O primeiro passo na compreensão da interação biomolécula-inorgânica da fase sólida é revelar constantes fisicoquímicas fundamentais que podem ser avaliadas estabelecendo isotérmicas de adsorção. A adsorção da fase líquida é restrita por cinética, capacidade de superfície, pH e adsorção competitiva, que todos devem ser considerados cautelosamente antes de definir um experimento de adsorção.
Fundamentos das interações inorgânicas-orgânicas são criticamente importantes na descoberta e desenvolvimento de novas biointerfaces passíveis de utilização em biotecnologia e medicina. Estudos recentes indicam que as proteínas interagem com superfícies através de locais de adsorção limitados. Fragmentos de proteínas como aminoácidos e peptídeos podem ser usados para modelagem de interação entre macromoléculas biológicas complexas e superfícies inorgânicas. Durante as últimas três décadas, muitos métodos válidos e sensíveis foram desenvolvidos para medir os fundamentos da química física dessas interações: calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon de superfície (SPR), microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM), fluorescência total de reflexão interna (TIRF) e espectroscopia de reflexão total atenuada (ATR).
A técnica mais simples e acessível para a medição da adsorção é o método de esgotamento, onde a mudança na concentração de sorbate (esgotamento) após o contato com sorbent disperso de solução é calculada e assumida como adsorvida. Isotérmicas de adsorção baseadas em dados de esgotamento fornecem todos os dados físico-químicos básicos. No entanto, a adsorção das soluções requer tempos de equilíbrio mais longos devido a restrições cinéticas e sorbents com uma área de superfície específica elevada, tornando-a quase inaplicável a superfícies planas fixas macroscópicas. Além disso, fatores como a instabilidade dos sols, agregados de nanopartículas, cristalinidade sorbent, distribuição do tamanho das nanopartículas, pH da solução e competição pela adsorção, devem ser considerados ao estudar peptídeos adsorbicos. A construção de isotherm de dados de esgotamento fornece dados de química física abrangentes para literalmente cada sorbate solúvel, mas continua sendo a metodologia mais acessível, pois não requer configurações caras. Este artigo descreve um protocolo básico para o estudo experimental da adsorção de peptídeos sobre óxido inorgânico e abrange todos os pontos críticos que afetam o processo.
Nos últimos 50 anos, a interação entre superfícies inorgânicas e peptídeos tem chamado muita atenção devido à sua alta importância na ciência dos materiais e na medicina. A pesquisa biomédica está focada na compatibilidade e estabilidade das superfícies bioinorgânicas, que têm implicações diretas para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos1,,2,,3, e implantação4,,5,,6,7. Dispositivos bioresponsivos contemporâneos, como sensores e atuadores, baseiam-se em proteínas funcionais imobilizadas em superfícies semicondutoras de óxido88,9,,10,,11,,12,,13. As práticas modernas de purificação para a produção de proteínas muitas vezes dependem de propriedades de interação de biomoléculas na purificação e separação a jusante14.
Entre múltiplos óxidos inorgânicos, o dióxido de titânio permanece o mais utilizado em combinação com substratos biologicamente relevantes15,16. A pesquisa na área de biointerfaces baseadas em TiO2concentrou-se em estabelecer uma ligação forte e específica de proteínas e peptídeos sem alterar suas propriedades biológicas e estruturais. Em última análise, o objetivo principal é uma camada de alta densidade superficial de biomoléculas com alta estabilidade e funcionalidade aumentada que avançará na criação de aplicações biotecnológicas e médicas baseadas em titânio17.
O titânio e suas ligas têm sido amplamente utilizados como material de implante cirúrgico há pelo menos seis décadas porque uma camada de superfície TiO2 com espessura de alguns nanômetros é resistente à corrosão e exibe um alto nível de biocompatibilidade em muitas aplicações in vivo18,,19,20. O dióxido de titânio também é amplamente considerado um substrato inorgânico produzido na biomineralização, onde a nucleação e o crescimento da fase inorgânica acompanhados de proteínas e peptídeos podem fornecer materiais com propriedades catalíticas e ópticas promissoras21,22,23,24.
Dada a alta relevância da interação entre materiais inorgânicos e biomoléculas em geral e interações proteína-TiO2 em particular, tem havido muita pesquisa para abordar a manipulação e o controle da adsorção de proteínas no TiO2. Devido a esses estudos, algumas propriedades fundamentais dessa interação foram reveladas, como a cinética adsorção, a cobertura superficial e a conformação de biomoléculas, dando suporte substancial para avanços adicionais nas biointerfaces5,13.
No entanto, a complexidade proteica adiciona restrições consideráveis na determinação completa e compreensão da interação em nível molecular de uma proteína com superfícies inorgânicas. Supondo que as biomoléculas interajam com as superfícies inorgânicas através de locais limitados, algumas proteínas com estruturas conhecidas e seqüências de aminoácidos foram reduzidas a seus componentes-peptídeos e aminoácidos – que são estudados separadamente. Alguns desses peptídeos demonstraram atividade significativa, tornando-os um tema único dos estudos de adsorção sem a necessidade de separação proteica prévia25,,26,27,,28,,29,30.
A caracterização quantitativa da adsorção de peptídeos no TiO2 ou em outras superfícies inorgânicas pode ser realizada por meio de métodos físicos que foram adaptados especificamente para biomoléculas nas últimas décadas. Esses métodos incluem a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), ressonância de plasmon de superfície (SPR), microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM), fluorescência total de reflexão interna (TIRF) e espectroscopia de refletora total atenuada (ATR), que permitem a detecção da força de adsorção fornecendo dados termodinâmicos chave: A constante de ligação, energia livre de Gibbs, entalpia e entropia31.
A adsorção de biomoléculas ao material inorgânico pode ser realizada de duas formas: 1) ITC, bem como o método de esgotamento, utilizar partículas dispersas em uma solução que se liga a superfícies macroscópicas fixas; 2) SPR, QCM, TIRF e ATR utilizam superfícies macroscópicas modificadas com material inorgânico, como lascas de vidro ou metal revestidas de ouro, cristais de quartzo, cristais de sulfeto de zinco e chips PMMA, respectivamente.
A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é um método físico livre de rótulos que mede o calor produzido ou consumido após a titulação de soluções ou misturas heterogêneas. Células calorimétricas sensíveis detectam efeitos térmicos tão pequenos quanto 100 nanojoules, tornando possível a medição do calor de adsorção em superfícies de nanopartículas. O comportamento térmico do sorbato durante a adição contínua de titulação, fornece um perfil termodinâmico completo da interação revelando entalpia, constante de ligação e entropia a uma dada temperatura32,,33,34,35,36.
A espectroscopia de ressonância de plasmon de superfície (SPR) é uma técnica óptica sensível à superfície baseada na medição do índice de refração da mídia em proximidade com a superfície estudada. É um método em tempo real e sem rótulos para monitorar adsorção reversível e espessura de camada adsorvida. A constante vinculante pode ser calculada a partir das taxas de associação e dissociação. Experimentos de adsorção realizados em diferentes temperaturas podem fornecer informações sobre a dependência da temperatura da energia de ativação e sequencialmente outros parâmetros termodinâmicos37,38,39.
O método de microequilíbrio de cristal de quartzo (QCM) mede a mudança na freqüência oscilante de cristais piezoelétricos durante os processos de adsorção e dessorção. A constante de ligação pode ser avaliada a partir da razão das constantes de adsorção e taxa de dessorção. O QCM é usado para medições relativas de massa e, portanto, não precisa de calibração25,,27,40. QCM é usado para adsorção de gás e líquido. A técnica líquida permite que o QCM seja usado como uma ferramenta de análise para descrever a deposição em superfícies variadasmodificadas 41.
Fluorescência total de reflexão interna (TIRF) é uma técnica interfacial óptica sensível baseada na medição da fluorescência de fluoróforos adsorturistas excitados com ondas evanescentes refletidas internamente. O método permite a detecção de moléculas fluorescentes que cobrem a superfície com espessuras na ordem de dezenas de nanômetros, razão pela qual é utilizado no estudo da adsorção macromolecular em várias superfícies42,43. In situ monitoramento da dinâmica de fluorescência sobre adsorção e dessorção fornecer a adsorção cinética e, portanto, dados termodinâmicos42,43.
A reflexão total atenuada (ATR) foi utilizada por Roddick-Lanzilotta para estabelecer isotérmicas de adsorção de lisina baseadas nas faixas espectrais lisinas a 1.600 e 1.525 cm-1. Esta é a primeira vez que a constante de ligação para um peptídeo em TiO2 foi determinada usando um método infravermelho in situ44. Esta técnica foi eficaz no estabelecimento de isotérmicas de adsorção para peptídeos de polilisina45 e aminoácidosácidos 46.
Ao contrário dos métodos acima mencionados, onde o parâmetro de adsorção é medido in situ, em um experimento convencional a quantidade de biomoléculas adsorvida é medida pela mudança de concentração após a superfície entrar em contato com a solução. Como a concentração de um sorbate decai na grande maioria dos casos de adsorção, este método é referido como o método de esgotamento. As medidas de concentração requerem um ensaio analítico validado, que pode ser baseado em uma propriedade analítica intrínseca do sorbate ou com base na rotulagem47,48,49,50 ou derivatização51,52 deles.
Experimentos de adsorção usando QCM, SPR, TIRF ou ATR requerem preparação especial de superfície dos chips e sensores usados para estudos de adsorção. Superfícies preparadas devem ser usadas uma vez e requerem alterações ao trocar o adsorbate, devido à inevitável hidratação da superfície do óxido ou possível quimioxide de um sorbate. Apenas uma amostra por vez pode ser executada usando ITC, QCM, SPR, TIRF ou ATR, enquanto no método de esgotamento pode-se executar dezenas de amostras, para as quais a quantidade é limitada apenas pela capacidade do termostato e disponibilidade de sorbent. Isso é especialmente importante ao processar grandes lotes de amostras ou bibliotecas de moléculas bioativas. É importante ressaltar que o método de esgotamento não requer equipamentos caros, mas apenas um termostato.
No entanto, apesar de suas vantagens óbvias, o método de esgotamento requer características processuais complexas que podem parecer complicadas. Este artigo apresenta como realizar um estudo físico-químico abrangente da adsorção de dipeptídeos no TiO2 usando o método de esgotamento e aborda questões que os pesquisadores podem enfrentar ao realizar experimentos relevantes.
A adsorção de soluções para construção de isotérmicas requer um tempo maior de equilíbrio devido a restrições cinéticas e sorbents com uma área de superfície específica elevada. Além disso, a instabilidade dos sols, agregados de nanopartículas, cristalinidade, distribuição do tamanho das nanopartículas, pH da solução e competição por adsorção devem ser consideradas enquanto adsorrdiam aminoácidos. No entanto, a construção de adsorção isotherm usando o método de esgotamento continua sendo a …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Russa de Pesquisa Básica (Bolsa nº 15-03-07834-a).
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid | TCI Chemicals | 4432-31-9 | MES, >98% |
Acetonitrile | Panreac AppliChem | HPLC grade | |
Chromatography vials | glass | ||
Dipeptide Ile-His | Bachem | 4000894 | |
Double-distilled water | DDW was obtained on spot | ||
Heating cleaning bath "Ultrasons-HD" | J.P. Selecta | 3000865 | 5 L, 40 kHz, 120 Watts |
High-performance liquid chromatograph system equipped with a UV−vis detector | Shimadzu, LC-20 Prominence | HPLC | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich (Merck) | 67-63-0 | 99.70% |
LabSolutions Lite | Shimadzu | 223-60410 | Software for high-performance liquid chromatography system |
Nanocrystalline TiO2 | Pure anatase with at least 99% crystallinity. Average particle size 10.62 ± 3.31 nm. Specific surface 131.9 m2/g (BET). See Langmuir 2019, 35, 538−550, for details. | ||
Phenyl isothiocyanate | Acros Organics | 103-72-0 | PITC, 98% |
Reversed-phase Zorbax column | ZORBAX LC | 150×2.5 mm i.d. with a mean particle size of 5 μm | |
Syringe filter | Vladfilter | 25 mm, 0.2 μm pore, cellulose acetate | |
Test sterile polymeric tube | polypropylene | ||
Thermostat TC-502 | Brookfield | Refrigerating/heating circulating bath with the programmable controller for the sample derivatization | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich (Merck) | 121-44-8 | TEA; 99% |
Trifluoroacetic acid | Panreac AppliChem | 163317 | TFA, 99% |