Summary
O momento da exposição a ligantes pode afetar suas conseqüências de desenvolvimento. Aqui mostramos como a liberação de imagem de uma proteína morfogenética óssea Drosophila (BMP) chamada Dpp das células do disco da asa.
Abstract
A superfamília transformadora Fator de Crescimento-beta (TGF-β) é essencial para o padrão embrionário precoce e o desenvolvimento de estruturas adultas em organismos multicelulares. A superfamília TGF-β inclui TGF-β, proteína morfogenética óssea (BMPs), Activins, Fatores de Crescimento e Diferenciação e Nodals. Há muito se sabe que a quantidade de ligand expostos às células é importante para seus efeitos. Pensava-se que gradientes de concentração de longo alcance criaram padrão embrionário. No entanto, recentemente, tornou-se claro que o momento da exposição a esses ligantes também é importante para suas conseqüências transcricionais a jusante. Um ligand superfamily de TGF-β não pode ter uma conseqüência desenvolvente até que esteja liberado da pilha em que foi produzido. Até recentemente, era difícil determinar quando esses ligantes eram liberados das células. Aqui mostramos como medir a liberação de um BMP Drosophila chamado Decapentaplegic (Dpp) das células do primordium asa ou disco de asa. Este método pode ser modificado para outros sistemas ou ligantes de sinalização.
Introduction
As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são essenciais para a embriogênese embrionária precoce e o padrão das estruturas adultas. Os BMPs são produzidos e secretados para afetar a transcrição dos genes-alvo necessários para o crescimento e a diferenciação celular nas células de resposta. Decapentapla (Dpp) é um homolog Drosophila de BMP4 que é importante para o desenvolvimento de estruturas embrionárias e adultas como a asa1,2,3,4. Vários grupos se concentraram no papel de Dpp no padrão de asas de mosca adulta saem por 1) as asas são compostas por duas folhas transparentes de epitélia com um padrão de venação consistente que pode ser facilmente avaliado; 2) os discos de asa também são razoavelmente planos, podem ser cultivados fora da larva, e são simples de imagem e quantificar diferenças no padrão; e 3) o desenvolvimento do padrão de asa é sensível a Dpp de tal forma que pequenas perturbações no caminho terá impacto padrão de venação das asas.
Dpp é produzido em células localizadas no limite anterior/posterior do disco de asa5,6,7,8. Dpp se liga a um complexo de receptores de quinase serina/threonina tipo 19,10. Após a ligação Dpp, o receptor tipo 2 fosforiatos o receptor tipo 1 que, em seguida, fosforiatomães contra Dpp (Mad), um smad 1/5/8 homolog. O SMAD fosforilado recruta um co-Smad adicional (Madea), que permite entrar no núcleo onde regula os genes-alvo, levando a efeitos a jusante, como proliferação ou diferenciação4,11.
Recentemente, o Laboratório Bates mostrou que a liberação inadequada de Dpp dentro do disco de asa pode levar a uma diminuição da fosforiação louca, redução na expressão gênica alvo e defeitos de padronização de asa12,13. Vários canais de íons impactam o desenvolvimento da asa drosophila e estruturas associadas14,15. Esses canais de íons também podem estar envolvidos na liberação do Dpp. Ao determinar o mecanismo de liberação de morfogênio, é importante que haja um método para visualizar eventos de liberação.
Drs. Aurelio Teleman e Stephen Cohen criou uma proteína de fusão Dpp-GFP que é capaz de resgatar a perda de Dpp, o que significa que é biologicamente ativo e é lançado de forma biologicamente relevante16. Aqui, descrevemos como visualizamos os eventos de lançamento do Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusão é particularmente útil porque gfp é pH sensível de tal forma que quando está em vesículas ácidas, a fluorescência é saciada17. Portanto, quando uma proteína marcada com GFP é liberada de uma vesícula para o ambiente extracelular mais neutro, a intensidade da fluorescência gfp aumenta17. Aproveitamos a sensibilidade ao pH da GFP para determinar se o Dpp-GFP reside em vesículas ácidas. Nós imagemddiscos de asa expressando Dpp-GFP antes e depois da adição de cloreto de amônio, que neutraliza compartimentos intracelulares vesículas18. Encontramos um aumento significativo na fluorescência de puncta após a adição de cloreto de amônio, sugerindo que o Dpp-GFP intracelular é saciado antes da adição de cloreto de amônio18. Concluímos que o Dpp-GFP intracelular reside em compartimentos ácidos ligados à membrana, como vesículas, e é insaciável após a adição de cloreto de amônio para neutralizar o pH dos compartimentos intracelulares18. Isso torna a imagem ao vivo do Dpp-GFP uma técnica útil para visualizar a dinâmica do Dpp no disco da asa drosophila, uma vez que é liberado de compartimentos ácidos para o ambiente extracelular.
Aqui, descrevemos o método que usamos para visualizar eventos de lançamento do Dpp usando o Dpp-GFP. Dpp-GFP pode ser expressa em seu padrão nativo em discos de asa Drosophila usando o sistema UAS-GAL419. Este é o método que foi usado para determinar que os canais Irk impacto Dpp liberação18. Validamos o método por meio de imagens ao vivo z-pilhas. Nós não vemos Dpp-GFP puncta movendo-se dentro do plano de foco na série de tempo, se adquirimos em um plano de foco. Nós também não vemos movimento de Dpp-GFP puncta se nós imaged em um z-pilha. Concluímos que o Dpp-GFP puncta visto usando este método são eventos de liberação, em vez de movimento de vesículas intracelularmente. Este método de imagem ao vivo do Dpp-GFP poderia potencialmente ser usado para testar outros modificadores putativos de liberação Dpp por seu impacto na dinâmica Dpp ou poderia ser modificado para olhar para a dinâmica de outros ligantes
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Protocol
1. Coleta de ovos para gerar larvas para dissecação
- Cruz 30-40 virgem fêmea Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu voa para 10-15 masculino Sp / CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
Nota: Quaisquer dois genótipos contendo Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP podem ser usados enquanto os balanceadores tiverem marcadores larvais que permitem a seleção da progênie apropriada durante o estágio larval. - Para coletar ovos, vire as moscas cruzadas em um frasco fresco de comida e permita que elas coloquem por 3-4 h antes de removê-los do frasco. Para incentivar a postura de ovos, uma pequena quantidade de pasta de fermento feita de levedura granulada misturada com uma pequena quantidade de água pode ser adicionada ao topo dos alimentos antes que as moscas sejam introduzidas no frasco. O mesmo conjunto de moscas cruzadas pode ser mantido e usado por até 7 dias de coleta de ovos.
Nota: Qualquer receita padrão de alimentos para fubás Drosophila deve ser aceitável. Usado aqui é a receita de alimentos descrito por Hazegh e Reis20. - Mantenha os frascos de coleta de ovos a 25 °C por aproximadamente 144 h até que as larvas estejam no terceiro estágio instar (errante).
- Para selecionar as larvas apropriadas para dissecação (aqueles que expressam dpp-gal4 e UAS-Dpp-GFP) primeiro escolher larvas que não são tb. Estas larvas serão de comprimento normal, em vez de curto e gordo.
- Entre as larvas não tb, haverá larvas expressando CyO-GFP e larvas expressando Dpp-GFP. Para selecionar as larvas expressando Dpp-GFP, veja-as um estómicroscópio de fluorescência. Enquanto tanto Dpp-GFP quanto CyO-GFP expressando larve terão alguma fluorescência gfp, o Dpp-GFP expressando larvas pode ser distinguido na medida em que o GFP é restrito aos discos de asa e a fluorescência é muito menos brilhante do que o CyO-GFP expressando larvas. Selecione estas larvas menos brilhantes para dissecação.
2. Preparação de solução para imagens larvais e dissecação
- Para imagens ao vivo de discos de asa, prepare a mídia HL3 modificada21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 dishydrate, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose dyhydrate, 115 mM sacarose, 5 mM HEPES). Esta mídia permite que o disco de asa para ser mantido vivo para a imagem21.
- Ajuste o pH para 7,1 usando HEPES e filtre com um filtro de 0,22 μm. Use esta mídia tanto para as dissecações de disco de asa e como a mídia de montagem para imagens ao vivo.
3. Preparando slides para montagem de disco de asa
- Coloque dois pedaços de fita dupla face incolor em largura através de um slide de microscópio, deixando um espaço de cerca de 5 mm entre eles. As partes de fita devem ser longas bastante que as extremidades da fita se encontram niveladas com as bordas da corrediça do microscópio.
- Use uma borda plana (como a extremidade do punho de um par de fórceps dissecando) para pressionar a fita firmemente para o slide para que nenhuma mídia pode infiltrar-se debaixo dela.
- Coloque 25 μL de mídia HL3 modificada entre as duas peças de fita. O disco de asa será montado nesta gota de mídia entre pedaços de fita para que a fita impeça o coverslip de esmagar o disco (Figura 1A).
4. Dissecando e montando discos de asa para imagem
- Dissecar larvas na mídia HL3 modificada preparada26.
- Rasgue delicadamente as larvas ao meio usando dois pares de fórceps e descarte a metade posterior da larva.
- Segure o meio da metade anterior da larva com um par de fórceps e use outro par de fórceps fechados para empurrar os ganchos de boca de volta para a larva até que a larva esteja completamente invertida.
- Os discos de asa podem ser encontrados mais facilmente procurando as curvas afiadas nos dois ramos primários de cor mais escura das traqueias que escorrem por ambos os lados das larvas. Os discos de asa encontram-se diretamente estas curvas nas traqueias em uma larva invertida.
- Retire suavemente os discos de asa e transfira-os para os 25 μL da mídia HL3 no slide do microscópio preparado. É importante certificar-se de que nenhuma parte de traqueia está deixada unida aos discos dissecados da asa porque esta pode fazer com que os discos flutuem, fazendo a imagem latente difícil.
- Disponha o disco de asa para que o lado peripodial da bolsa da asa esteja voltado para cima, longe do deslizamento do microscópio, com o disco deitado (ver Figura 1A,B).
- Cubra o disco de asa e fita com um coverslip e selar o coverslip usando esmalte. Uma vez que o polonês está seco, imediatamente proceder para os passos de imagem abaixo.
5. Liberação de Dpp da imagem latente
- Imagem do disco de asa montado usando um microscópio de varredura de laser confocal com um objetivo de óleo 40x e 488 nm laser. O Dpp-GFP deve aparecer como uma faixa de fluorescência GFP para baixo do centro do disco de asa com pequena puncta de Dpp-GFP sendo liberado a partir desta faixa central de células.
- Coletar imagens a uma velocidade de 2 Hz por 2 min para visualizar a liberação dpp. Para obter melhores resultados, definir o laser em uma configuração apenas forte o suficiente para obter uma imagem clara das células liberadoras de Dpp para evitar o branqueamento excessivo durante a coleta de imagens. As imagens podem ser coletadas como uma série de tempo que pode então ser exportada como arquivos AVI (sem compressão, 3 quadros /s) para obter arquivos de vídeo da versão Dpp.
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Representative Results
A figura 2 mostra resultados representativos de imagem ao vivo deste protocolo. Quando o protocolo é bem sucedido, Dpp-GFP pode ser visto como uma faixa para baixo do centro do disco de asa com núcleos visíveis como círculos não fluorescentes dentro da região dpp-GFP (Figura 2). A liberação de Dpp-GFP é visível como pontuatura fluorescente que aparece e desaparece. Observamos a fluorescência de Dpp-GFP aparecendo e desaparecendo nos corpos celulares e longe dos corpos celulares. Dpp sinalização é dependente de criina baseada filopodia-como estruturas chamadas citonemes que se estendem longe do corpo celular22,23. Portanto, é provável que Dpp-GFP puncta que são visualizados longe dos corpos celulares produtores de Dpp nestes vídeos apresentados são prováveis em citonemes ou em citoneme "sinapses"15. Estes puncta são mais aparentes perto do limite D/V, que pode ser visto como a lacuna na faixa Dpp-GFP.
A figura 3 mostra um resultado abaixo do ideal. No método descrito aqui, os discos de asa são montados de modo que o lado peripodial enfrenta longe da lâmina do microscópio de modo que o disco seja imaged do lado peripodial (como mostrado na figura 1B). Se o disco de asa é imagemdo do lado inverso, ou seja, lado peripodial em direção ao slide do microscópio, a fluorescência Dpp-GFP aparecerá fora de foco e resolução será pobre, resultando no resultado suboptimal mostrado na Figura 3. A etapa 4.6 é, portanto, fundamental para garantir que o disco da asa esteja deitado na orientação correta antes da imagem de imagem para evitar esse resultado.
Figura 4 mostra uma série de imagens de um Dpp >GFP (dpp-GAL4; UAS-GFP) terceiro disco de asa larval instar. Quando gfp não é fundido a Dpp, não observamos a aparência de puncta fora dos corpos celulares. Esse controle é importante para a conclusão de que o Dpp-GFP se comporta de forma diferente do que apenas a GFP.
A Figura 5 mostra uma série de imagens de um motorista dpp-GAL4 sozinho terceiro disco de asa larval instar. As imagens foram tiradas com as mesmas configurações de aquisição de microscópio que todas as outras amostras. Estas imagens mostram que a pontuatura fluorescente não aparece quando o Dpp-GFP não é expresso.
Figura 1: Ilustração da configuração da montagem do disco da asa. Para imagem dpp-gfp lançamento, os discos de asa dissecada deve ser montado como mostrado. (A) Duas peças de fita dupla face são colocadas em termos de largura em toda a lâmina do microscópio com o disco de asa montado em mídia HL3 modificada entre a fita. (B)Vista lateral de um disco de asa corretamente montado. O disco é orientado para que o lado peripodial da bolsa da asa enfrenta para cima em direção ao coverslip. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Vídeo representativo da liberação de Dpp-GFP no disco da asa. Dpp-GFP foi expressa no disco de asa usando o sistema UAS-GAL4. Aqui é mostrado um vídeo representativo dos resultados de imagem ao vivo da versão Dpp-GFP. Os núcleos celulares podem ser vistos como lacunas circulares na fluorescência. Secreted Dpp-GFP pode ser visto como pontuação brilhante. Devido ao contraste, estes puncta brilhantes são mais fáceis de observar fora da região, que inclui os corpos celulares produtores de Dpp. Tal área é indicada por um retângulo que desapareça após os primeiros quadros. As direções ventral e posteriores do disco da asa são indicadas pelas setas. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Figura 3: Resultado abaixo do ideal da imagem de liberação do Dpp-GFP. Exemplo de um resultado suboptimal que ocorra se o disco da asa é lado peripodial orientado para baixo. Devido à orientação incorreta da bolsa de disco de asa Dpp-GFP não está em foco, núcleos claros não podem ser vistos, e a resolução permanece pobre, não importa como os parâmetros do microscópio são ajustados. As direções ventral e posteriores do disco da asa são indicadas pelas setas. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Figura 4: Vídeo representativo da expressão gfp em células produtoras de Dpp do disco de asa. Expressão GFP aparece brilhantemente nos corpos celulares e não aparece como pontualidade brilhante liberada na periferia. As direções ventral e posteriores do disco da asa são indicadas pelas setas. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
Figura 5: Vídeo representativo de dpp-Gal4 terceiro saque instar discos de asa sem a expressão de Dpp-GFP ou GFP. Se gal4 não pode conduzir a expressão de GFP ou Dpp-GFP devido à falta de UAS-GFP ou UAS-Dpp-GFP, nenhuma fluorescência é observada. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
BMPs como Dpp fazer seu impacto significativo quando ligam um complexo de receptores ligados à membrana para causar uma cascata de sinalização intracelular em células vizinhas ou aparentemente distantes. O laboratório do Dr. Thomas Kornberg mostrou que as células que produzem as células de contato com sinal Dpp que recebem o sinal usando estruturas finas de filapodia à base de actina chamadas citonemes15,24,25. Estes dados sugerem que a comunicação célula-célula de desenvolvimento neste contexto pode ser semelhante a uma sinapse neuronal26. Na comunicação sináptica, a dinâmica da liberação do neurotransmissor é crucial para o seu efeito sobre a célula postináptica. Da mesma forma, a dinâmica da liberação Dpp também são importantes para suas conseqüências a jusante12. Portanto, é importante ser capaz de medir a dinâmica da liberação de Dpp em diferentes origens e condições genéticas para entender quais fatores afetam a liberação de Dpp.
Aqui apresentamos o método otimizado para a liberação de Dpp de imagem. Nós também tentamos usar poços para cultura o disco de asa para imagem. Muito profundo de um poço pode resultar em dificuldade em se concentrar nos eventos de lançamento do Dpp. Além disso, o disco de asa pode se mover durante a imagem ao vivo, o que complica a análise. Fita dupla do lado permite espaço suficiente entre o deslizamento de tampa e slide para evitar o esmagamento do disco da asa, permitindo o foco adequado. Descobrimos que ligar o microscópio em meia hora antes da imagem para permitir que o microscópio para aquecer impede a deriva da imagem durante a duração do vídeo. A colocação do disco da asa com o lado peripodial da bolsa da asa voltada para cima é muito importante para a liberação de Dpp de imagem. Descobrimos que a orientação oposta não nos permite imagem Dpp lançamento eventos.
Este método poderia ser usado para procurar modificadores genéticos da liberação de Dpp. Temos observado que a inibição de um canal de íons impactos Dpp liberação12. Outros canais de íons também podem afetar a dinâmica de liberação do Dpp. Poderíamos também testar como as condições ambientais, como teratógenos afetam a liberação de Dpp. Modifiers of Dpp release pode revelar o mecanismo molecular que controla a secreção de ligand. A dinâmica de liberação pode ser importante para as consequências a jusante de vários ligantes de sinalização de desenvolvimento diferentes. Embora tenhamos descrito apenas como nós imagem dpp liberação, outros ligantes como ouriço foram observados em cytoneme mediado sinalização e poderia ser regulada por um mecanismo semelhante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Sarala Pradhan por trabalhar em uma versão anterior deste protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NSF-IOS 1354282 pelo financiamento enquanto desenvolvemos este protocolo. Gostaríamos de agradecer ao NIH-NIDCR RO1DE025311 pelo financiamento do nosso laboratório atualmente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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