Det første trinnet i å forstå biomolekyl-uorganisk solid fase interaksjon avslører grunnleggende fysikokjemiske konstanter som kan evalueres ved å etablere adsorpsjon isotherms. Adsorpsjon fra væskefasen er begrenset av kinetikk, overflatekapasitet, pH og konkurransedyktig adsorpsjon, som alle bør vurderes forsiktig før du angir et adsorpsjonseksperiment.
Grunnleggende om uorganiske-organiske interaksjoner er kritisk viktig i oppdagelsen og utviklingen av nye biogrensesnitt som er egnet for utnyttelse i bioteknologi og medisin. Nyere studier tyder på at proteiner samhandler med overflater gjennom begrensede adsorpsjonsnettsteder. Proteinfragmenter som aminosyrer og peptider kan brukes til interaksjonsmodellering mellom komplekse biologiske makromolekyler og uorganiske overflater. I løpet av de siste tre tiårene har mange gyldige og følsomme metoder blitt utviklet for å måle de fysiske kjemigrunnleggende av disse interaksjonene: isothermal titrering calorimetri (ITC), overflateplasmon resonans (SPR), kvarts krystall mikrobalanse (QCM), total intern refleksjon fluorescens (TIRF), og attenuert total refleksjonspektroskopi (ATR).
Den enkleste og rimeligste teknikken for måling av adsorpsjon er uttømmingsmetoden, hvor endringen i sorbatkonsentrasjon (uttømming) etter kontakt med løsningsdisert sorbent beregnes og antas å være adsorbed. Adsorpsjonsdomer basert på uttømmingsdata gir alle grunnleggende fysikalske data. Adsorpsjon fra løsninger krever imidlertid lengre likevektstider på grunn av kinetiske begrensninger og sorbenter med et høyt spesifikt overflateareal, noe som gjør det nesten uaktuelt for makroskopisk faste planflater. Videre bør faktorer som ustabilitet av sols, nanopartikkelaggregater, sorbent krystallinitet, nanopartikkelstørrelsesfordeling, pH av løsningen og konkurranse om adsorpsjon, vurderes mens du studerer adsorbing peptider. Uttømmingsdata isotherm konstruksjon gir omfattende fysiske kjemidata for bokstavelig talt alle løselige sorbat, men er fortsatt den mest tilgjengelige metodikken, da det ikke krever dyre oppsett. Denne artikkelen beskriver en grunnleggende protokoll for eksperimentell studie av peptid adsorpsjon på uorganisk oksid og dekker alle kritiske punkter som påvirker prosessen.
De siste 50 årene har samspillet mellom uorganiske overflater og peptider vakt stor oppmerksomhet på grunn av sin høye betydning i materialvitenskap og medisin. Biomedisinsk forskning er fokusert på kompatibilitet og stabilitet av biouorganiske overflater, som har direkte implikasjoner for regenerativ medisin, vevengineering1,,2,3, og implantasjon4,5,6,7. Moderne bioresponsive enheter, som sensorer og aktuatorer, er basert på funksjonelle proteiner immobilisert på oksid halvledende overflater8,,9,10,11,12,13. Moderne rensing praksis for proteinproduksjon ofte stole på biomolekyl interaksjon egenskaper i nedstrøms rensing og separasjon14.
Blant flere uorganiske oksider er titandioksid fortsatt den mest benyttede i kombinasjon med biologisk relevante substrater15,16. Forskning på området TiO2-basertebiogrensesnitt har konsentrert seg om å etablere sterk og spesifikk binding av proteiner og peptider uten å endre sine biologiske og strukturelle egenskaper. Til syvende og sist er hovedmålet et høyt overflatetetthetslag av biomolekyler med høy stabilitet og økt funksjonalitet som vil fremme opprettelsen av titanbaserte bioteknologiske og medisinske applikasjoner17.
Titan og dets legeringer har blitt brukt mye som et kirurgisk implantatmateriale i minst seks tiår fordi et overflate TiO2-lag med en tykkelse på noen nanometer er korrosjonsbestandig og viser et høyt nivå av biokompatibilitet i mange in vivo applikasjoner18,19,20. Titandioksid er også allment ansett som et uorganisk substrat produsert i biomineralisering, hvor kjernedannelse og uorganisk fasevekst ledsaget av proteiner og peptider kan gi materialer med lovende katalytiske og optiske egenskaper21,,22,23,24.
Gitt den høye relevansen av samspillet mellom uorganiske materialer og biomolekyler generelt og protein-TiO2 interaksjoner spesielt, har det vært mye forskning for å håndtere manipulering og kontroll av adsorpsjon av proteiner på TiO2. På grunn av disse studiene har noen grunnleggende egenskaper ved denne interaksjonen blitt avslørt, for eksempel adsorpsjonskinetikk, overflatedekning og biomolekylkonformasjon, noe som gir betydelig støtte for ytterligere fremskritt i biogrensesnitt5,13.
Proteinkompleksitet gir imidlertid betydelige begrensninger på full bestemmelse og forståelse av et proteinmolekylært nivåinteraksjon med uorganiske overflater. Forutsatt at biomolekylene samhandler med de uorganiske overflatene gjennom begrensede steder, har noen proteiner med kjente strukturer og aminosyresekvenser blitt redusert til deres komponenter-peptider og aminosyrer- som studeres separat. Noen av disse peptidene har vist betydelig aktivitet, noe som gjør dem til et unikt emne for adsorpsjonsstudier uten behov for tidligere proteinseparasjon25,26,27,28,29,30.
Kvantitativ karakterisering av peptidadsorpsjon på TiO2 eller andre uorganiske overflater kan oppnås ved hjelp av fysiske metoder som er tilpasset spesielt for biomolekyler de siste tiårene. Disse metodene inkluderer isothermal titrering katatomeri (ITC), overflate plasmon resonans (SPR), kvarts krystall mikrobalanse (QCM), total intern refleksjon fluorescens (TIRF), og dempertenuert total reflektorspektroskopi (ATR), som alle tillater påvisning av adsorpsjonsstyrken ved å gi viktige termodynamiske data: Bindingkonstanten, Gibbs fri energi, enthalpy og entropy31.
Adsorpsjonen av biomolekyler til det uorganiske materialet kan oppnås på to måter: 1) ITC samt uttømmingsmetoden bruker partikler spredt i en løsning som binder seg til faste makroskopiske overflater; 2) SPR, QCM, TIRF, og ATR bruke makroskopiske overflater modifisert med uorganisk materiale, for eksempel gullbelagt glass eller metallchips, kvartskrystaller, sinksulfidkrystaller og PMMA chips, henholdsvis.
Isothermal titrering calorimetri (ITC) er en etikettfri fysisk metode som måler varmen som produseres eller forbrukes ved titrering av løsninger eller heterogene blandinger. Sensitive kalorimetriske celler oppdager varmeeffekter så små som 100 nanojoule, noe som gjør måling av adsorpsjonsvarme på nanopartikkeloverflater mulig. Termisk oppførsel av sorbat under kontinuerlig addisjon- titrering, gir en full termodynamisk profil av samspillet avslørende enthalpy, bindende konstant, og entropi ved en gitt temperatur32,33,34,35,36.
Overflateplasmon resonans (SPR) spektroskopi er en overflatefølsom optisk teknikk basert på måling av brytningsindeksen til mediet i nærheten av den studerte overflaten. Det er en sanntids- og etikettfri metode for overvåking av reversibel adsorpsjon og adsorbed lagtykkelse. Bindingskonstanten kan beregnes fra foreningen og dissosiasjonsrentene. Adsorpsjonseksperimenter utført ved ulike temperaturer kan gi informasjon om temperaturavhengigheten av aktiveringsenergien og sekvensielt andre termodynamiske parametere37,,38,39.
Kvartskrystallmikrobalanse (QCM)-metoden måler endringen i den oscillerende frekvensen av piezoelektriske krystaller under adsorpsjons- og desorpsjonsprosessene. Bindingskonstanten kan evalueres fra forholdet mellom adsorpsjons- og desorpsjonshastighetskonstantene. QCM brukes til relative massemålinger og trenger derfor ingen kalibrering25,,27,40. QCM brukes til adsorpsjon fra både gass og væske. Væsketeknikken gjør det mulig å bruke QCM som et analyseverktøy for å beskrive avsetning på ulike modifiserte overflater41.
Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) er en følsom optisk interfacial teknikk basert på måling av fluorescens av adsorbed fluoroforer begeistret med internt reflekterte evanescent bølger. Metoden gjør det mulig for påvisning av fluorescerende molekyler som dekker overflaten med tykkelser på rekkefølgen av titalls nanometer, og derfor brukes det i studiet av makromolekylær adsorpsjon på ulike overflater42,43. In situ overvåking av fluorescens dynamikken på adsorpsjon og desorpsjon gi adsorpsjon kinetikk og dermed termodynamiske data42,43.
Svekket total reflektor (ATR) ble brukt av Roddick-Lanzilotta til å etablere lysine adsorpsjon smokker basert på lysine spektrale band på 1600 og 1525 cm-1. Dette er første gang bindingen konstant for et peptid på TiO2 ble bestemt ved hjelp av en in situ infrarød metode44. Denne teknikken var effektiv i å etablere adsorpsjon isotherms for polylysin peptider45 og sure aminosyrer46.
I motsetning til ovennevnte metoder, hvor adsorpsjonsparameteren måles in situ, måles mengden adsorbed biomolekyler ved konsentrasjonsendringen etter at overflaten kontaktet løsningen. Fordi konsentrasjonen av en sorbat forfall i et stort flertall av adsorpsjonstilfeller, er denne metoden referert til som uttømmingsmetoden. Konsentrasjonsmålinger krever en validert analytisk analyse, som kan være basert på en egen analytisk egenskap av sorbaten eller basert på merking47,,48,,49,,50 eller avledning51,52 derav.
Adsorpsjonseksperimenter ved hjelp av QCM, SPR, TIRF eller ATR krever spesiell overflateforberedelse av sjetongene og sensorene som brukes til adsorpsjonsstudier. Forberedte overflater bør brukes en gang og krever endring ved å bytte adsorbat, på grunn av den uunngåelige hydreringen av oksidoverflaten eller mulig chemisorption av en sorbat. Bare én prøve om gangen kan kjøres ved hjelp av ITC, QCM, SPR, TIRF eller ATR, mens i uttømmingsmetoden kan man kjøre dusinvis av prøver, hvor mengden bare er begrenset av termostatkapasiteten og sorbent tilgjengelighet. Dette er spesielt viktig ved behandling av store prøvepartier eller biblioteker av bioaktive molekyler. Viktigere, uttømmingmetoden krever ikke kostbart utstyr, men utelukkende en termostat.
Men til tross for sine åpenbare fordeler uttømming metoden krever komplekse prosessuelle funksjoner som kan virke tungvint. Denne artikkelen presenterer hvordan du utfører en omfattende fysikokjemisk studie av dipeptide adsorpsjon på TiO2 ved hjelp av uttømmingsmetoden og løser problemer som forskere kan møte når de utfører relevante eksperimenter.
Adsorpsjon fra løsninger for isotherm konstruksjon krever lengre tid for likevekt på grunn av kinetiske restriksjoner og sorbenter med et høyt spesifikt overflateareal. Videre bør ustabilitet av sols, nanopartikkelaggregater, krystallinitet, nanopartikkelstørrelsesfordeling, pH av løsningen og konkurranse om adsorpsjon vurderes mens adsorbing aminosyrer. Imidlertid er adsorpsjonskonstruksjon ved hjelp av uttømmingsmetoden fortsatt den mest tilgjengelige metodikken, fordi den ikke krever dyre oppsett, og likevel gi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Den russiske stiftelsen for grunnleggende forskning (Grant No. 15-03-07834-a).
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |