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Chemistry

Estudo da Adsorção de Peptídeo Curto em Solução Dispersa nanopartículas Inorgânicas Usando Método de Esgotamento

Published: April 11, 2020 doi: 10.3791/60526
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Nanotechnology Education and Research Center, South Ural State University, 2Laboratory of Computational Modelling of Drugs, South Ural State University

Summary

O primeiro passo na compreensão da interação biomolécula-inorgânica da fase sólida é revelar constantes fisicoquímicas fundamentais que podem ser avaliadas estabelecendo isotérmicas de adsorção. A adsorção da fase líquida é restrita por cinética, capacidade de superfície, pH e adsorção competitiva, que todos devem ser considerados cautelosamente antes de definir um experimento de adsorção.

Abstract

Fundamentos das interações inorgânicas-orgânicas são criticamente importantes na descoberta e desenvolvimento de novas biointerfaces passíveis de utilização em biotecnologia e medicina. Estudos recentes indicam que as proteínas interagem com superfícies através de locais de adsorção limitados. Fragmentos de proteínas como aminoácidos e peptídeos podem ser usados para modelagem de interação entre macromoléculas biológicas complexas e superfícies inorgânicas. Durante as últimas três décadas, muitos métodos válidos e sensíveis foram desenvolvidos para medir os fundamentos da química física dessas interações: calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon de superfície (SPR), microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM), fluorescência total de reflexão interna (TIRF) e espectroscopia de reflexão total atenuada (ATR).

A técnica mais simples e acessível para a medição da adsorção é o método de esgotamento, onde a mudança na concentração de sorbate (esgotamento) após o contato com sorbent disperso de solução é calculada e assumida como adsorvida. Isotérmicas de adsorção baseadas em dados de esgotamento fornecem todos os dados físico-químicos básicos. No entanto, a adsorção das soluções requer tempos de equilíbrio mais longos devido a restrições cinéticas e sorbents com uma área de superfície específica elevada, tornando-a quase inaplicável a superfícies planas fixas macroscópicas. Além disso, fatores como a instabilidade dos sols, agregados de nanopartículas, cristalinidade sorbent, distribuição do tamanho das nanopartículas, pH da solução e competição pela adsorção, devem ser considerados ao estudar peptídeos adsorbicos. A construção de isotherm de dados de esgotamento fornece dados de química física abrangentes para literalmente cada sorbate solúvel, mas continua sendo a metodologia mais acessível, pois não requer configurações caras. Este artigo descreve um protocolo básico para o estudo experimental da adsorção de peptídeos sobre óxido inorgânico e abrange todos os pontos críticos que afetam o processo.

Introduction

Nos últimos 50 anos, a interação entre superfícies inorgânicas e peptídeos tem chamado muita atenção devido à sua alta importância na ciência dos materiais e na medicina. A pesquisa biomédica está focada na compatibilidade e estabilidade das superfícies bioinorgânicas, que têm implicações diretas para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos1,,2,,3, e implantação4,,5,,6,7. Dispositivos bioresponsivos contemporâneos, como sensores e atuadores, baseiam-se em proteínas funcionais imobilizadas em superfícies semicondutoras de óxido88,9,,10,,11,,12,,13. As práticas modernas de purificação para a produção de proteínas muitas vezes dependem de propriedades de interação de biomoléculas na purificação e separação a jusante14.

Entre múltiplos óxidos inorgânicos, o dióxido de titânio permanece o mais utilizado em combinação com substratos biologicamente relevantes15,16. A pesquisa na área de biointerfaces baseadas em TiO2concentrou-se em estabelecer uma ligação forte e específica de proteínas e peptídeos sem alterar suas propriedades biológicas e estruturais. Em última análise, o objetivo principal é uma camada de alta densidade superficial de biomoléculas com alta estabilidade e funcionalidade aumentada que avançará na criação de aplicações biotecnológicas e médicas baseadas em titânio17.

O titânio e suas ligas têm sido amplamente utilizados como material de implante cirúrgico há pelo menos seis décadas porque uma camada de superfície TiO2 com espessura de alguns nanômetros é resistente à corrosão e exibe um alto nível de biocompatibilidade em muitas aplicações in vivo18,,19,20. O dióxido de titânio também é amplamente considerado um substrato inorgânico produzido na biomineralização, onde a nucleação e o crescimento da fase inorgânica acompanhados de proteínas e peptídeos podem fornecer materiais com propriedades catalíticas e ópticas promissoras21,22,23,24.

Dada a alta relevância da interação entre materiais inorgânicos e biomoléculas em geral e interações proteína-TiO2 em particular, tem havido muita pesquisa para abordar a manipulação e o controle da adsorção de proteínas no TiO2. Devido a esses estudos, algumas propriedades fundamentais dessa interação foram reveladas, como a cinética adsorção, a cobertura superficial e a conformação de biomoléculas, dando suporte substancial para avanços adicionais nas biointerfaces5,13.

No entanto, a complexidade proteica adiciona restrições consideráveis na determinação completa e compreensão da interação em nível molecular de uma proteína com superfícies inorgânicas. Supondo que as biomoléculas interajam com as superfícies inorgânicas através de locais limitados, algumas proteínas com estruturas conhecidas e seqüências de aminoácidos foram reduzidas a seus componentes-peptídeos e aminoácidos - que são estudados separadamente. Alguns desses peptídeos demonstraram atividade significativa, tornando-os um tema único dos estudos de adsorção sem a necessidade de separação proteica prévia25,,26,27,,28,,29,30.

A caracterização quantitativa da adsorção de peptídeos no TiO2 ou em outras superfícies inorgânicas pode ser realizada por meio de métodos físicos que foram adaptados especificamente para biomoléculas nas últimas décadas. Esses métodos incluem a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon de superfície (SPR), microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM), fluorescência total de reflexão interna (TIRF) e espectroscopia de refletora total atenuada (ATR), que permitem a detecção da força de adsorção fornecendo dados termodinâmicos chave: A constante de ligação, energia livre de Gibbs, entalpia e entropia31.

A adsorção de biomoléculas ao material inorgânico pode ser realizada de duas formas: 1) ITC, bem como o método de esgotamento, utilizar partículas dispersas em uma solução que se liga a superfícies macroscópicas fixas; 2) SPR, QCM, TIRF e ATR utilizam superfícies macroscópicas modificadas com material inorgânico, como lascas de vidro ou metal revestidas de ouro, cristais de quartzo, cristais de sulfeto de zinco e chips PMMA, respectivamente.

A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é um método físico livre de rótulos que mede o calor produzido ou consumido após a titulação de soluções ou misturas heterogêneas. Células calorimétricas sensíveis detectam efeitos térmicos tão pequenos quanto 100 nanojoules, tornando possível a medição do calor de adsorção em superfícies de nanopartículas. O comportamento térmico do sorbato durante a adição contínua de titulação, fornece um perfil termodinâmico completo da interação revelando entalpia, constante de ligação e entropia a uma dada temperatura32,,33,34,35,36.

A espectroscopia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) é uma técnica óptica sensível à superfície baseada na medição do índice de refração da mídia em proximidade com a superfície estudada. É um método em tempo real e sem rótulos para monitorar adsorção reversível e espessura de camada adsorvida. A constante vinculante pode ser calculada a partir das taxas de associação e dissociação. Experimentos de adsorção realizados em diferentes temperaturas podem fornecer informações sobre a dependência da temperatura da energia de ativação e sequencialmente outros parâmetros termodinâmicos37,38,39.

O método de microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM) mede a mudança na freqüência oscilante de cristais piezoelétricos durante os processos de adsorção e dessorção. A constante de ligação pode ser avaliada a partir da razão das constantes de adsorção e taxa de dessorção. O QCM é usado para medições relativas de massa e, portanto, não precisa de calibração25,,27,40. QCM é usado para adsorção de gás e líquido. A técnica líquida permite que o QCM seja usado como uma ferramenta de análise para descrever a deposição em superfícies variadasmodificadas 41.

Fluorescência total de reflexão interna (TIRF) é uma técnica interfacial óptica sensível baseada na medição da fluorescência de fluoróforos adsorturistas excitados com ondas evanescentes refletidas internamente. O método permite a detecção de moléculas fluorescentes que cobrem a superfície com espessuras na ordem de dezenas de nanômetros, razão pela qual é utilizado no estudo da adsorção macromolecular em várias superfícies42,43. In situ monitoramento da dinâmica de fluorescência sobre adsorção e dessorção fornecer a adsorção cinética e, portanto, dados termodinâmicos42,43.

A reflexão total atenuada (ATR) foi utilizada por Roddick-Lanzilotta para estabelecer isotérmicas de adsorção de lisina baseadas nas faixas espectrais lisinas a 1.600 e 1.525 cm-1. Esta é a primeira vez que a constante de ligação para um peptídeo em TiO2 foi determinada usando um método infravermelho in situ44. Esta técnica foi eficaz no estabelecimento de isotérmicas de adsorção para peptídeos de polilisina45 e aminoácidosácidos 46.

Ao contrário dos métodos acima mencionados, onde o parâmetro de adsorção é medido in situ, em um experimento convencional a quantidade de biomoléculas adsorvida é medida pela mudança de concentração após a superfície entrar em contato com a solução. Como a concentração de um sorbate decai na grande maioria dos casos de adsorção, este método é referido como o método de esgotamento. As medidas de concentração requerem um ensaio analítico validado, que pode ser baseado em uma propriedade analítica intrínseca do sorbate ou com base na rotulagem47,48,49,50 ou derivatização51,52 deles.

Experimentos de adsorção usando QCM, SPR, TIRF ou ATR requerem preparação especial de superfície dos chips e sensores usados para estudos de adsorção. Superfícies preparadas devem ser usadas uma vez e requerem alterações ao trocar o adsorbate, devido à inevitável hidratação da superfície do óxido ou possível quimioxide de um sorbate. Apenas uma amostra por vez pode ser executada usando ITC, QCM, SPR, TIRF ou ATR, enquanto no método de esgotamento pode-se executar dezenas de amostras, para as quais a quantidade é limitada apenas pela capacidade do termostato e disponibilidade de sorbent. Isso é especialmente importante ao processar grandes lotes de amostras ou bibliotecas de moléculas bioativas. É importante ressaltar que o método de esgotamento não requer equipamentos caros, mas apenas um termostato.

No entanto, apesar de suas vantagens óbvias, o método de esgotamento requer características processuais complexas que podem parecer complicadas. Este artigo apresenta como realizar um estudo físico-químico abrangente da adsorção de dipeptídeos no TiO2 usando o método de esgotamento e aborda questões que os pesquisadores podem enfrentar ao realizar experimentos relevantes.

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Protocol

1. Preparação de soluções e diluições de estoque de dipeptídeos

  1. Preparação de solução de dipeptídeos de 16 mM
    1. Coloque 0,183 g de um dipepídeo (Ile-His) (ver Tabela de Materiais) em um tubo de ensaio polimérico estéril, diluir até 35 mL com água duplamente destilada (DDW) e dissolver à temperatura ambiente (RT) sob agitação vigorosa.
      NOTA: Se o dipeptídeo não se dissolver em DDW enquanto mexe, coloque a solução de dipeptídeo em um banho ultrassônico e sônica por alguns minutos.
    2. Prepare uma solução de 50 mM de ácido etelasulfônico de2-(N-morfina)ácido etinérnico (MES) dissolvendo 0,533 g de ácido etofesulfônico seco de 2-(N-morfina) em 50 mL de DDW no tubo de ensaio estéril. Prepare uma solução de hidróxido de sódio de 50 mM dissolvendo 200 mg de hidróxido de sódio em 100 mL de DDW.
    3. Ajuste o pH da solução de dipeptídeo pré-dissolvido para 7,4 adicionando cuidadosamente (titulação de microlitros) 50 mM MES, ou hidróxido de sódio de 50 mM à solução de dipeptídeo de 16 mM, mexendo na RT e monitorando o pH com um medidor de pH. Depois de ajustar o pH, despeje a solução em um cilindro de medição, enxágue o tubo de ensaio e encha o cilindro de medição com DDW a 40 mL para fazer uma concentração final de 16 mM.
  2. Preparação de diluições de dipeptídeos a partir de solução de estoque de 16 mM
    1. Preparar diluições de peptídeos com concentrações entre 0,4 e 12,0 mM diluindo a solução de dipeptídeo de 16 mM com DDW. Por exemplo, para preparar uma solução de dipeptídeo de 8 mM, adicione 7 mL de DDW a 10 mL da solução de dipeptídeo de 16 mM. Após a diluição, ajuste o pH para 7,4 adicionando 50 mM MES ou 50 mM NaOH gota por gota para a solução de dipeptídeo (ver passo 1.1.3). Depois de ajustar o pH, despeje a solução em um cilindro de medição, enxágue o tubo de ensaio e encha o cilindro de medição até 20 mL com DDW para fazer a concentração de dipeptídeos 8 mM.
      NOTA: Outras diluições da solução de estoque de dipeptídeos de 16 mM com concentrações de 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0 e 12.0 mM, são preparadas de acordo com a Figura 1. O ajuste de cada pH da solução de dipeptídeos para 7,4 está descrito na etapa 1.1.3.

2. Preparação do sol de titânio

  1. Prepare uma solução de 10 mM de tampão MES dissolvendo 1.066 g de MES em 500 mL de DDW. Ajuste o pH para 7,4 com hidróxido de sódio seco ao mexer e monitorar o pH com o medidor de pH.
  2. Moa 200 mg de nanocristalino TiO2 em uma argamassa por pelo menos 5 min (ver Tabela de Materiais).
  3. Pesar 40 mg de nanopartículas de dióxido de titânio em um frasco de laboratório. Coloque o frasco no banho de sonúncia (ver Tabela de Materiais)usando o suporte de laboratório.
  4. Adicione 20 mL de tampão MES de 10 mM no frasco com TiO2 e sonicate em um banho ultrassônico (5 L, 40 kHz, 120 W) por 20 min.

3. Mistura e termoação

  1. Defina o termostato (ver Tabela de Materiais) para as temperaturas desejadas (ou seja, 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 ou 40,00 °C).
  2. Adicione 1 mL do sol sônico de TiO2 aos frascos de adsorção marcados. Coloque os frascos de adsorção marcados contra a diluição de dipeptídeos correspondentes em um dispositivo de flutuação improvisado feito de espuma de poliestireno extrudado. Coloque o dispositivo de flutuação com os frascos marcados e as diluições correspondentes do dipeptídeo no termostato por pelo menos 5 min.
  3. Adicione 1 mL de cada diluição de dipeptídeos ao frasco de adsorção marcado correspondente, certificando-se de que todas as soluções de mistura tenham a mesma temperatura. Mantenha a série de amostras de adsorção obtidas no termostato às 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 ou 40,00 °C por 24 h para alcançar o equilíbrio de adsorção.
    NOTA: Agite com cautela todas as amostras de dispersões obtidas antes de colocá-las no termostato.
  4. Ocasionalmente misture as dispersões TiO2 agitando-as manualmente durante a termoação.

4. Filtração das amostras termotermosstatedas

  1. Para evitar o reequilíbrio induzido pela temperatura, retire uma amostra de cada vez do termostato para filtração.
  2. Pegue uma amostra da solução de dipeptídeo de cada frasco de vidro com uma seringa, através de uma agulha de seringa. Retire a agulha da seringa e coloque no filtro de seringa (ver Tabela de Materiais)para filtrar a solução de dipeptídeo no frasco de vidro. Repita a filtragem com as outras amostras.
  3. Analise o filtrado de acordo com a seção 5.
    NOTA: Não centrigue as amostras, pois leva alguns minutos e pode causar uma mudança no equilíbrio de concentração.

5. Análise de derivatização e HPLC

  1. Faça uma solução de 50 mL de ácido trifluoroacético (TFA) em acetonitrilo. Adicione 0,34 mL de TFA no cilindro de medição e ajuste o volume da solução para 50 mL com acetonitrilo em RT.
    ATENÇÃO: Trabalhe com TFA sob uma coifa de fumaça com ventilação de exaustão, pois o ácido trifluoroacético é prejudicial quando inalado, causa queimaduras graves na pele e é tóxico para organismos aquáticos mesmo em baixas concentrações53.
  2. Prepare a solução de derivatização (ou seja, reagente edman54) colocando 299 μL de isótiocianato de fenil e 347 μL de trietilamina em um cilindro graduado e ajustando o volume da solução para 50 mL com acetonitrilo em RT.
  3. Antes da análise da cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), derivatize as amostras com o reagente de Edman nos frascos de cromatografia. Misture 400 μL da amostra com 400 μL do reagente de Edman. Aqueça a amostra a 60 °C por 15 min. Após o aquecimento, neutralize a amostra com 225 μL da solução TFA e espere alguns minutos para esfriar a amostra para RT.
  4. Use a análise hplc (ver Tabela de Materiais) para determinar a concentração da solução de dipeptídeo antes e depois da adsorção. Coloque os frascos de cromatografia com as soluções analisadas no autosampler HPLC e comece a analisar as amostras com as condições necessárias, que são definidas pelo software (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A fase móvel consiste em 0,1% de TFA em água deionizada e acetonitrilo puro, com gradientes de acetonitrilo de 20-90% a 286 nm para 13 min. Analisar cada amostra em triplicado. Meça a concentração da solução de dipeptídeos utilizando a curva de calibração previamente estabelecida (Figura 2). Para obter especificações de cromatografia, consulte Shchelokov et al.55.

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Representative Results

A adsorção de um dipeptídeo em dióxido de titânio nanocristalino foi estudada nas condições biocompatíveis em uma faixa de temperatura de 0-40 °C. A adsorção experimental de dipeptídeos (A, mmol/g) na superfície de um dióxido de titânio foi avaliada como

Quando C0 e Ce são as concentrações de partida e equilíbrio do dipeptídeo em milimoles, respectivamente; V é o volume de uma solução de dipeptídeo em litros; e m é o peso do sorbent em gramas.

As medidas da adsorção do dipeptídeo foram processadas por meio do modelo de Henry. Este modelo isotherm assume a adsorção em concentrações relativamente baixas com as moléculas de sorbato isoladas umas das outras em uma superfície sorbent e é adequado para descrever os dados experimentais(Figura 3). Observe, no entanto, que este modelo só pode ser aplicado no caso de adsorção reversível, o que também deve ser confirmado. A espectroscopia ir do material enxaguado várias vezes é adequada para este fim. Os montantes de peptídeos de equilíbrio obtidos no TiO2 e a solução estão relacionados de acordo com a equação linear:

onde KH é a constante de adsorção de Henry.

A constante de ligação de equilíbrio KH foi obtida a partir da inclinação da dependência da adsorção do dipeptídeo (A) na concentração de equilíbrio do dipeptídeo(Ce). A energia livre padrão de Gibbs(ΔG, kJ/mol) para cada temperatura T foi determinada através da equação de Van't Hoff:

onde R é a constante de gás ideal em J/mol*K, e T é a temperatura do processo de adsorção em Kelvin.

Energias livres de Dipeptide Gibbs determinadas a cada temperatura (Figura 4) divulgadas entalpia(ΔH) como uma interceptação da regressão linear com o eixo. A variável de regressão, a entropia do processo (ΔS),foi derivada da equação fundamental:

Os valores calculados da constante de ligação de equilíbrio(KH),energia padrão de Gibbs(ΔG),entalpia(ΔH)e entropia(ΔS)para Ile-His são apresentados na Tabela 1.

Figure 1
Figura 1: Diluição da solução de estoque de dipeptídeos de 16 mM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Curva de calibração em diferentes concentrações de dipeptídeos. As concentrações de dipeptídeos foram entre 0,4-16,0 mM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Os isotérmicas de adsorção de dipeptídeos calculados pelo modelo de Henry para cada temperatura. Isotérmicas de adsorção de dipeptídeos a (A) 0 °C (B) 10 °C (C) 20 °C (D) 30 °C, e (E) 40 °C, respectivamente. Os coeficientes de correlação calculados (R2) caíram em uma faixa de 0,96-0,99 para todos os isotérmicas do modelo de Henry obtidos. As barras de erro representam o intervalo de confiança de 95% para cada concentração amostral medida em triplicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Dependência da energia livre de Gibbs padrão da adsorção do dipeptídeo sobre a temperatura. As barras de erro representam o intervalo de confiança de 95% para a energia livre de Gibbs como medição indireta baseada no Modelo Henry. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

T KH ΔG0, kJ/mol ΔH0, kJ/mol ΔS0, kJ/mol K
273.15 0,32 ± 0,01 2,6 ± 0,0 - 41 ± 9 - 0,16 ± 0,03
283.15 0,25 ± 0,01 3,2 ± 0,1
293.15 0,17 ± 0,06 4,3 ± 0,9
303.15 0,050 ± 0,002 7,6 ± 0,1
313.15 0,037 ± 0,002 8,3 ± 0,1

Tabela 1: Parâmetros termodinâmicos de adsorção de dipeptídeos.

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Discussion

A adsorção de soluções para construção de isotérmicas requer um tempo maior de equilíbrio devido a restrições cinéticas e sorbents com uma área de superfície específica elevada. Além disso, a instabilidade dos sols, agregados de nanopartículas, cristalinidade, distribuição do tamanho das nanopartículas, pH da solução e competição por adsorção devem ser consideradas enquanto adsorrdiam aminoácidos. No entanto, a construção de adsorção isotherm usando o método de esgotamento continua sendo a metodologia mais disponível, porque não requer configurações caras, e ainda fornece dados de química física exaustiva para literalmente cada sorbate solúvel.

Uma distinção deve ser feita entre os modos de adsorção (ou seja, partículas dispersas de solução ou em uma superfície fixa) quando um material cristalino é usado como um sorbent. Deve-se esperar uma diferença substancial na distribuição de rostos cristalinos em superfícies macroscopicamente planas e em partículas. Os parâmetros termodinâmicos resultantes determinados a partir da adsorção de peptídeos em nanopartículas podem não corresponder aos parâmetros termodinâmicos de adsorção de peptídeos a superfícies macroscopicamente planas.

A quantidade média de peptídeos adsorjados nas superfícies inorgânicas é extremamente baixa. Em temperatura ambiente, este valor é de cerca de várias centenas de microgramas por metro quadrado28. Esta pequena quantidade de adsorbate requer métodos precisos de medição e sólidos com superfícies bem desenvolvidas. Portanto, pequenas substâncias de partículas com uma grande superfície específica (centenas de metros quadrados) devem ser utilizadas para experimentos de adsorção43,,56,,57,,58,,59,,60.

Peptídeos são, como proteínas, instáveis, e mantêm sua funcionalidade em uma faixa estreita de condições. Os experimentos de adsorção foram realizados em dióxido de titânio nanocristalino a temperaturas biocompatíveis de 0 °C-40 °C (273,15 K-313,15 K), que são semelhantes às de um organismo vivo normal, funcional. A adsorção a temperaturas mais altas ou mais baixas são irrelevantes e não devem ser consideradas para o experimento.

Compostos biologicamente ativos multifuncionais também apresentam alta suscetibilidade ao pH da mídia, pois afeta a carga superficial e, portanto, interações de Coulomb entre grupos funcionais carregados61,,62,63. A carga sorbent de materiais óxidos também é dependente de pH devido à troca ativa de prótons na superfície hidratada64. Para estabelecer condições estáveis de pH para o uso do equilíbrio de adsorção de um buffer é necessário. Neste estudo, o tampão MES é utilizado para sua propriedade não-coordenada65, de modo que não competiria com o peptídeo para adsorção na superfície de óxido de metal, ao contrário dos tampões de fosfato66.

Este teste recente de adsorção de aminoácidos mostra que o principal local de ligação na nanopartícula é o defeito superficial55. A distribuição de defeitos na superfície é uma das características menos controláveis dos substratos nanocristalinos, portanto deve-se usar sorbent do mesmo lote, a fim de manter a consistência nos estudos de adsorção.

QCM, ressonância de plasmon e ITC são métodos genuínos com sensibilidade sutil que em uma combinação de métodos espectroscópicos revelam peculiaridades estruturais do adsordiato durante a interação com a superfície. No entanto, eles não superam as restrições cinéticas e ainda requerem um tempo considerável para alcançar o equilíbrio da adsorção. Além disso, apenas uma amostra por vez pode ser processada, o que torna a análise da amostra em lote desafiadora. Por outro lado, o método de esgotamento apresentado é simples e restrito apenas à capacidade do termostato, possibilitando o processamento de um grande número de amostras.

As amostras termotermos devem ser filtradas assim que forem removidas do termostato, a fim de evitar o reequilíbrio induzido pela temperatura. Embora o equilíbrio a uma nova temperatura possa levar até algumas horas, manter as amostras de adsorção a uma temperatura diferente deve ser minimizada. A centrifugação das amostras para separação sobrenadante também não é recomendada, pois leva até alguns minutos e pode causar uma mudança no equilíbrio de concentração. A escolha do material do filtro depende da natureza do sorbate e deve reduzir a possível ligação do filtro para a máxima recuperação. É melhor seguir as instruções e recomendações do fornecedor ao escolher filtros específicos.

Além disso, deve-se ter em mente que a mudança de concentração nos estudos de adsorção deve ser monitorada usando o método de quantificação validado usando espectrometria de massa, espectroscopia de rádio ou espectroscopia visível uv. A análise é fácil se o adsordiato estiver espectroscopicamente ativo, caso contrário, é necessária rotulagem adicional ou derivatização do adsorbate.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Russa de Pesquisa Básica (Bolsa nº 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Estudo da Adsorção de Peptídeo Curto em Solução Dispersa nanopartículas Inorgânicas Usando Método de Esgotamento
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Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

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