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Chemistry

समाधान पर शॉर्ट पेप्टाइड एसोप्शन का अध्ययन कम होने की विधि का उपयोग करके अकार्बनिक नैनोकणों को फैलाया

Published: April 11, 2020 doi: 10.3791/60526

Summary

जैव अणु-अकार्बनिक ठोस चरण बातचीत को समझने में पहला कदम मौलिक भौतिक रासायनिक स्थिरांक का खुलासा कर रहा है जिसका मूल्यांकन सोखने वाले आइसोथर्म स्थापित करके किया जा सकता है। तरल चरण से सोखने को काइनेटिक्स, सतह क्षमता, पीएच और प्रतिस्पर्धी सोखने द्वारा प्रतिबंधित किया जाता है, जिसे सोखने का प्रयोग स्थापित करने से पहले सभी पर सावधानी से विचार किया जाना चाहिए।

Abstract

जैव प्रौद्योगिकी और चिकित्सा में उपयोग के लिए उत्तरदायी उपन्यास बायोइंटरफेस की खोज और विकास में अकार्बनिक-कार्बनिक बातचीत की बुनियादी बातें गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। हाल के अध्ययनों से संकेत मिलता है कि प्रोटीन सीमित सोखने वाली साइटों के माध्यम से सतहों के साथ बातचीत करते हैं। प्रोटीन के टुकड़ों जैसे अमीनो एसिड और पेप्टाइड्स का उपयोग जटिल जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स और अकार्बनिक सतहों के बीच बातचीत मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है। पिछले तीन दशकों के दौरान, उन बातचीत के भौतिक रसायन विज्ञान बुनियादी बातों को मापने के लिए कई वैध और संवेदनशील तरीके विकसित किए गए हैं: आइसोथर्मल टिट्रेशन कैलोरिमेट्री (आईटीसी), सरफेस प्लाज्मन अनुनाद (एसपीआर), क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस (क्यूसीएम), कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआर), और तनु कुल प्रतिबिंबित स्पेक्ट्रोस्कोपी (एटीआर)।

सोखने की माप के लिए सबसे सरल और सबसे सस्ती तकनीक कमी विधि है, जहां समाधान-फैलाया शर्बत के साथ संपर्क के बाद शर्बत एकाग्रता (कमी) में परिवर्तन की गणना की जाती है और इसे सोखलिया जाता है। कमी डेटा के आधार पर सोखने वाले आइसोथर्म सभी बुनियादी भौतिक रासायनिक डेटा प्रदान करते हैं। हालांकि, समाधानों से सोखने के लिए उच्च विशिष्ट सतह क्षेत्र के साथ गतिज प्रतिबंधों और शर्बतों के कारण लंबे समय तक समानता समय की आवश्यकता होती है, जिससे यह स्थूल निश्चित विमान सतहों के लिए लगभग लागू हो जाता है। इसके अलावा, एसोर्बिंग पेप्टाइड्स का अध्ययन करते समय सोल, नैनोपार्टिकल एग्रीगेट, शर्बत क्रिस्टलीता, नैनोपार्टिकल आकार वितरण, समाधान के पीएच और सोखने के लिए प्रतिस्पर्धा जैसे कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। कमी डेटा आइसोथर्म निर्माण सचमुच हर घुलनशील sorbate के लिए व्यापक भौतिक रसायन विज्ञान डेटा प्रदान करता है अभी तक सबसे सुलभ पद्धति बनी हुई है, क्योंकि यह महंगी सेटअप की आवश्यकता नहीं है । यह लेख अकार्बनिक ऑक्साइड पर पेप्टाइड एसोप्शन के प्रायोगिक अध्ययन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और इस प्रक्रिया को प्रभावित करने वाले सभी महत्वपूर्ण बिंदुओं को कवर करता है।

Introduction

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पिछले 50 वर्षों से अकार्बनिक सतहों और पेप्टाइड्स के बीच बातचीत ने भौतिक विज्ञान और चिकित्सा में इसके उच्च महत्व के कारण बहुत ध्यान खींचा है। बायोमेडिकल अनुसंधान जैव कार्बनिक सतहों की अनुकूलता और स्थिरता पर केंद्रित है, जिसका पुनर्योजी चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग1,,2,,3और प्रत्यारोपण4,,5,,6,,7के लिए सीधा निहितार्थ है। सेंसर और एक्टुएटर जैसे समकालीन बायोरिस्पॉन्सिव डिवाइस, ऑक्साइड सेमीकंडक्टिंग सतहों88,9,,10,,11,,12,,13पर स्थिर कार्यात्मक प्रोटीन पर आधारित हैं। प्रोटीन उत्पादन के लिए आधुनिक शुद्धिकरण प्रथाएं अक्सर डाउनस्ट्रीम शुद्धि और पृथक्करण14में जैव अणु इंटरैक्शन गुणों पर निर्भर करती हैं ।

कई अकार्बनिक ऑक्साइड ों में, टाइटेनियम डाइऑक्साइड जैविक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट्स15,16के संयोजन में सबसे अधिक उपयोग की जाती है। टीओ 2-आधारित2बायोइंटरफेस के क्षेत्र में अनुसंधान ने अपने जैविक और संरचनात्मक गुणों को बदले बिना प्रोटीन और पेप्टाइड्स के मजबूत और विशिष्ट बाध्यकारी स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित किया है। अंततः, प्रमुख उद्देश्य उच्च स्थिरता और बढ़ी हुई कार्यक्षमता के साथ जैव अणुओं की एक उच्च सतह घनत्व परत है जो टाइटेनियम आधारित जैव प्रौद्योगिकीय और चिकित्सा अनुप्रयोगों17के निर्माण को आगे बढ़ाएगी।

टाइटेनियम और इसके मिश्र धातुओं का उपयोग कम से कम छह दशकों तक सर्जिकल इंप्लांट सामग्री के रूप में बड़े पैमाने पर किया गया है क्योंकि कुछ नैनोमीटर की मोटाई वाली सतह टीओ2 परत जंग प्रतिरोधी है और वीवो अनुप्रयोगों18,19,20में कई में उच्च स्तर की जैव अनुकूलता प्रदर्शित करती है । टाइटेनियम डाइऑक्साइड को जैव खनिजीकरण में उत्पादित एक अकार्बनिक सब्सट्रेट भी माना जाता है, जहां प्रोटीन और पेप्टाइड्स के साथ नाभिक और अकार्बनिक चरण वृद्धि21,,22,,23,,24के साथ आशाजनक उत्प्रेरक और ऑप्टिकल गुणों के साथ सामग्री प्रदान कर सकती है।

सामान्य रूप से अकार्बनिक सामग्रियों और जैव अणुओं और विशेष रूप से प्रोटीन-TiO2 बातचीत के बीच बातचीत की उच्च प्रासंगिकता को देखते हुए, टीओ2पर प्रोटीन के अवशोषण के हेरफेर और नियंत्रण को संबोधित करने के लिए बहुत शोध हुए हैं। इन अध्ययनों के कारण, इस बातचीत के कुछ मौलिक गुणों का पता चला है, जैसे सोखने काइनेटिक्स, सतह कवरेज, और जैव अणु संरचना, बायोइंटरफेस5,,13में आगे की प्रगति के लिए पर्याप्त समर्थन दे रही है।

हालांकि, प्रोटीन जटिलता अकार्बनिक सतहों के साथ प्रोटीन के आणविक स्तर की बातचीत के पूर्ण निर्धारण और समझ पर काफी प्रतिबंध जोड़ता है । यह मानते हुए कि जैव अणु सीमित साइटों के माध्यम से अकार्बनिक सतहों के साथ बातचीत करते हैं, ज्ञात संरचनाओं और अमीनो एसिड दृश्यों के साथ कुछ प्रोटीन को उनके घटकों-पेप्टाइड्स और अमीनो एसिड-जो अलग से अध्ययन किया जाता है कम कर दिया गया है । इनमें से कुछ पेप्टाइड्स ने महत्वपूर्ण गतिविधि का प्रदर्शन किया है, जिससे वे पिछले प्रोटीन पृथक्करण25,26,27,28,29,,30की आवश्यकता के बिना सोखने के अध्ययन का एक अनूठा विषय बन गए हैं ।

TiO2 या अन्य अकार्बनिक सतहों पर पेप्टाइड अवशोषण के मात्रात्मक लक्षण वर्णन को भौतिक तरीकों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है जिन्हें पिछले कुछ दशकों से जैव अणुओं के लिए विशेष रूप से अनुकूलित किया गया है। इन तरीकों में आइसोथर्मल टिट्रेशन कैलोरिमेट्री (आईटीसी), सरफेस प्लाज्मोन अनुनाद (एसपीआर), क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस (क्यूसीएम), कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ), और क्षीण कुल परावर्तन स्पेक्ट्रोस्कोपी (एटीआर) शामिल हैं, जिनमें31से सभी प्रमुख थर्मोडायनामिक डेटा प्रदान करके सोखने की ताकत का पता लगाने की अनुमति देते हैं: बाध्यकारी स्थिर, गिब्स मुक्त ऊर्जा, एंथलपी, एंग्युर

अकार्बनिक सामग्री के लिए जैव अणुओं के सोखने को दो तरीकों से पूरा किया जा सकता है: 1) आईटीसी के साथ-साथ कमी विधि उपयोग कणों को निश्चित स्थूल सतहों के लिए बाध्यकारी समाधान में फैलाया जाता है; 2) एसपीआर, क्यूसीएम, टीआईआर और एटीआर क्रमशः सोने कोटेड ग्लास या मेटल चिप्स, क्वार्ट्ज क्रिस्टल, जिंक सल्फाइड क्रिस्टल और पीएमएमए चिप्स जैसे अकार्बनिक सामग्री के साथ संशोधित स्थूल सतहों का उपयोग करते हैं।

आइसोथर्मल टिट्रेशन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) एक लेबल-मुक्त भौतिक विधि है जो समाधान या विषम मिश्रण के टिटनेपर उत्पादित या उपभोग की गई गर्मी को मापता है। संवेदनशील कैलोरीमेट्रिक कोशिकाएं 100 नैनोजूल के रूप में छोटे गर्मी प्रभावों का पता लगाती हैं, जिससे नैनोपार्टिकल सतहों पर सोखने वाली गर्मी का माप संभव हो जाता है। लगातार जोड़-टिट्रेशन के दौरान सोरबेट का थर्मल व्यवहार,32,,,33,,,34,35,36के तापमान पर एंथली, बाध्यकारी स्थिर और एंट्रोपी का खुलासा करने वाली बातचीत का पूर्ण थर्मोडायनामिक प्रोफाइल प्रदान करता है।

सतह प्लाज्मोन अनुनाद (एसपीआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययन की गई सतह के निकट मीडिया के अपवर्तक सूचकांक की माप के आधार पर एक सतह-संवेदनशील ऑप्टिकल तकनीक है। यह रिवर्सिबल सोखने और सोखने वाली परत मोटाई की निगरानी के लिए एक वास्तविक समय और लेबल-मुक्त विधि है। बाध्यकारी स्थिर एसोसिएशन और वियोजन दरों से गणना की जा सकती है। विभिन्न तापमानों पर किए गए सोखने वाले प्रयोग सक्रियण ऊर्जा के तापमान पर निर्भरता और क्रमिक रूप से अन्य थर्मोडायनामिक मापदंडों37,38,,39के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं .

क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस (क्यूसीएम) विधि सोखने और अवशोषण प्रक्रियाओं के दौरान पीजोइलेक्ट्रिक क्रिस्टल की दोलन आवृत्ति में परिवर्तन को मापता है। बाध्यकारी स्थिर सोखने और अवशोषण दर स्थिरांक के अनुपात से मूल्यांकन किया जा सकता है। क्यूसीएम का उपयोग सापेक्ष सामूहिक मापन के लिए किया जाता है और इसलिए,25,,27,,40अंशांकन की आवश्यकता नहीं है। QCM गैस और तरल दोनों से सोखने के लिए प्रयोग किया जाता है। तरल तकनीक क्यूसीएम को विभिन्न संशोधित सतहों41पर बयान का वर्णन करने के लिए विश्लेषण उपकरण के रूप में उपयोग करने की अनुमति देती है।

कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) आंतरिक रूप से परिलक्षित वाष्पतरंगतरंगों से उत्साहित सोखने वाले फ्लोरोफोरस के फ्लोरोसेंस की माप के आधार पर एक संवेदनशील ऑप्टिकल इंटरफेशियल तकनीक है। विधि दसियों नैनोमीटर के क्रम पर मोटाई के साथ सतह को कवर करने वाले फ्लोरोसेंट अणुओं का पता लगाने की अनुमति देती है, यही कारण है कि इसका उपयोग विभिन्न सतहों42,,43पर मैक्रोमॉलिक्यूलर सोखने के अध्ययन में किया जाता है। सोखने और अपक्षय ी पर फ्लोरेसेंस गतिशीलता की सीटू निगरानी में सोखने और अवशोषण से सोखने का इंडिकाप्रदान होती है और इसलिए थर्मोडायनामिक डेटा42,43.

1,600 और 1,525 सेमी-1पर लिसिन एडोपशन आइसोथर्म स्थापित करने के लिए रोडिक-लैंज़िलोट्टा द्वारा तनु कुल रिफ्लेक्शन (एटीआर) का उपयोग किया गया था। यह पहली बार है कि टीओ2 पर पेप्टाइड के लिए बाध्यकारी स्थिर का निर्धारण सीटू इंफ्रारेड विधि44में किया गया था । यह तकनीक पॉलीलिसिन पेप्टाइड्स45 और अम्लीय अमीनो एसिड46के लिए एडोप्शन आइसोथर्म स्थापित करने में कारगर थी .

उपर्युक्त तरीकों के विपरीत, जहां सोखने पैरामीटर को सीटू में मापा जाता है, एक पारंपरिक प्रयोग में सतह के समाधान से संपर्क करने के बाद सोखने वाले जैव अणुओं की मात्रा एकाग्रता परिवर्तन द्वारा मापी जाती है। क्योंकि सोखने की एकाग्रता सोखने के मामलों के विशाल बहुमत में क्षय होती है, इस विधि को कमी विधि के रूप में जाना जाता है। एकाग्रता मापन के लिए एक मान्य विश्लेषणात्मक परख की आवश्यकता होती है, जो सोरबेट की आंतरिक विश्लेषणात्मक संपत्ति पर आधारित हो सकती है या लेबलिंग47,,48,,49,,50 या व्युत्पन्न51,,52 के आधार पर हो सकती है।

क्यूसीएम, एसपीआर, टीआईआरएफ या एटीआर का उपयोग करके एसोप्पशन प्रयोगों के लिए सोखने के अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले चिप्स और सेंसर की विशेष सतह तैयारी की आवश्यकता होती है। तैयार सतहों का उपयोग एक बार किया जाना चाहिए और ऑक्साइड सतह के अपरिहार्य जलयोजन या एक सोरबेट के संभावित रसायन के कारण, सोखने के लिए एडोरबेट को स्विच करने पर परिवर्तन की आवश्यकता होती है। एक समय में केवल एक नमूना आईटीसी, क्यूसीएम, एसपीआर, टीआईआर, या एटीआर का उपयोग करके चलाया जा सकता है, जबकि कमी विधि में एक दर्जनों नमूने चला सकता है, जिसके लिए मात्रा केवल थर्मोस्टेट क्षमता और शर्बत उपलब्धता से सीमित है। बड़े नमूना बैचों या बायोएक्टिव अणुओं के पुस्तकालयों को संसाधित करते समय यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। महत्वपूर्ण बात, कमी विधि महंगा उपकरण लेकिन केवल एक थर्मोस्टेट की आवश्यकता नहीं है ।

हालांकि, इसके स्पष्ट फायदों के बावजूद कमी विधि जटिल प्रक्रियात्मक सुविधाओं की आवश्यकता होती है जो बोझिल लग सकती हैं। यह लेख प्रस्तुत करता है कि कैसे कमी विधि का उपयोग कर TiO2 पर dipeptide adsorption के एक व्यापक भौतिक अध्ययन करने के लिए और मुद्दों है कि शोधकर्ताओं का सामना कर सकते है जब प्रासंगिक प्रयोगों प्रदर्शन पते ।

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Protocol

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1. डिपेप्टाइड स्टॉक समाधान और कमजोरियों की तैयारी

  1. 16 एमएम डिपेप्टाइड समाधान की तैयारी
    1. एक बाँझ पॉलीमेरिक परीक्षण ट्यूब में एक डिपेप्टाइड (Ile-His) (सामग्री की तालिकादेखें) के 0.183 ग्राम रखें, डबल आसुत पानी (DDW) के साथ 35 मिलीग्राम तक पतला करें, और जोरदार सरगर्मी के तहत कमरे के तापमान (आरटी) में भंग करें।
      नोट: यदि डाइपेप्टाइड डीडब्ल्यू में हिलाते समय भंग नहीं होता है, तो डिपेप्टाइड समाधान को अल्ट्रासोनिक स्नान में रखें और कुछ मिनटों के लिए सोनीकेट करें।
    2. बाँझ परीक्षण ट्यूब में डीडीडब्ल्यू के 50 एमएल में 0.533 ग्राम ड्राई 2-(एन-मॉर्फोलिनिकNएसिड को भंग करके 2-(एन-मॉर्फोलिन) एथेनेसल्फोनिक एसिड का 50 एमएम समाधान तैयार करें।N डीडीडब्ल्यू के 100 मिलीग्राम में 200 मिलीग्राम सोडियम हाइड्रोक्साइड को भंग कर 50 एमएम सोडियम हाइड्रोक्साइड सॉल्यूशन तैयार करें।
    3. 7.4 को प्रीघुलित डिपेप्टाइड समाधान के पीएच को ध्यान से जोड़कर (माइक्रोलीटर टिट्रेशन) 50 एम एमईएस, या 50 एमएम सोडियम हाइड्रोक्साइड को 16 एमएम डिपेप्टाइड समाधान में समायोजित करें, आरटी पर सरगर्मी करें और पीएच मीटर के साथ पीएच की निगरानी करें। पीएच को समायोजित करने के बाद, समाधान को मापने वाले सिलेंडर में डालें, परीक्षण ट्यूब को कुल्ला करें, और 16 मीटर की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए डीडीडब्ल्यू से मापने वाले सिलेंडर को 40 मिलीएल तक भरें।
  2. 16 एमएम स्टॉक समाधान से डिपेप्टाइड कमजोर करने की तैयारी
    1. डीडीडब्ल्यू के साथ 16 एमएम डिपेप्टाइड समाधान को कमजोर करके 0.4 और 12.0 m के बीच सांद्रता के साथ पेप्टाइड कमजोरियां तैयार करें। उदाहरण के लिए, 8 एमएम डिपेप्टाइड समाधान तैयार करने के लिए, 16 एमएम डिपेप्टाइड समाधान के 10 एमएल में डीडीडब्ल्यू का 7 एमएल जोड़ें। कमजोर पड़ने के बाद, डिपेप्टाइड समाधान में ड्रॉप द्वारा 50 एमएम एमईएस या 50 एमएम नाओएच ड्रॉप जोड़कर पीएच को 7.4 तक समायोजित करें (चरण 1.1.3 देखें)। पीएच को समायोजित करने के बाद, समाधान को मापने वाले सिलेंडर में डालें, परीक्षण ट्यूब को कुल्ला करें, और डाइपेप्टाइड एकाग्रता 8 मीटर बनाने के लिए डीडीडब्ल्यू के साथ 20 मिलील तक मापने वाले सिलेंडर को भरें।
      नोट: 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0 और 12.0 मीटर की सांद्रता के साथ 16 एमएम डिपेप्टाइड स्टॉक समाधान के अन्य कमजोरियां चित्र ा 1के अनुसार तैयार की जाती हैं। प्रत्येक डिपेप्टाइड समाधान पीएच को 7.4 में समायोजन चरण 1.1.3 में वर्णित किया गया है।

2. टाइटेनिया सोल की तैयारी

  1. डीडीडब्ल्यू के 500 एमएल में एमईएस के 1.066 ग्राम को भंग करके एमईएस बफर का 10 एमएम समाधान तैयार करें। पीएच मीटर के साथ पीएच की सरगर्मी और निगरानी पर सूखे सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ पीएच को 7.4 तक समायोजित करें।
  2. कम से कम 5 मिन के लिए एक मोर्टार में नैनोक्रिस्टलाइन TiO2 के 200 मिलीग्राम पीसने (सामग्री की तालिकादेखें) ।
  3. एक प्रयोगशाला फ्लास्क में जमीन टाइटेनियम डाइऑक्साइड नैनोकणों के 40 मिलीग्राम वजन। प्रयोगशाला स्टैंड का उपयोग करके फ्लैक को सोनिकेशन बाथ (सामग्री की तालिकादेखें) में रखें।
  4. 20 मीटर एमईएस बफर के 20 मीटर को टीओ2 के साथ फ्लास्क में जोड़ें और 20 मिन के लिए अल्ट्रासोनिक बाथ (5 एल, 40 किल्ट्ज, 120 डब्ल्यू) में सोनीकेट करें।

3. मिश्रण और थर्मोबताते

  1. थर्मोस्टेट (सामग्री की तालिकादेखें) वांछित तापमान (यानी, 0.00, 10.00, 20.00, 30.00, या 40.00 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेट करें।
  2. चिह्नित सोखने की शीशियों में टीआईओ2 के सोनिकाट सोल का 1 मिलील जोड़ें। एक्सट्रूड पॉलीस्टीरिन फोम से बने अस्थायी फ्लोटेशन डिवाइस में इसी डिपेप्टाइड कमजोर पड़ने के खिलाफ चिह्नित सोखने वाली शीशियों को रखें। प्लवनशीलता डिवाइस को चिह्नित शीशियों और इसी डिपेप्टाइड कमजोरियों के साथ कम से कम 5 मिन के लिए थर्मोस्टेट में रखें।
  3. प्रत्येक डाइपेप्टाइड कमजोर पड़ने का 1 एल जोड़ें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि सभी मिश्रण समाधानों का तापमान समान है। एसोपशन संतुलन को प्राप्त करने के लिए थर्मोस्टेट पर प्राप्त सोखने के नमूनों की श्रृंखला 0.00, 10.00, 20.00, 30.00 या 40.00 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: सावधानी से उन्हें थर्मोस्टेट में डालने से पहले प्राप्त फैलाव के सभी नमूनों को हिला।
  4. कभी-कभी टीओ2 फैलाव को मैन्युअल रूप से थर्मोपोअिंग के दौरान मिलाकर मिलाएं।

4. थर्मोनेड नमूनों का निस्पंदन

  1. तापमान से बचने के लिए प्रेरित reequilibration छानने के लिए थर्मोस्टेट से एक समय में एक नमूना बाहर ले लो ।
  2. सिरिंज सुई के माध्यम से सिरिंज के साथ प्रत्येक ग्लास शीशी से डिपेप्टाइड समाधान का नमूना लें। सिरिंज से सुई निकालें और कांच की शीशी में डिपेप्टाइड समाधान को फ़िल्टर करने के लिए सिरिंज फिल्टर (सामग्री की तालिकादेखें) पर डाल दें। अन्य नमूनों के साथ छानने का काम दोहराएं।
  3. धारा 5 के अनुसार फिल्ट्रेट का विश्लेषण करें।
    नोट: नमूनों को अपकेंद्रित न करें, क्योंकि इसमें कुछ मिनट लगते हैं और एकाग्रता संतुलन में बदलाव का कारण बन सकता है।

5. व्युत्पन्न और एचपीएलसी विश्लेषण

  1. एसिटोनिट्रिल में ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (टीएफए) का 50 एमएल समाधान करें। मापने वाले सिलेंडर में टीएफए के 0.34 मिलील जोड़ें और आरटी में एसीटोनिट्रिल के साथ 50 मिलील के समाधान की मात्रा को समायोजित करें।
    सावधानी: निकास वेंटिलेशन के साथ एक धुएं हुड के तहत टीएफए के साथ काम करते हैं, क्योंकि साँस लेने पर ट्राइफ्लोरोसेटिक एसिड हानिकारक होता है, गंभीर त्वचा जलने का कारण बनता है, और कम सांद्रता53पर भी जलीय जीवों के लिए विषाक्त होता है।
  2. एक स्नातक सिलेंडर में फिनाइल आइसोथिओसाइनेट के 299 माइक्रोन और ट्राइथिलैमाइन के 347 माइक्रोन रखकर व्युत्पन्न समाधान (यानी, एडमैन रिएजेंट54)तैयार करें और आरटी में एसीटोनिट्रिल के साथ 50 मिलील के समाधान की मात्रा को समायोजित करें।
  3. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) विश्लेषण से पहले, क्रोममेटोग्राफी शीशियों में एडमैन के अभिकर्ता के साथ नमूनों को व्युत्पन्न करें। एडमैन के रिएजेंट के 400 माइक्रोन के साथ नमूने का 400 माइक्रोन मिलाएं। 15 मिन के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल गर्म करें। हीटिंग के बाद, टीएफए समाधान के 225 माइक्रोन के साथ नमूने को बेअसर करें और नमूना को आरटी में ठंडा करने के लिए कुछ मिनटों तक प्रतीक्षा करें।
  4. एडॉप्शन से पहले और बाद में डिपेप्टाइड समाधान की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एचपीएलसी विश्लेषण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। विश्लेषण किए गए समाधानों के साथ क्रोमोग्राफी शीशियों को एचपीएलसी ऑटोसैंपलर में रखें और आवश्यक शर्तों के साथ नमूनों का विश्लेषण करना शुरू करें, जो सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किए गए हैं (सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: मोबाइल चरण में डिओनाइज्ड पानी और शुद्ध एसीटोनिट्रिल में 0.1% टीएफए होता है, जिसमें 13 मिन के लिए 286 एनएम पर 20-90% से एसिटोनिट्रिकल ग्रेडिएंट होते हैं। ट्राइलिकेट में प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करें। पहले से स्थापित कैलिब्रेशन वक्र(चित्रा 2)का उपयोग करके डिपेप्टाइड समाधान एकाग्रता को मापें। क्रोमेटोग्राफी विनिर्देशों के लिए Shchelokov एट अल55देखते हैं।

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Representative Results

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नैनोक्रिस्टलाइन टाइटेनियम डाइऑक्साइड पर एक डिपेप्टाइड के सोखने का अध्ययन 0−40 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा में जैव संगत परिस्थितियों में किया गया था। टाइटेनियम डाइऑक्साइड की सतह पर प्रायोगिक डिपेप्टाइड एसोप्शन (ए, एमओल/जी) का मूल्यांकन किया गया था

जहां सी0 और सी क्रमशः मिलीमोल्स में डिपेप्टाइड शुरू करने और संतुलन सांद्रता हैं; वी लीटर में एक डिपेप्टाइड समाधान की मात्रा है; और एम ग्राम में शर्बत का वजन है।

डिपेप्टाइड सोखने के माप हेनरी मॉडल का उपयोग करके संसाधित डेटा थे। यह आइसोथर्म मॉडल एक शर्बत सतह पर एक दूसरे से अलग शर्बत अणुओं के साथ अपेक्षाकृत कम सांद्रता पर सोखना मानता है और प्रयोगात्मक डेटा(चित्रा 3)का वर्णन करने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, ध्यान दें कि इस मॉडल को केवल रिवर्सेबल सोखने के मामले में लागू किया जा सकता है, जिसकी पुष्टि भी की जानी चाहिए। कई बार खंगाली गई सामग्री की आईआर-स्पेक्ट्रोस्कोपी इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है। टीओ2 और समाधान पर प्राप्त संतुलन पेप्टाइड मात्रा रैखिक समीकरण के अनुसार संबंधित हैं:

जहां कश्मीरएच हेनरी के सोखना स्थिर है ।

संतुलन बाध्यकारी स्थिर केएच को डिपेप्टाइड संतुलन एकाग्रता(सीई)पर डिपेप्टाइड एसोर्पशन(ए)की निर्भरता की ढलान से प्राप्त किया गया था। प्रत्येक तापमान टी के लिए मानक गिब्स मुक्त ऊर्जा(1G,kJ/mol) Van't हॉफ समीकरण के माध्यम से निर्धारित किया गया था:

जहां आर जम्मूमें आदर्श गैस स्थिरहै/ T

प्रत्येक तापमान पर निर्धारित डिपेप्टाइड गिब्स मुफ्त ऊर्जा(चित्रा 4)ने धुरी के साथ रैखिक प्रतिगमन के अवरोधन के रूप में एंथली(4)का खुलासा किया। प्रतिगमन चर, प्रक्रिया का एंट्रोपी(एआइओएस),मौलिक समीकरण से लिया गया था:

संतुलन बाध्यकारी स्थिर(केएच),मानक गिब्स ऊर्जा(एजीजी),एंथली(एथलपी)और ईले-उनके लिए एंट्रोपी(एएंट्रोपी)के गणना मूल्य तालिका 1में प्रस्तुत किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: 16 एमएम डिपेप्टाइड स्टॉक सॉल्यूशन का कमजोर पड़ना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: अलग-अलग डिपेप्टाइड एकाग्रता पर कैलिब्रेशन वक्र। डिपेप्टाइड सांद्रता 0.4-16.0 मीटर के बीच थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रत्येक तापमान के लिए हेनरी मॉडल द्वारा गणना किए गए डिपेप्टाइड एडोपशन आइसोथर्म। डिपेप्टाइड एसोप्पेटियन क्रमशः(ए)0 डिग्री सेल्सियस(बी)10 डिग्री सेल्सियस(सी)20 डिग्री सेल्सियस(डी)30 डिग्री सेल्सियस, और(ई)40 डिग्री सेल्सियस पर है। गणना सहसंबंध गुणांक (आर2)सभी प्राप्त हेनरी मॉडल आइसोथर्म के लिए 0.96−0.99 रेंज में गिर गया। त्रुटि सलाखों के प्रत्येक नमूना त्रिपली में मापा एकाग्रता के लिए 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: तापमान पर डाइपेप्टाइड सोखने की मानक गिब्स मुक्त ऊर्जा की निर्भरता। त्रुटि सलाखों के हेनरी मॉडल के आधार पर अप्रत्यक्ष माप के रूप में गिब्स मुक्त ऊर्जा के लिए ९५% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

टी, कश्मीर केएच जी0,केजे/मोल 0,0केजे/मोल 0,0kJ/mol कश्मीर
273.15 0.32 ± 0.01 2.6 ± 0.0 - 41 ± 9 - 0.16 ± 0.03
283.15 0.25 ± 0.01 3.2 ± 0.1
293.15 0.17 ± 0.06 4.3 ± 0.9
303.15 0.050 ± 0.002 7.6 ± 0.1
313.15 0.037 ± 0.002 8.3 ± 0.1

तालिका 1: डिपेप्टाइड एडॉप्शन के थर्मोडायनामिक पैरामीटर।

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Discussion

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आइसोथर्म निर्माण के समाधान से सोखने के लिए उच्च विशिष्ट सतह क्षेत्र के साथ गतिज प्रतिबंधों और शर्बतों के कारण संतुलन के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सोल, नैनोपार्टिकल समुचेश, क्रिस्टलीयता, नैनोपार्टिकल आकार वितरण, समाधान के पीएच, और एसोर्पशन के लिए प्रतिस्पर्धा की अस्थिरता पर विचार किया जाना चाहिए, जबकि अमीनो एसिड को सोखना चाहिए। हालांकि, कमी विधि का उपयोग करके सोखने आइसथर्म निर्माण सबसे अधिक उपलब्ध कार्यप्रणाली बना हुआ है, क्योंकि इसके लिए महंगे सेटअप की आवश्यकता नहीं है, और फिर भी यह सचमुच हर घुलनशील sorbate के लिए संपूर्ण भौतिक रसायन विज्ञान डेटा प्रदान करता है।

एक अंतर सोखना मोड (यानी, समाधान फैलाया कणों या एक निश्चित सतह पर) के बीच किया जाना है जब एक क्रिस्टलीय सामग्री एक शर्बत के रूप में प्रयोग किया जाता है । एक स्थूल सपाट सतहों और कणों पर क्रिस्टलीय चेहरे के वितरण में एक पर्याप्त अंतर की उंमीद करनी चाहिए । जिसके परिणामस्वरूप नैनोकणों पर पेप्टाइड्स के सोखने से निर्धारित थर्मोडायनामिक पैरामीटर पेप्टाइड एसोर्टियन के थर्मोडायनामिक मापदंडों से स्थूल रूप से सपाट सतहों के अनुरूप नहीं हो सकते हैं।

अकार्बनिक सतहों पर पेप्टाइड्स की औसत मात्रा बेहद कम है। कमरे के तापमान पर, यह मूल्य प्रति वर्ग मीटर28माइक्रोग्राम के बारे में कई सैकड़ों है । एसोर्बेट की इस छोटी राशि के लिए अच्छी तरह से विकसित सतहों के साथ सटीक माप विधियों और ठोस की आवश्यकता होती है। इसलिए, एक बड़ी विशिष्ट सतह (सैकड़ों वर्ग मीटर) वाले छोटे कण पदार्थों का उपयोग43,56,,57,,58,,59,,60के दशक के लिए किया जाना चाहिए।,

पेप्टाइड्स प्रोटीन, अस्थिर की तरह होते हैं, और स्थितियों की एक संकीर्ण श्रृंखला में अपनी कार्यक्षमता को बनाए रखते हैं। 0 डिग्री सेल्सियस-40 डिग्री सेल्सियस (273.15 K-313.15 K) के जैव संगत तापमान पर नैनोक्रिस्टलाइन टाइटेनियम डाइऑक्साइड पर एसोप्पशन प्रयोग किए गए, जो सामान्य, कामकाजी, जीवित जीव के समान हैं। उच्च या कम तापमान पर सोखना अप्रासंगिक है और प्रयोग के लिए विचार नहीं किया जाना चाहिए।

बहुआयामी जैविक रूप से सक्रिय यौगिक भी मीडिया के पीएच के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदर्शित करते हैं, क्योंकि यह सतह के आवेश को प्रभावित करता है और इसलिए आवेशित कार्यात्मक समूहों61,,62,,63के बीच कूलोम्ब बातचीत करता है। हाइड्रेटेड सतह64पर सक्रिय प्रोटॉन एक्सचेंज के कारण ऑक्साइड सामग्री का शर्बत चार्ज भी पीएच-निर्भर है। बफर के सोखने संतुलन के उपयोग के लिए पीएच स्थिर स्थितियां स्थापित करने के लिए आवश्यक है। इस अध्ययन में, एमईएस बफर का उपयोग अपनी गैर-समन्वय संपत्ति65के लिए किया जाता है, इसलिए यह फॉस्फेट बफ़र्स66के विपरीत धातु ऑक्साइड सतह पर सोखने के लिए पेप्टाइड के साथ प्रतिस्पर्धा नहीं करेगा।

अमीनो एसिड एसोप्पशन के इस हालिया परीक्षण से पता चलता है कि नैनोपार्टिकल पर प्रमुख बाध्यकारी स्थल सतह दोष55है । सतह पर दोष वितरण नैनोक्रिस्टलाइन सब्सट्रेट्स की सबसे कम नियंत्रणीय विशेषताओं में से एक है, इसलिए सोखने के अध्ययन में स्थिरता बनाए रखने के लिए एक ही बैच से शर्बत का उपयोग करना चाहिए।

क्यूसीएम, प्लाज्मोन अनुनाद, और आईटीसी सूक्ष्म संवेदनशीलता के साथ वास्तविक तरीके हैं जो स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों के संयोजन में सतह के साथ परस्पर क्रिया के दौरान एसोर्बेट की संरचनात्मक विशिष्टताओं को प्रकट करते हैं। हालांकि, वे गतिज प्रतिबंधों को दूर नहीं करते हैं और अभी भी सोखने के संतुलन को प्राप्त करने के लिए काफी समय की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एक समय में केवल एक नमूना संसाधित किया जा सकता है, जो बैच नमूना विश्लेषण को चुनौतीपूर्ण बनाता है। दूसरी ओर, प्रस्तुत की गई कमी विधि सरल है और केवल थर्मोस्टेट क्षमता तक ही सीमित है, जिससे बड़ी संख्या में नमूनों की प्रसंस्करण संभव हो सके।

तापमान से प्रेरित पुनः प्राप्त करने से बचने के लिए थर्मोस्टेट से हटाए जाने के साथ ही थर्मोमेंड नमूनों को फ़िल्टर किया जाना चाहिए। हालांकि एक नए तापमान पर संतुलन में कुछ घंटे तक लग सकते हैं, सोखने के नमूनों को एक अलग तापमान पर रखने को कम किया जाना चाहिए। अलौकिक जुदाई के लिए नमूनों के केंद्रीकरण की सिफारिश भी नहीं की जाती है, क्योंकि इसमें कुछ मिनट तक का समय लगता है और एकाग्रता संतुलन में बदलाव हो सकता है। फ़िल्टर सामग्री का चुनाव sorbate प्रकृति पर निर्भर करता है और अधिकतम वसूली के लिए संभव फिल्टर-बाध्यकारी को कम करना चाहिए। विशिष्ट फ़िल्टर चुनते समय विक्रेता निर्देशों और सिफारिशों का पालन करना सबसे अच्छा है।

इसके अतिरिक्त, किसी को यह ध्यान में रखना चाहिए कि एडोपशन अध्ययनों में एकाग्रता परिवर्तन को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री, रेडियो-स्पेक्ट्रोस्कोपी, या यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके मान्य क्वांटिफिकेशन विधि का उपयोग करके निगरानी की जानी चाहिए। विश्लेषण आसान है यदि एडोबेट स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से सक्रिय है, अन्यथा अतिरिक्त लेबलिंग या एसोर्बेट के व्युत्पन्न की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को रूसी फाउंडेशन फॉर बेसिक रिसर्च (ग्रांट नंबर 15-03-07834-ए) ने आर्थिक रूप से समर्थन दिया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

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समाधान पर शॉर्ट पेप्टाइड एसोप्शन का अध्ययन कम होने की विधि का उपयोग करके अकार्बनिक नैनोकणों को फैलाया
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Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).More

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

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