun biologische en structurele eigenschappen te veranderen. Uiteindelijk is het belangrijkste doel een hoge oppervlaktedichtheidlaag van biomoleculen met een hoge stabiliteit en verhoogde functionaliteit die de creatie van biotechnologische en medische toepassingen op basis van titanium zal bevorderen¹⁷.

Titanium en zijn legeringen zijn op grote schaal gebruikt als een chirurgisch implantaat materiaal voor ten minste zes decennia, omdat een oppervlak TiO₂ laag met een dikte van een paar nanometer is corrosiebestendig en vertoont een hoog niveau van biocompatibiliteit in veel in vivo toepassingen^18,19,20. Titaniumdioxide wordt ook algemeen beschouwd als een anorganisch substraat geproduceerd in biomineralisatie, waar nucleatie en anorganische fase groei vergezeld van eiwitten en peptiden materialen kunnen voorzien van veelbelovende katalytische en optische eigenschappen^21,22,23,24.

Gezien de grote relevantie van de interactie tussen anorganische materialen en biomoleculen in het algemeen en eiwit-TiO₂ interacties in het bijzonder, is er veel onderzoek gedaan naar de manipulatie en controle van de adsorptie van eiwitten op TiO₂. Als gevolg van deze studies zijn enkele fundamentele eigenschappen van deze interactie onthuld, zoals adsorptiekkinetiek, oppervlaktedekking en biomolecuulbevleesvorming, wat aanzienlijke steun geeft voor verdere vooruitgang in bio-interfaces^5,13.

Echter, eiwit complexiteit voegt aanzienlijke beperkingen op volledige bepaling en begrip van moleculaire niveau van een eiwit interactie met anorganische oppervlakken. Ervan uitgaande dat de biomoleculen interageren met de anorganische oppervlakken via beperkte plaatsen, sommige eiwitten met bekende structuren en aminozuur sequenties zijn teruggebracht tot hun componenten-peptiden en aminozuren-die afzonderlijk worden bestudeerd. Sommige van deze peptiden hebben aangetoond significante activiteit, waardoor ze een uniek onderwerp van adsorptie studies zonder de noodzaak van eerdere eiwitscheiding^{25,26,27,28,29,30}.

Kwantitatieve karakterisering van peptide adsorptie op TiO₂ of andere anorganische oppervlakken kan worden bereikt door middel van fysische methoden die speciaal zijn aangepast voor biomoleculen voor de afgelopen decennia. Deze methoden omvatten isothermale titratie calorimetrie (ITC), oppervlakteplasmon resonantie (SPR), kwarts kristal microbalans (QCM), totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), en verzwakte totale reflectantie spectroscopie (ATR), die allemaal zorgen voor de detectie van de adsorptie sterkte door het verstrekken van belangrijke thermodynamische gegevens: De bindende constante, Gibbs vrije energie, enthalpy, en entropy³¹.

De adsorptie van biomoleculen op het anorganische materiaal kan op twee manieren worden bereikt: 1) ITC en de uitputtingsmethode gebruiken deeltjes die zijn verspreid in een oplossing die bindend is voor vaste macroscopische oppervlakken; 2) SPR, QCM, TIRF en ATR maken gebruik van macroscopische oppervlakken die zijn gewijzigd met anorganisch materiaal, zoals goudgecoate glas- of metaalchips, kwartskristallen, zinksulfidekristallen en PMMA-chips.

Isothermale titratie calorimetrie (ITC) is een labelvrije fysische methode die de warmte meet die wordt geproduceerd of verbruikt bij titratie van oplossingen of heterogene mengsels. Gevoelige calorimetrische cellen detecteren warmte-effecten zo klein als 100 nanojoules, waardoor de meting van adsorptiewarmte op nanodeeltjes oppervlakken mogelijk is. Thermisch gedrag van de sorbaat tijdens continue toevoeging- titratie, biedt een volledig thermodynamisch profiel van de interactie onthullen de enthalpy, bindende constante, en entropie bij een bepaalde temperatuur^{32,33,34,35,36}.

Oppervlakteplasmon resonantie (SPR) spectroscopie is een oppervlaktegevoelige optische techniek gebaseerd op de meting van de brekingsindex van de media in de nabijheid van het bestudeerde oppervlak. Het is een real-time en label-vrije methode voor het toezicht op omkeerbare adsorptie en adsorbed laag dikte. De bindingsconstante kan worden berekend op basis van de associatie- en dissociatiepercentages. Adsorptie-experimenten die bij verschillende temperaturen worden uitgevoerd , kunnen informatie verschaffen over de temperatuurafhankelijkheid van de activeringsenergie en achtereenvolgens andere thermodynamische parameters^37,38,39.

De kwartskristalmicrobalans (QCM) meet de verandering in de oscillerende frequentie van piëzo-elektrische kristallen tijdens de adsorptie- en desorptieprocessen. De bindingsconstante kan worden geëvalueerd aan de hand van de verhouding van de adsorptie- en desorptieconstanteconstanten. QCM wordt gebruikt voor relatieve massametingen en behoeft daarom geen kalibratie^25,27,40. QCM wordt gebruikt voor adsorptie van zowel gas als vloeistof. De vloeibare techniek maakt het mogelijk QCM te gebruiken als een analyse-instrument om afzetting op verschillende gewijzigde oppervlakken te beschrijven⁴¹.

Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) is een gevoelige optische interfaciale techniek gebaseerd op de meting van de fluorescentie van adsordenfluorofaat met intern gereflecteerde evanescente golven. De methode maakt het mogelijk om fluorescerende moleculen die het oppervlak bedekken met diktes in de orde van tientallen nanometers, dat is waarom het wordt gebruikt in de studie van macromoleculaire adsorptie op verschillende oppervlakken^42,43. In situ monitoring van de fluorescentiedynamiek bij adsorptie en desorptie zorgen voor de adsorptiek en dus thermodynamische gegevens^42,43.

Verzwakte totale reflectantie (ATR) werd gebruikt door Roddick-Lanzilotta om lysine adsorptie isothermen op basis van de lysine spectrale banden op 1.600 en 1.525 cm^-1vast te stellen . Dit is de eerste keer dat de bindingconstante voor een peptide op TiO₂ werd bepaald met behulp van een in situ infraroodmethode⁴⁴. Deze techniek was effectief bij het vaststellen van adsorptieisothermen voor polylysine peptiden⁴⁵ en zure aminozuren⁴⁶.

In tegenstelling tot de bovengenoemde methoden, waarbij de adsorptieparameter ter plaatse wordt gemeten, wordt in een conventioneel experiment de hoeveelheid van de geadsorbeerde biomoleculen gemeten door de concentratieverandering nadat het oppervlak contact had opgenomen met de oplossing. Omdat de concentratie van een sorbaat vervalt in een overgrote meerderheid van adsorptiegevallen, wordt deze methode aangeduid als de uitputtingsmethode. Concentratiemetingen vereisen een gevalideerde analytische test, die kan worden gebaseerd op een intrinsieke analytische eigenschap van de sorbaat of op basis van de etikettering^47,48,49,,50 of derivatization^51,52 daarvan.

Adsorptie-experimenten met QCM, SPR, TIRF of ATR vereisen een speciale oppervlaktevoorbereiding van de chips en sensoren die worden gebruikt voor adsorptiestudies. Voorbereide oppervlakken moeten eenmaal worden gebruikt en moeten worden gewijzigd bij het schakelen van de adsorbaat, als gevolg van de onvermijdelijke hydratatie van het oxideoppervlak of mogelijke chemisorptie van een sorbaat. Slechts één monster tegelijk kan worden uitgevoerd met ITC, QCM, SPR, TIRF of ATR, terwijl men in de uitputtingsmethode tientallen monsters kan uitvoeren, waarvoor de hoeveelheid alleen wordt beperkt door de thermostaatcapaciteit en de beschikbaarheid van sorbent. Dit is vooral belangrijk bij het verwerken van grote steekproefbatches of bibliotheken van bioactieve moleculen. Belangrijk is dat de uitputtingsmethode geen dure apparatuur vereist, maar alleen een thermostaat.

Ondanks de duidelijke voordelen vereist de uitputtingsmethode echter complexe procedurele kenmerken die omslachtig kunnen lijken. Dit artikel presenteert hoe een uitgebreide fysisch-chemische studie van dipeptide adsorptie op TiO₂ uit te voeren met behulp van de uitputtingmethode en adressen kwesties die onderzoekers kunnen worden geconfronteerd bij het uitvoeren van relevante experimenten.

Protocol

1. Bereiding van dipeptide stockoplossingen en verdunningen Bereiding van 16 mM dipeptide oplossing Plaats 0,183 g van een dipeptide (Ile-His) (zie Tabel van materialen) in een steriele polymeerreageerbuis, verdun tot 35 mL met dubbel gedestilleerd water (DDW) en los op bij kamertemperatuur (RT) onder krachtig roeren.OPMERKING: Als het dipeptide niet oplost in DDW tijdens het roeren, plaats de dipeptide oplossing in een ultrasoon bad en sonicaat voor een paar minuten. Ber…

Representative Results

Adsorptie van een dipeptide op nanokristallijn titaniumdioxide werd bestudeerd in de biocompatibele omstandigheden in een temperatuurbereik van 0−40 °C. Experimentele dipeptide adsorptie (A, mmol/g) op het oppervlak van een titaniumdioxide werd geëvalueerd als Wanneer C0 en Ce </em…

Discussion

Adsorptie van oplossingen voor isotherm constructie vereist een langere tijd voor evenwicht als gevolg van kinetische beperkingen en sorbents met een hoge specifieke oppervlakte. Bovendien moet rekening worden gehouden met instabiliteit van solen, nanodeeltjesaggregaten, kristalliniteit, nanodeeltjesgrootteverdeling, pH van de oplossing en concurrentie voor adsorptie tijdens het adsorberen van aminozuren. Echter, adsorptie isotherm constructie met behulp van de uitputting methode blijft de meest beschikbare methode, omda…

Materials

2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid	TCI Chemicals	4432-31-9	MES, >98%
Acetonitrile	Panreac AppliChem		HPLC grade
Chromatography vials			glass
Dipeptide Ile-His	Bachem	4000894
Double-distilled water			DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD"	J.P. Selecta	3000865	5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector	Shimadzu, LC-20 Prominence		HPLC
Isopropanol	Sigma-Aldrich (Merck)	67-63-0	99.70%
LabSolutions Lite	Shimadzu	223-60410	Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2			Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate	Acros Organics	103-72-0	PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column	ZORBAX LC		150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter	Vladfilter		25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube			polypropylene
Thermostat TC-502	Brookfield		Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine	Sigma-Aldrich (Merck)	121-44-8	TEA; 99%
Trifluoroacetic acid	Panreac AppliChem	163317	TFA, 99%