Det första steget i att förstå biomolekyl-oorganiska solid fas interaktion är att avslöja grundläggande fysikaliskkemiska konstanter som kan utvärderas genom att fastställa adsorption isotherms. Adsorption från vätskefasen begränsas av kinetik, ytkapacitet, pH och konkurrenskraftig adsorption, som alla bör övervägas försiktigt innan du ställer in ett adsorptionsexperiment.
Grunderna i oorganisk-organiska interaktioner är av avgörande betydelse för upptäckten och utvecklingen av nya biointerfaces mottagliga för användning inom bioteknik och medicin. Nyligen genomförda studier visar att proteiner interagerar med ytor genom begränsade adsorptionsplatser. Proteinfragment som aminosyror och peptider kan användas för interaktionsmodellering mellan komplexa biologiska makromolekyler och oorganiska ytor. Under de senaste tre decennierna har många giltiga och känsliga metoder utvecklats för att mäta de fysikaliska kemigrunderna i dessa interaktioner: isotermmal titreringskalorimetri (ITC), ytplasmonresonans (SPR), kvartskristallmikrobalans (QCM), total intern reflektionsfluorescens (TIRF) och försvagad total reflektansspektroskopi (ATR).
Den enklaste och mest prisvärda tekniken för mätning av adsorption är utarmningsmetoden, där förändringen i srbate koncentration (utarmning) efter kontakt med lösningsdispergerad sorbent beräknas och antas adsorberas. Adsorption isotherms baserat på utarmning data ger alla grundläggande fysikaliskkemiska data. Adsorption från lösningar kräver dock längre jämviktstider på grund av kinetiska begränsningar och sorbenter med en hög specifik yta, vilket gör det nästan otillämpbart för makroskopiska fasta planytor. Dessutom bör faktorer som instabilitet i sols, nanopartikelaggregat, sorbent kristalllinitet, nanopartikelstorleksfördelning, pH-värdet och konkurrensen om adsorption beaktas när man studerar adsorberande peptider. Utarmning data isotherm konstruktion ger omfattande fysikalisk kemi data för bokstavligen varje löslig sorbate men är fortfarande den mest tillgängliga metoden, eftersom det inte kräver dyra inställningar. Denna artikel beskriver ett grundläggande protokoll för experimentell studie av peptid adsorption på oorganisk oxid och täcker alla kritiska punkter som påverkar processen.
Under de senaste 50 åren har samspelet mellan oorganiska ytor och peptider väckt stor uppmärksamhet på grund av dess stora betydelse inom materialvetenskap och medicin. Biomedicinsk forskning är inriktad på kompatibilitet och stabilitet av bioorganiska ytor, som har direkta konsekvenser för regenerativ medicin, vävnadsteknik1,,2,,3och implantation4,,5,,6,7. Moderna bioresponsiva enheter, såsom sensorer och ställdon, är baserade på funktionella proteiner immobiliserade på oxid halvledande ytor8,,9,10,,11,12,13. Moderna reningsmetoder för proteinproduktion är ofta beroende av biomolekylinteraktionsegenskaper vid nedströmsrening och separation14.
Bland flera oorganiska oxider är titandioxid fortfarande den mest utnyttjade i kombination med biologiskt relevanta substrat15,16. Forskningen inom tio2-baseradebiointerfaces har koncentrerats på att etablera stark och specifik bindning av proteiner och peptider utan att ändra deras biologiska och strukturella egenskaper. I slutändan är det viktigaste målet en hög yttäthet lager av biomolekyler med hög stabilitet och ökad funktionalitet som kommer att främja skapandet av titan-baserade biotekniska och medicinska tillämpningar17.
Titan och dess legeringar har använts i stor utsträckning som ett kirurgiskt implantatmaterial i minst sex decennier eftersom en yta TiO2 lager med en tjocklek på några nanometer är korrosionsbeständig och uppvisar en hög nivå av biokompatibilitet i många in vivo applikationer18,19,20. Titandioxid anses också allmänt vara ett oorganiskt substrat som produceras i biomineralisering, där kärnbildning och oorganisk fastillväxt tillsammans med proteiner och peptider kan ge material med lovande katalytiska och optiska egenskaper21,22,23,24.
Med tanke på den stora relevansen av samspelet mellan oorganiska material och biomolekyler i allmänhet och protein-TiO2 interaktioner i synnerhet, har det funnits en hel del forskning för att ta itu med manipulering och kontroll av adsorption av proteiner på TiO2. På grund av dessa studier, vissa grundläggande egenskaper hos denna interaktion har avslöjats, såsom adsorptionskinetik, yttäckning och biomolekylkonformation, vilket ger betydande stöd för ytterligare framsteg i biointerfaces5,13.
Proteinkomplexitet tillför dock betydande begränsningar för fullständig bestämning och förståelse av ett proteins molekylära interaktion med oorganiska ytor. Förutsatt att biomolekylerna interagerar med de oorganiska ytorna genom begränsade platser, har vissa proteiner med kända strukturer och aminosyrasekvenser reducerats till sina komponenter-peptider och aminosyror- som studeras separat. Några av dessa peptider har visat betydande aktivitet, vilket gör dem till ett unikt ämne för adsorption studier utan behov av tidigare proteinseparation25,26,27,28,29,30.
Kvantitativ karakterisering av peptidadsorption på TiO2 eller andra oorganiska ytor kan åstadkommas med hjälp av fysiska metoder som har anpassats speciellt för biomolekyler under de senaste decennierna. Dessa metoder inkluderar isotermmal titrering calorimetry (ITC), yta plasmon resonans (SPR), kvarts kristall mikrobalans (QCM), total intern reflektion fluorescens (TIRF), och försvagad total reflektans spektroskopi (ATR), som alla möjliggör detektion av adsorption styrka genom att tillhandahålla viktiga termodynamiska data: Bindning konstant, Gibbs fri energi, entalpi, och entropi31.
Adsorption av biomolekyler till det oorganiska materialet kan åstadkommas på två sätt: 1) ITC samt utarmningsmetoden använder partiklar som sprids i en lösning som binder till fasta makroskopiska ytor; 2) SPR, QCM, TIRF och ATR använder makroskopiska ytor som modifierats med oorganiskt material, såsom guldbelagt glas eller metallchips, kvartskristaller, zinksulfidkristaller respektive PMMA-chips.
Isotermmal titreringskalorimetri (ITC) är en etikettfri fysisk metod som mäter den värme som produceras eller konsumeras vid titrering av lösningar eller heterogena blandningar. Känsliga calorimetric celler upptäcka värmeeffekter så små som 100 nanojoule, vilket gör mätning av adsorption värme på nanopartikelytor möjligt. Termiskt beteende av sorbat under kontinuerlig tillägg- titrering, ger en fullständig termodynamisk profil av interaktionen avslöjar entalpi, bindande konstant, och entropi vid en given temperatur32,33,34,3535,36.
Ytplasmonresonans (SPR) spektroskopi är en ytkänslig optisk teknik baserad på mätning av brytningsindexet för media i närheten av den studerade ytan. Det är en realtids- och etikettfri metod för övervakning av reversibel adsorption och adsorbesängd lagertjocklek. Bindningskonstanten kan beräknas utifrån associations- och dissociationsfrekvenserna. Adsorptionsexperiment som utförs vid olika temperaturer kan ge information om aktiveringsenergins temperaturberoende och sekventiellt andra termodynamiska parametrar37,,38,39.
Kvartskristallmikrobalansen (QCM) metoden mäter förändringen i oscillerande frekvensen av piezoelektriska kristaller under adsorption och desorption processer. Bindningskonstanten kan utvärderas från förhållandet mellan adsorption och desorptions konstanter. QCM används för relativa massmätningar och behöver därför ingen kalibrering25,,27,40. QCM används för adsorption från både gas och vätska. Vätsketekniken gör att QCM kan användas som analysverktyg för att beskriva nedfall på olika modifierade ytor41.
Total intern reflektion fluorescens (TIRF) är en känslig optisk interfacial teknik baserad på mätning av fluorescens av adsorberas fluorofores upphetsad med internt reflekterade evanescent vågor. Metoden möjliggör detektion av fluorescerande molekyler som täcker ytan med tjocklekar i storleksordningen tiotals nanometer, varför det används i studien av makromolekylär adsorption på olika ytor42,43. In situ övervakning av fluorescensdynamiken vid adsorption och desorption ger adsorptionskinetik och därmed termodynamiska data42,43.
Försvagad total reflektans (ATR) användes av Roddick-Lanzilotta för att etablera lysinasorptionsotthermer baserade på lysinspektrala band på 1 600 och 1 525 cm-1. Detta är första gången som bindningskonstanten för en peptid på TiO2 fastställdes med hjälp av en in situ infraröd metod44. Denna teknik var effektiv vid fastställandet av adsorption isotherms för polylysin peptider45 och sura aminosyror46.
Till skillnad från ovannämnda metoder, där adsorptionsparametern mäts på plats, mäts mängden adsorberas biomolekyler i ett konventionellt experiment genom koncentrationsförändringen efter det att ytan har kontaktat lösningen. Eftersom koncentrationen av en sorbat sönderfaller i en stor majoritet av adsorption fall, denna metod kallas utarmning metod. Koncentrationsmätningar kräver en validerad analys, som kan baseras på en inneboende analytisk egenskap hos sorbat eller på grundval av märkningen47,,48,,49,,50 eller derivat51,,52 i dessa.
Adsorptionsexperiment med QCM, SPR, TIRF eller ATR kräver särskild ytpreparering av de chips och sensorer som används för adsorptionsstudier. Beredda ytor bör användas en gång och kräva förändring vid byte av adsorbat, på grund av den oundvikliga hydrering av oxidytan eller eventuell chemisorption av en sorbat. Endast ett prov i taget kan köras med ITC, QCM, SPR, TIRF eller ATR, medan man i utarmningsmetoden kan köra dussintals prover, för vilka kvantiteten endast begränsas av termostatkapaciteten och sorbenttillgängligheten. Detta är särskilt viktigt vid bearbetning av stora provpartier eller bibliotek av bioaktiva molekyler. Viktigt är att utarmningsmetoden inte kräver dyr utrustning utan enbart en termostat.
Trots dess uppenbara fördelar kräver utarmningsmetoden emellertid komplexa procedurmässiga egenskaper som kan verka besvärliga. Den här artikeln presenterar hur man utför en omfattande fysikalisk kemisk studie av dipeptid adsorption på TiO2 med hjälp av utarmningsmetoden och tar upp problem som forskare kan ställas inför när de utför relevanta experiment.
Adsorption från lösningar för isothermkonstruktion kräver en längre tid för jämvikt på grund av kinetiska begränsningar och sorbenter med en hög specifik yta. Dessutom bör instabilitet hos sols, nanopartikelaggregat, kristalllinitet, nanopartikelstorleksfördelning, pH-material och konkurrens om adsorption övervägas medan adsorberande aminosyror. Adsorption isotherm konstruktion med hjälp av utarmning metoden är dock den mest tillgängliga metoden, eftersom det inte kräver dyra inställningar, och ändå …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av Ryska stiftelsen för grundforskning (anslag nr 15-03-07834-a).
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |