Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Studie av kort peptid adsorpsjon på løsning spredt uorganiske nanopartikler ved hjelp av uttømming metode

Published: April 11, 2020 doi: 10.3791/60526

Summary

Det første trinnet i å forstå biomolekyl-uorganisk solid fase interaksjon avslører grunnleggende fysikokjemiske konstanter som kan evalueres ved å etablere adsorpsjon isotherms. Adsorpsjon fra væskefasen er begrenset av kinetikk, overflatekapasitet, pH og konkurransedyktig adsorpsjon, som alle bør vurderes forsiktig før du angir et adsorpsjonseksperiment.

Abstract

Grunnleggende om uorganiske-organiske interaksjoner er kritisk viktig i oppdagelsen og utviklingen av nye biogrensesnitt som er egnet for utnyttelse i bioteknologi og medisin. Nyere studier tyder på at proteiner samhandler med overflater gjennom begrensede adsorpsjonsnettsteder. Proteinfragmenter som aminosyrer og peptider kan brukes til interaksjonsmodellering mellom komplekse biologiske makromolekyler og uorganiske overflater. I løpet av de siste tre tiårene har mange gyldige og følsomme metoder blitt utviklet for å måle de fysiske kjemigrunnleggende av disse interaksjonene: isothermal titrering calorimetri (ITC), overflateplasmon resonans (SPR), kvarts krystall mikrobalanse (QCM), total intern refleksjon fluorescens (TIRF), og attenuert total refleksjonspektroskopi (ATR).

Den enkleste og rimeligste teknikken for måling av adsorpsjon er uttømmingsmetoden, hvor endringen i sorbatkonsentrasjon (uttømming) etter kontakt med løsningsdisert sorbent beregnes og antas å være adsorbed. Adsorpsjonsdomer basert på uttømmingsdata gir alle grunnleggende fysikalske data. Adsorpsjon fra løsninger krever imidlertid lengre likevektstider på grunn av kinetiske begrensninger og sorbenter med et høyt spesifikt overflateareal, noe som gjør det nesten uaktuelt for makroskopisk faste planflater. Videre bør faktorer som ustabilitet av sols, nanopartikkelaggregater, sorbent krystallinitet, nanopartikkelstørrelsesfordeling, pH av løsningen og konkurranse om adsorpsjon, vurderes mens du studerer adsorbing peptider. Uttømmingsdata isotherm konstruksjon gir omfattende fysiske kjemidata for bokstavelig talt alle løselige sorbat, men er fortsatt den mest tilgjengelige metodikken, da det ikke krever dyre oppsett. Denne artikkelen beskriver en grunnleggende protokoll for eksperimentell studie av peptid adsorpsjon på uorganisk oksid og dekker alle kritiske punkter som påvirker prosessen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De siste 50 årene har samspillet mellom uorganiske overflater og peptider vakt stor oppmerksomhet på grunn av sin høye betydning i materialvitenskap og medisin. Biomedisinsk forskning er fokusert på kompatibilitet og stabilitet av biouorganiske overflater, som har direkte implikasjoner for regenerativ medisin, vevengineering1,,2,3, og implantasjon4,5,6,7. Moderne bioresponsive enheter, som sensorer og aktuatorer, er basert på funksjonelle proteiner immobilisert på oksid halvledende overflater8,,9,10,11,12,13. Moderne rensing praksis for proteinproduksjon ofte stole på biomolekyl interaksjon egenskaper i nedstrøms rensing og separasjon14.

Blant flere uorganiske oksider er titandioksid fortsatt den mest benyttede i kombinasjon med biologisk relevante substrater15,16. Forskning på området TiO2-basertebiogrensesnitt har konsentrert seg om å etablere sterk og spesifikk binding av proteiner og peptider uten å endre sine biologiske og strukturelle egenskaper. Til syvende og sist er hovedmålet et høyt overflatetetthetslag av biomolekyler med høy stabilitet og økt funksjonalitet som vil fremme opprettelsen av titanbaserte bioteknologiske og medisinske applikasjoner17.

Titan og dets legeringer har blitt brukt mye som et kirurgisk implantatmateriale i minst seks tiår fordi et overflate TiO2-lag med en tykkelse på noen nanometer er korrosjonsbestandig og viser et høyt nivå av biokompatibilitet i mange in vivo applikasjoner18,19,20. Titandioksid er også allment ansett som et uorganisk substrat produsert i biomineralisering, hvor kjernedannelse og uorganisk fasevekst ledsaget av proteiner og peptider kan gi materialer med lovende katalytiske og optiske egenskaper21,,22,23,24.

Gitt den høye relevansen av samspillet mellom uorganiske materialer og biomolekyler generelt og protein-TiO2 interaksjoner spesielt, har det vært mye forskning for å håndtere manipulering og kontroll av adsorpsjon av proteiner på TiO2. På grunn av disse studiene har noen grunnleggende egenskaper ved denne interaksjonen blitt avslørt, for eksempel adsorpsjonskinetikk, overflatedekning og biomolekylkonformasjon, noe som gir betydelig støtte for ytterligere fremskritt i biogrensesnitt5,13.

Proteinkompleksitet gir imidlertid betydelige begrensninger på full bestemmelse og forståelse av et proteinmolekylært nivåinteraksjon med uorganiske overflater. Forutsatt at biomolekylene samhandler med de uorganiske overflatene gjennom begrensede steder, har noen proteiner med kjente strukturer og aminosyresekvenser blitt redusert til deres komponenter-peptider og aminosyrer- som studeres separat. Noen av disse peptidene har vist betydelig aktivitet, noe som gjør dem til et unikt emne for adsorpsjonsstudier uten behov for tidligere proteinseparasjon25,26,27,28,29,30.

Kvantitativ karakterisering av peptidadsorpsjon på TiO2 eller andre uorganiske overflater kan oppnås ved hjelp av fysiske metoder som er tilpasset spesielt for biomolekyler de siste tiårene. Disse metodene inkluderer isothermal titrering katatomeri (ITC), overflate plasmon resonans (SPR), kvarts krystall mikrobalanse (QCM), total intern refleksjon fluorescens (TIRF), og dempertenuert total reflektorspektroskopi (ATR), som alle tillater påvisning av adsorpsjonsstyrken ved å gi viktige termodynamiske data: Bindingkonstanten, Gibbs fri energi, enthalpy og entropy31.

Adsorpsjonen av biomolekyler til det uorganiske materialet kan oppnås på to måter: 1) ITC samt uttømmingsmetoden bruker partikler spredt i en løsning som binder seg til faste makroskopiske overflater; 2) SPR, QCM, TIRF, og ATR bruke makroskopiske overflater modifisert med uorganisk materiale, for eksempel gullbelagt glass eller metallchips, kvartskrystaller, sinksulfidkrystaller og PMMA chips, henholdsvis.

Isothermal titrering calorimetri (ITC) er en etikettfri fysisk metode som måler varmen som produseres eller forbrukes ved titrering av løsninger eller heterogene blandinger. Sensitive kalorimetriske celler oppdager varmeeffekter så små som 100 nanojoule, noe som gjør måling av adsorpsjonsvarme på nanopartikkeloverflater mulig. Termisk oppførsel av sorbat under kontinuerlig addisjon- titrering, gir en full termodynamisk profil av samspillet avslørende enthalpy, bindende konstant, og entropi ved en gitt temperatur32,33,34,35,36.

Overflateplasmon resonans (SPR) spektroskopi er en overflatefølsom optisk teknikk basert på måling av brytningsindeksen til mediet i nærheten av den studerte overflaten. Det er en sanntids- og etikettfri metode for overvåking av reversibel adsorpsjon og adsorbed lagtykkelse. Bindingskonstanten kan beregnes fra foreningen og dissosiasjonsrentene. Adsorpsjonseksperimenter utført ved ulike temperaturer kan gi informasjon om temperaturavhengigheten av aktiveringsenergien og sekvensielt andre termodynamiske parametere37,,38,39.

Kvartskrystallmikrobalanse (QCM)-metoden måler endringen i den oscillerende frekvensen av piezoelektriske krystaller under adsorpsjons- og desorpsjonsprosessene. Bindingskonstanten kan evalueres fra forholdet mellom adsorpsjons- og desorpsjonshastighetskonstantene. QCM brukes til relative massemålinger og trenger derfor ingen kalibrering25,,27,40. QCM brukes til adsorpsjon fra både gass og væske. Væsketeknikken gjør det mulig å bruke QCM som et analyseverktøy for å beskrive avsetning på ulike modifiserte overflater41.

Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) er en følsom optisk interfacial teknikk basert på måling av fluorescens av adsorbed fluoroforer begeistret med internt reflekterte evanescent bølger. Metoden gjør det mulig for påvisning av fluorescerende molekyler som dekker overflaten med tykkelser på rekkefølgen av titalls nanometer, og derfor brukes det i studiet av makromolekylær adsorpsjon på ulike overflater42,43. In situ overvåking av fluorescens dynamikken på adsorpsjon og desorpsjon gi adsorpsjon kinetikk og dermed termodynamiske data42,43.

Svekket total reflektor (ATR) ble brukt av Roddick-Lanzilotta til å etablere lysine adsorpsjon smokker basert på lysine spektrale band på 1600 og 1525 cm-1. Dette er første gang bindingen konstant for et peptid på TiO2 ble bestemt ved hjelp av en in situ infrarød metode44. Denne teknikken var effektiv i å etablere adsorpsjon isotherms for polylysin peptider45 og sure aminosyrer46.

I motsetning til ovennevnte metoder, hvor adsorpsjonsparameteren måles in situ, måles mengden adsorbed biomolekyler ved konsentrasjonsendringen etter at overflaten kontaktet løsningen. Fordi konsentrasjonen av en sorbat forfall i et stort flertall av adsorpsjonstilfeller, er denne metoden referert til som uttømmingsmetoden. Konsentrasjonsmålinger krever en validert analytisk analyse, som kan være basert på en egen analytisk egenskap av sorbaten eller basert på merking47,,48,,49,,50 eller avledning51,52 derav.

Adsorpsjonseksperimenter ved hjelp av QCM, SPR, TIRF eller ATR krever spesiell overflateforberedelse av sjetongene og sensorene som brukes til adsorpsjonsstudier. Forberedte overflater bør brukes en gang og krever endring ved å bytte adsorbat, på grunn av den uunngåelige hydreringen av oksidoverflaten eller mulig chemisorption av en sorbat. Bare én prøve om gangen kan kjøres ved hjelp av ITC, QCM, SPR, TIRF eller ATR, mens i uttømmingsmetoden kan man kjøre dusinvis av prøver, hvor mengden bare er begrenset av termostatkapasiteten og sorbent tilgjengelighet. Dette er spesielt viktig ved behandling av store prøvepartier eller biblioteker av bioaktive molekyler. Viktigere, uttømmingmetoden krever ikke kostbart utstyr, men utelukkende en termostat.

Men til tross for sine åpenbare fordeler uttømming metoden krever komplekse prosessuelle funksjoner som kan virke tungvint. Denne artikkelen presenterer hvordan du utfører en omfattende fysikokjemisk studie av dipeptide adsorpsjon på TiO2 ved hjelp av uttømmingsmetoden og løser problemer som forskere kan møte når de utfører relevante eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av dipeptid lagerløsninger og fortynninger

  1. Tilberedning av 16 mM dipeptidløsning
    1. Plasser 0,183 g dipeptid (Ile-His) (se Materialtabellen) i et sterilt polymert reagensrør, fortynn til 35 ml med dobbeltdestillert vann (DDW), og oppløs ved romtemperatur (RT) under kraftig omrøring.
      MERK: Hvis dipeptidet ikke oppløses i DDW under omrøring, plasser dipeptidløsningen i et ultralydbad og sonikere i noen minutter.
    2. Forbered en 50 mM løsning av 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer ved å oppløse 0,533 g tørr 2-(N-morpholino)ethanesulfonsyre i 50 ml DDW i det sterile reagensrøret. Forbered en 50 mM natriumhydroksidoppløsning ved å oppløse 200 mg natriumhydroksid i 100 ml DDW.
    3. Juster pH-en til den forhåndsoppløste dipeptidoppløsningen til 7,4 ved å tilsette (mikrolitertitrering) 50 mM MES, eller 50 mM natriumhydroksid til 16 mM dipeptidoppløsningen, rør ved RT og overvåke pH med en pH-måler. Etter justering av pH, hell løsningen i en målesylinder, skyll reagensrøret og fyll målesylinderen med DDW til 40 ml for å gjøre en endelig konsentrasjon på 16 mM.
  2. Utarbeidelse av dipeptidfortynninger fra 16 mM lagerløsning
    1. Forbered peptidfortynninger med konsentrasjoner mellom 0,4 og 12,0 mM ved å fortynne 16 mM dipeptidoppløsningen med DDW. For eksempel, for å forberede en 8 mM dipeptide løsning, legg til 7 ml DDW til 10 ml av 16 mM dipeptide løsning. Etter fortynning justerer du pH til 7,4 ved å tilsette 50 mM MES eller 50 mM NaOH dråpe til dipeptidoppløsningen (se trinn 1.1.3). Etter justering av pH, hell løsningen i en målesylinder, skyll reagensrøret og fyll målesylinderen opp til 20 ml med DDW for å gjøre dipeptidkonsentrasjonen 8 mM.
      MERK: Andre fortynninger på 16 mM dipeptid lageroppløsning med konsentrasjoner på 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 og 12,0 mM, fremstilles i samsvar med figur 1. Justeringen av hver dipeptidoppløsning pH til 7,4 er beskrevet i trinn 1.1.3.

2. Forberedelse av titania sol

  1. Forbered en 10 mM-løsning av MES-buffer ved å oppløse 1,066 g MES i 500 ml DDW. Juster pH til 7,4 med tørr natriumhydroksid ved omrøring og overvåking av pH-måleren med pH-måleren.
  2. Grind 200 mg nanokrystallinsk TiO2 i en mørtel i minst 5 min (se materialtabellen).
  3. Vei 40 mg av bakken titandioksid nanopartikler i en laboratoriekolbe. Sett kolben inn i sonikeringsbadet (se Materialbordet) ved hjelp av laboratoriestativet.
  4. Tilsett 20 ml 10 mM MES buffer i kolben med TiO2 og sonicate i et ultralydbad (5 L, 40 kHz, 120 W) i 20 min.

3. Blanding og termostating

  1. Sett termostaten (se materialtabellen) til ønsket temperaturer (dvs. 0,00, 10,00, 20,00, 30,00 eller 40,00 °C).
  2. Legg til 1 ml av sonicated sol tio2 til de merkede adsorpsjonshetteglassene. Plasser de markerte adsorpsjonshetteglassene mot tilsvarende dipeptidfortynning i en provisorisk flotasjonsenhet laget av ekstrudert polystyrenskum. Plasser flyteenheten med de merkede hetteglassene og tilsvarende dipeptidfortynninger i termostaten i minst 5 min.
  3. Tilsett 1 ml av hver dipeptidfortynning til det tilsvarende merkede adsorpsjonshetteglasset, og sørg for at alle blandeløsninger har samme temperatur. Hold serien av innhentet adsorpsjonsprøver på termostaten klokken 0.00, 10.00, 20.00, 30.00 eller 40.00 °C for 24 timer for å oppnå adsorpsjonslikevekt.
    MERK: Rist forsiktig alle prøvene av oppnådde dispersjoner før du legger dem inn i termostaten.
  4. Bland av og til2 TiO 2-dispersjonene ved å riste dem manuelt under termostating.

4. Filtrering av de termovurderte prøvene

  1. For å unngå temperaturindusert reekutkalibrering ta ut en prøve om gangen fra termostaten for filtrering.
  2. Ta en prøve av dipeptidoppløsningen fra hvert hetteglass med en sprøyte, gjennom en sprøytekanyse. Fjern kanylen fra sprøyten og sett på sprøytefilteret (se Materialtabellen) for å filtrere dipeptidoppløsningen inn i hetteglasset. Gjenta filtreringen med de andre prøvene.
  3. Analyser filtratet i henhold til avsnitt 5.
    MERK: Ikke sentrifuger prøvene, fordi det tar noen minutter og kan forårsake en endring i konsentrasjonslikevekten.

5. Avledning og HPLC-analyse

  1. Lag en 50 ml løsning av trifluoreddiksyre (TFA) i acetonitrile. Tilsett 0,34 ml TFA i målesylinderen og juster volumet av løsningen til 50 ml med acetonitrile ved RT.
    FORSIKTIG: Arbeid med TFA under en røykhette med avtrekksventilasjon, fordi trifluoreddiksyre er skadelig ved innånding, forårsaker alvorlige hudforbrenninger, og er giftig for vannlevende organismer selv ved lave konsentrasjoner53.
  2. Forbered avledningsløsningen (dvs. Edman reagens54) ved å plassere 299 μL fenylisotiocyanat og 347 μL trietynokamin i en gradert sylinder og justere volumet av oppløsning til 50 ml med acetonnitrile ved RT.
  3. Før den høyytelses væskekromatografien (HPLC) avledet prøvene med Edmans reagens i kromatografihetteglassene. Bland 400 μL av prøven med 400 μL av Edmans reagens. Varm opp prøven ved 60 °C i 15 min. Etter oppvarming nøytraliserer du prøven med 225 μL av TFA-løsningen og venter i noen minutter for å kjøle prøven til RT.
  4. Bruk HPLC-analyse (se materialtabellen) for å bestemme konsentrasjonen av dipeptidløsningen før og etter adsorpsjon. Plasser kromatografihetteglassene med de analyserte løsningene i HPLC autosampler og begynn å analysere prøvene med de nødvendige forholdene, som er satt av programvaren (se Materialtabellen).
    MERK: Den mobile fasen består av 0,1% TFA i deionisert vann og ren acetonitrile, med acetonitrile gradienter fra 20-90% ved 286 nm i 13 min. Analyser hver prøve i triplicate. Mål konsentrasjonen av dipeptidoppløsning ved hjelp av den tidligere etablerte kalibreringskurven (Figur 2). For kromatografi spesifikasjoner se Shchelokov et al.55.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorpsjon av et dipeptid på nanokrystallinsk titandioksid ble studert ved de biokompatible forholdene i et temperaturområde på 0–40 °C. Eksperimentell dipeptidadsorpsjon (A, mmol/g) på overflaten av et titandioksid ble evaluert som

Hvor C0 og Ce er dipeptid starter og likevekt konsentrasjoner i millimoles, henholdsvis; V er volumet av en dipeptidløsning i liter; og m er vekten av sorbent i gram.

Målingene av dipeptid adsorpsjonen ble data behandlet ved hjelp av Henry-modellen. Denne isotherm modellen forutsetter adsorpsjon ved relativt lave konsentrasjoner med sorbatmolekyler isolert fra hverandre på en sorbent overflate og er egnet for å beskrive eksperimentelle data (Figur 3). Vær imidlertid oppmerksom på at denne modellen bare kan brukes i tilfelle reversibel adsorpsjon, som også bør bekreftes. IR-spektroskopi av materialet skylles flere ganger er egnet for dette formålet. De oppnådde likevektspeptidmengdene på TiO2 og løsningen er relatert i samsvar med den lineære ligningen:

hvor KH er Henrys adsorpsjon konstant.

Likevektsbindingen KH ble hentet fra skråningen av avhengigheten av dipeptid adsorpsjon (A) på dipeptid likevektkonsentrasjonen (Ce). Standard Gibbs fri energi (ΔG, kJ / mol) for hver temperatur T ble bestemt gjennom Van't Hoff ligningen:

hvor R er den ideelle gasskonstanten i J/ mol *K, og T er temperaturen på adsorpsjonsprosessen i Kelvin.

Dipeptid Gibbs fri energi bestemmes ved hver temperatur (Figur 4) avslørte enthalpy (ΔH) som en avskjæring av lineær regresjon med aksen. Regresjonsvariabelen, entropien i prosessen (ΔS),ble avledet fra den grunnleggende ligningen:

De beregnede verdiene av likevektbindingskonstanten (KH), standard Gibbs energi (ΔG), enthalpy (ΔH) og entropi (ΔS) for Ile-His presenteres i tabell 1.

Figure 1
Figur 1: Fortynning av 16 mM dipeptid lagerløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kalibreringskurveved forskjellig dipeptidkonsentrasjon. Konsentrasjonene av dipeptid var mellom 0,4 og 16,0 mM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Dipeptid adsorpsjonen er andre er beregnet av Henry-modellen for hver temperatur. Dipeptid adsorpsjon er andre enn på (A) 0 °C (B) 10 °C (C) 20 °C (D) 30 °C og (E) 40 °C, henholdsvis. De beregnede korrelasjonskoeffisientene (R2) falt i et område på 0,96–0,99 for alle oppnådde Henry-modelldoothermer. Feilfelt representerer 95 % konfidensintervall for hver prøvekonsentrasjon målt i triplicate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Avhengighet av standard Gibbs fri energi av dipeptide adsorpsjon på temperatur. Feilstenger representerer 95% konfidensintervallfor Gibbs fri energi som indirekte måling basert på Henry Model. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

T, K KH (andre) ΔG0, kJ/mol ΔH0, kJ/mol ΔS0, kJ/mol K
273.15 0,32 ± 0,01 2,6 ± 0,0 - 41 ± 9 - 0,16 ± 0,03
283.15 0,25 ± 0,01 3,2 ± 0,1
293.15 0,17 ± 0,06 4,3 ± 0,9
303.15 0,050 ± 0,002 7,6 ± 0,1
313.15 0,037 ± 0,002 8,3 ± 0,1

Tabell 1: Termodynamiske parametere for dipeptid adsorpsjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Adsorpsjon fra løsninger for isotherm konstruksjon krever lengre tid for likevekt på grunn av kinetiske restriksjoner og sorbenter med et høyt spesifikt overflateareal. Videre bør ustabilitet av sols, nanopartikkelaggregater, krystallinitet, nanopartikkelstørrelsesfordeling, pH av løsningen og konkurranse om adsorpsjon vurderes mens adsorbing aminosyrer. Imidlertid er adsorpsjonskonstruksjon ved hjelp av uttømmingsmetoden fortsatt den mest tilgjengelige metodikken, fordi den ikke krever dyre oppsett, og likevel gir det uttømmende fysiske kjemidata for bokstavelig talt alle løselige sorbat.

Det må skilles mellom adsorpsjonsmoduser (dvs. oppløsning dispergerte partikler eller på en fast overflate) når et krystallinsk materiale brukes som sorbent. Man bør forvente en betydelig forskjell i fordelingen av krystallinske ansikter på makroskopisk flate overflater og på partikler. Resulterende termodynamiske parametere bestemt fra adsorpsjon av peptider på nanopartikler kan ikke samsvare med de termodynamiske parametrene for peptid adsorpsjon til makroskopisk flate overflater.

Den gjennomsnittlige mengden peptider adsorbed på uorganiske overflater er ekstremt lav. Ved romtemperatur er denne verdien omtrent flere hundre mikrogram per kvadratmeter28. Denne lille mengden adsorbat krever nøyaktige målemetoder og faste stoffer med godt utviklede overflater. Derfor bør små partikkelstoffer med en stor spesifikk overflate (hundrevis av kvadratmeter) brukes til adsorpsjonseksperimenter43,56,57,58,59,60.

Peptider er, som proteiner, ustabile, og beholder funksjonaliteten på et smalt spekter av forhold. Adsorpsjonseksperimenter ble utført på nanokrystallinsk titandioksid ved biokompatible temperaturer på 0 °C-40 °C (273,15 K-313,15 K), som ligner på en normal, fungerende, levende organisme. Adsorpsjon ved høyere eller lavere temperaturer er irrelevant og bør ikke vurderes for eksperimentet.

Multifunksjonelle biologisk aktive forbindelser viser også høy mottakelighet for pH av media, da det påvirker overflateladningen og derfor Coulomb interaksjoner mellom ladede funksjonelle grupper61,62,63. Den sorbente ladningen av oksidmaterialer er også pH-avhengig på grunn av aktiv protonutveksling på den hydrerte overflaten64. For å etablere pH stabile forhold for adsorpsjon likevekt bruk av en buffer er nødvendig. I denne studien brukes MES buffer for sin ikke-koordinerende eiendom65, slik at det ikke ville konkurrere med peptidet for adsorpsjon på metalloksidoverflaten, i motsetning til fosfatbuffere66.

Denne siste testen av aminosyre adsorpsjon viser at det store bindingsstedet på nanopartikkelen er overflatedefekten55. Defektfordeling på overflaten er en av de minst kontrollerbare funksjonene i nanokrystallinske substrater, derfor bør man bruke sorbent fra samme parti for å opprettholde konsistens i adsorpsjonsstudier.

QCM, plasmon resonans, og ITC er ekte metoder med subtil følsomhet som i en kombinasjon av spektroskopiske metoder avslører strukturelle særegenheter av adsorbatunder samspill med overflaten. Imidlertid overvinner de ikke kinetiske restriksjoner og krever fortsatt betydelig tid for å oppnå adsorpsjonslikevekt. Videre kan bare ett utvalg om gangen behandles, noe som gjør batch prøveanalyse utfordrende. På den annen side er uttømmingsmetoden som presenteres enkel og bare begrenset til termostatkapasiteten, noe som gjør behandlingen av et stort antall prøver mulig.

De termovurderte prøvene skal filtreres så snart de fjernes fra termostaten for å unngå temperaturindusert revurdering. Selv om likevekt ved en ny temperatur kan ta opptil noen timer, bør det minimeres å holde adsorpsjonsprøvene ved en annen temperatur. Sentrifugering av prøvene for supernatant separasjon anbefales heller ikke, fordi det tar opptil noen få minutter og kan forårsake en endring i konsentrasjonslikevekten. Valget av filtermaterialet avhenger av den sorbate naturen og bør redusere mulig filterbinding for maksimal gjenoppretting. Det er best å følge leverandørinstruksjoner og anbefalinger når du velger bestemte filtre.

I tillegg bør man huske på at konsentrasjonsendring i adsorpsjonsstudiene bør overvåkes ved hjelp av validert kvantifiseringsmetode ved hjelp av massespektrometri, radiospektroskopi eller UV-synlig spektroskopi. Analysen er enkel hvis adsorbaten er spektrosk aktiv, ellers er det nødvendig med ytterligere merking eller avledning av adsorbaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Den russiske stiftelsen for grunnleggende forskning (Grant No. 15-03-07834-a).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid TCI Chemicals 4432-31-9 MES, >98%
Acetonitrile Panreac AppliChem HPLC grade
Chromatography vials glass
Dipeptide Ile-His Bachem 4000894
Double-distilled water DDW was obtained on spot
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" J.P. Selecta 3000865 5 L, 40 kHz, 120 Watts
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector Shimadzu, LC-20 Prominence HPLC
Isopropanol Sigma-Aldrich (Merck) 67-63-0 99.70%
LabSolutions Lite Shimadzu 223-60410 Software for high-performance liquid chromatography system
Nanocrystalline TiO2 Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details.
Phenyl isothiocyanate Acros Organics 103-72-0 PITC, 98%
Reversed-phase Zorbax column ZORBAX LC 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm
Syringe filter Vladfilter 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate
Test sterile polymeric tube polypropylene
Thermostat TC-502 Brookfield Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization
Triethylamine Sigma-Aldrich (Merck) 121-44-8 TEA; 99%
Trifluoroacetic acid Panreac AppliChem 163317 TFA, 99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garcia, A. J. Interfaces to Control Cell-Biomaterial Adhesive Interactions. Polymers for Regenerative Medicine. 203, Chapter 71 171-190 (2006).
  2. Mahmood, T. A., et al. Modulation of chondrocyte phenotype for tissue engineering by designing the biologic-polymer carrier interface. Biomacromolecules. 7, (11), 3012-3018 (2006).
  3. Gandavarapu, N. R., Mariner, P. D., Schwartz, M. P., Anseth, K. S. Extracellular matrix protein adsorption to phosphate-functionalized gels from serum promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 9, (1), 4525-4534 (2013).
  4. Horbett, T. Biological Activity of Adsorbed Proteins. Surfactant Science Series. 110, 393-413 (2010).
  5. Ratner, B. D., Hoffman, A. S., Schoen, F. J., Lemons, J. E. Biomaterials Science: An Introduction to Materials in Medicine. Elsevier Academic Press/Academic Press. San Diego. (2004).
  6. Jahangir, A. R., et al. Fluorinated surface-modifying macromolecules: Modulating adhesive protein and platelet interactions on a polyether-urethane. Journal of Biomedical Materials Research. 60, (1), 135-147 (2002).
  7. Shen, M., et al. PEO-like plasma polymerized tetraglyme surface interactions with leukocytes and proteins: In vitro and in vivo studies. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 13, (4), 367-390 (2002).
  8. Wisniewski, N., Moussy, F., Reichert, W. M. Characterization of implantable biosensor membrane biofouling. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry. 366, (6-7), 611-621 (2000).
  9. Geelhood, S. J., et al. Passivating Protein Coatings for Implantable Glucose Sensors: Evaluation of Protein Retention. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81, 251-260 (2007).
  10. Knowles, J. R. Enzyme catalysis: not different, just better. Nature. 350, (6314), 121-124 (1991).
  11. Blankschien, M. D., et al. Light-triggered biocatalysis using thermophilic enzyme - Gold nanoparticle complexes. ACS Nano. 7, (1), 654-663 (2013).
  12. Wu, H., et al. Catechol modification and covalent immobilization of catalase on titania submicrospheres. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 92, 44-50 (2013).
  13. Gray, J. J. The interaction of proteins with solid surfaces. Current Opinion in Structural Biology. 14, (1), 110-115 (2004).
  14. Hlady, V., Buijs, J. Protein adsorption on solid surfaces. Current Opinion in Biotechnology. 7, (1), 72-77 (1996).
  15. Kulkarni, M., et al. Titanium nanostructures for biomedical applications. Nanotechnology. 26, (6), 062002 (2015).
  16. Yin, F. Z., Wu, L., Gui Yang, H., Su, H. Y. Recent progress in biomedical applications of titanium dioxide. Physical Chemistry Chemical Physics. 15, (14), 4844-4858 (2013).
  17. Rezania, A., Johnson, R., Lefkow, A. R., Healy, K. E. Bioactivation of metal oxide surfaces. 1. Surface characterization and cell response. Langmuir. 15, (20), 6931-6939 (1999).
  18. Schenk, R. The Corrosion Properties of Titanium and Titanium Alloys. Titanium in Medicine. Brunette, D. M., et al. Springer-Verlag. Berlin, Germany. 145-170 (2001).
  19. Bozzini, B., et al. An electrochemical impedance investigation of the behaviour of anodically oxidised titanium in human plasma and cognate fluids, relevant to dental applications. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (11), 3443-3453 (2008).
  20. Popa, M. V., et al. Long-term assessment of the implant titanium material - Artificial saliva interface. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, (1), 1-9 (2008).
  21. Kim, J. K., et al. Lysozyme-mediated biomineralization of titanium-tungsten oxide hybrid nanoparticles with high photocatalytic activity. Chemical Communications. 50, 12392-12395 (2014).
  22. Suriyaraj, S. P., Selvakumar, R. Room temperature biosynthesis of crystalline TiO2 nanoparticles using Bacillus licheniformis and studies on the effect of calcination on phase structure and optical properties. RSC Advances. 4, 39619-39624 (2014).
  23. Inoue, I., et al. Thermo-stable carbon nanotube-TiO2 nanocompsite as electron highways in dye-sensitized solar cell produced by bio-nano-process. Nanotechnology. 26, (28), 285601 (2015).
  24. Gardères, J., et al. Self-assembly and photocatalytic activity of branched silicatein/silintaphin filaments decorated with silicatein-synthesized TiO2 nanoparticles. Bioprocess and Biosystems Engineering. 39, (9), 1477-1486 (2016).
  25. Chen, H., Su, X., Neoh, K. G., Choe, W. S. QCM-D analysis of binding mechanism of phage particles displaying a constrained heptapeptide with specific affinity to SiO2 and TiO2. Analytical Chemistry. 78, (14), 4872-4879 (2006).
  26. Iucci, G., et al. Peptides adsorption on TiO2 and Au: Molecular organization investigated by NEXAFS, XPS and IR. Surface Science. 601, (18), 3843-3849 (2007).
  27. Gronewold, T. M. A., Baumgartner, A., Weckmann, A., Knekties, J., Egler, C. Selection process generating peptide aptamers and analysis of their binding to the TiO2 surface of a surface acoustic wave sensor. Acta Biomaterialia. 5, (2), 794-800 (2009).
  28. Gitelman, A., Rapaport, H. Bifunctional designed peptides induce mineralization and binding to TiO2. Langmuir. 30, (16), 4716-4724 (2014).
  29. Tada, S., Timucin, E., Kitajima, T., Sezerman, O. U., Ito, Y. Direct in vitro selection of titanium-binding epidermal growth factor. Biomaterials. 35, (11), 3497-3503 (2014).
  30. Micksch, T., Liebelt, N., Scharnweber, D., Schwenzer, B. Investigation of the peptide adsorption on ZrO2, TiZr, and TiO2 surfaces as a method for surface modification. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, (10), 7408-7416 (2014).
  31. Limo, M. J., Perry, C. C., Thyparambil, A. A., Wei, Y., Latour, R. A. Experimental Characterization of Peptide-Surface Interactions. Bio-Inspired Nanotechnology: From Surface Analysis to Applications. 37-94 (2013).
  32. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 87, 313-325 (2014).
  33. Omanovic-Miklicanin, E., Manfield, I., Wilkins, T. Application of isothermal titration calorimetry in evaluation of protein-nanoparticle interactions. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 127, 605-613 (2017).
  34. Jing, X., et al. Interaction of peptidomimetics with bilayer membranes: Biophysical characterization and cellular uptake. Langmuir. 28, (11), 5167-5175 (2012).
  35. Mizuguchi, C., et al. Effect of phosphatidylserine and cholesterol on membrane-mediated fibril formation by the N-terminal amyloidogenic fragment of apolipoprotein A-I. Scientific Reports. 8, (1), 5497 (2018).
  36. Bisker, G., et al. Insulin Detection Using a Corona Phase Molecular Recognition Site on Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Sensors. 3, (2), 367-377 (2018).
  37. Singh, N., Husson, S. M. Adsorption thermodynamics of short-chain peptides on charged and uncharged nanothin polymer films. Langmuir. 22, (20), 8443-8451 (2006).
  38. Seker, U. O. S., et al. Thermodynamics of engineered gold binding peptides: Establishing the structure-activity relationships. Biomacromolecules. 15, (7), 2369-2377 (2014).
  39. Beutner, R., Michael, J., Schwenzer, B., Scharnweber, D. Biological nano-functionalization of titanium-based biomaterial surfaces: A flexible toolbox. Journal of the Royal Society Interface. 7, (Suppl 1), S93-S105 (2010).
  40. Sultan, A. M., et al. Aqueous Peptide-TiO2 Interfaces: Isoenergetic Binding via Either Entropically or Enthalpically Driven Mechanisms. ACS Applied Materials and Interfaces. 8, (28), 18620-18630 (2016).
  41. Teichroeb, J. H., Forrest, J. A., Jones, L. W., Chan, J., Dalton, K. Quartz crystal microbalance study of protein adsorption kinetics on poly(2-hydroxyethyl methacrylate). Journal of Colloid and Interface Science. 325, (1), 157-164 (2008).
  42. Lok, B. K., Cheng, Y. L., Robertson, C. R. Protein adsorption on crosslinked polydimethylsiloxane using total internal reflection fluorescence. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 104-116 (1983).
  43. Nakanishi, K., Sakiyama, T., Imamura, K. On the Adsorption of Proteins on Solid Surfaces, a Common but Very Complicated Phenomenon. Journal of Bioscience and Bioengineering. 91, (3), 233-244 (2001).
  44. Roddick-Lanzilotta, A. D., Connor, P. A., McQuillan, A. J. An In Situ Infrared Spectroscopic Study of the Adsorption of Lysine to TiO2 from an Aqueous Solution. Langmuir. 14, 6479-6484 (1998).
  45. Roddick-Lanzilotta, A. D., McQuillan, A. J. An in situ infrared spectroscopic investigation of lysine peptide and polylysine adsorption to TiO2 from aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science. 217, (1), 194-202 (1999).
  46. Roddick-Lanzilotta, A., McQuillan, A. An in situ infrared spectroscopic study of glutamic acid and of aspartic acid adsorbed on TiO2: implications for the biocompatibility of titanium. Journal of Colloid and Interface Science. 227, (1), 48-54 (2000).
  47. Chan, B. M. C., Brash, J. L. Adsorption of fibrinogen on glass: reversibility aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 82, (1), 217-225 (1981).
  48. van Enckevort, H. J., Dass, D. V., Langdon, A. G. The adsorption of bovine serum albumin at the stainless-steel/aqueous solution interface. Journal of Colloid And Interface Science. 98, (1), 138-143 (1984).
  49. Arnebrant, T., Nylander, T. Sequential and competitive adsorption of β-lactoglobulin and κ-casein on metal surfaces. Journal of Colloid And Interface Science. 111, (2), 529-533 (1986).
  50. Van Dulm, P., Norde, W. The adsorption of human plasma albumin on solid surfaces, with special attention to the kinetic aspects. Journal of Colloid And Interface Science. 91, (1), 248-255 (1983).
  51. Gonçalves, T. Fluorescent labeling of biomolecules with organic probes. Chemical Reviews. 109, (1), 190-212 (2009).
  52. Roth, K. D. W., Huang, Z. H., Sadagopan, N., Watson, J. T. Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 17, (4), 255-274 (1998).
  53. AppliChem, P. Safety Data Sheet According to Regulation (EU) 830/2015 3317 Trifluoroacetic Acid. http://pub.panreac.com/msds/ing/3317.htm 112 (2018).
  54. Heinrikson, R. L., Meredith, S. C. Amino acid analysis by reverse-phase high-performance liquid chromatography: Precolumn derivatization with phenylisothiocyanate. Analytical Biochemistry. 136, (1), 65-74 (1984).
  55. Shchelokov, A., et al. Adsorption of Native Amino Acids on Nanocrystalline TiO2: Physical Chemistry, QSPR, and Theoretical Modeling. Langmuir. 35, (2), 538-550 (2019).
  56. Fair, B. D., Jamieson, A. M. Studies of Protein Adsorption on Polystyrene Latex Surfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 77, (2), 525-534 (1980).
  57. Kim, J. C., Lund, D. B. Adsorption behavior of p-lactoglobulin onto stainless steel surfaces. Journal of Food Processing and Preservation. 21, (607), 303-317 (1997).
  58. Kondo, A., Oku, S., Murakami, F., Higashitani, K. Conformational changes in protein molecules upon adsorption on ultrafine particles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 1, 197-201 (1993).
  59. Itoh, H., Nagai, T., Saeki, T., Sakiyama, T., Nakanishi, K. Adsorption of Protein onto Stainless Steel Particle Surface and its Desorption Behavior. Developments in Food Engineering. 811-813 (1994).
  60. Itoh, H., Nagata, A., Toyomasu, T., Sakiyama, T., Nagai, T. Adsorption of β-Lactoglobulin onto the Surface of Stainless Steel Particles. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 59, (9), 1648-1651 (1995).
  61. Mudunkotuwa, I. A., Grassian, V. H. Histidine adsorption on TiO2 nanoparticles: An integrated spectroscopic, thermodynamic, and molecular-based approach toward understanding nano-bio interactions. Langmuir. 30, 8751-8760 (2014).
  62. Pászti, Z., Guczi, L. Amino acid adsorption on hydrophilic TiO2: A sum frequency generation vibrational spectroscopy study. Vibrational Spectroscopy. 50, (1), 48-56 (2009).
  63. Costa, D., Savio, L., Pradier, C. M. Adsorption of Amino Acids and Peptides on Metal and Oxide Surfaces in Water Environment: A Synthetic and Prospective Review. Journal of Physical Chemistry B. 120, (29), 7039-7052 (2016).
  64. Kosmulski, M. The significance of the difference in the point of zero charge between rutile and anatase. Advances in Colloid and Interface Science. 99, (3), 255-264 (2002).
  65. Kandegedara, A., Rorabacher, D. B. Noncomplexing tertiary amines as "better" buffers covering the range of pH 3-11. Temperature dependence of their acid dissociation constants. Analytical Chemistry. 71, (15), 3140-3144 (1999).
  66. Susumu, O., Teruaki, A., Koichi, T. The Adsorption of Basic a-Amino Acids in an Aqeous Solution by Titanium(IV) Oxide. Bulletin of the Chemical Society of Japan. 54, 1595-1599 (1981).
Studie av kort peptid adsorpsjon på løsning spredt uorganiske nanopartikler ved hjelp av uttømming metode
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).More

Korina, E., Naifert, S., Morozov, R., Potemkin, V., Bol'shakov, O. Study of Short Peptide Adsorption on Solution Dispersed Inorganic Nanoparticles Using Depletion Method. J. Vis. Exp. (158), e60526, doi:10.3791/60526 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter