Summary
Tidspunktet for eksponering for ligander kan påvirke deres udviklingsmæssige konsekvenser. Her viser vi hvordan man billede frigivelse af en Drosophila knogle morfogenetisk protein (BMP) kaldet DPP fra celler i vinge skiven.
Abstract
Den transformerende vækstfaktor-Beta (TGF-β) super familie er afgørende for tidlig embryonale mønster og udvikling af voksne strukturer i flercellede organismer. Den TGF-β superfamilien omfatter TGF-β, knogle morfogenetisk protein (bmps), activins, vækst og differentiering faktorer, og nodals. Det har længe været kendt, at mængden af ligand udsat for celler er vigtig for dens virkninger. Det blev antaget, at langtrækkende koncentrations gradienter oprettet embryonale mønster. Men for nylig er det blevet klart, at tidspunktet for udsættelse for disse ligander er også vigtigt for deres downstream transkriptionelle konsekvenser. En TGF-β super familie ligand kan ikke have en udviklingsmæssige konsekvens, før den frigives fra den celle, hvor den blev produceret. Indtil for nylig var det svært at afgøre, hvornår disse ligander blev frigivet fra celler. Her viser vi hvordan man måler frigivelsen af en Drosophila BMP kaldet Decapentaplegic (DPP) fra cellerne i Wing primordium eller Wing disc. Denne metode kan ændres for andre systemer eller signalering ligands.
Introduction
Knogle morfogenetiske proteiner (BMPs) er afgørende for tidlig embryogenese og mønster af voksne strukturer. BMPs produceres og udskilles for at påvirke transkriptionen af målgener, der er nødvendige for vækst og Celledifferentiering i responderende celler. Decapentaplegic (DPP) er en Drosophila ligner af BMP4, der er vigtig for udviklingen af embryonale og voksne strukturer som vinge1,2,3,4. Flere grupper har fokuseret på rollen som DPP i mønstret voksen flue vinger, fordi 1) vingerne består af to gennemsigtige epitel ark med et konsistent åretegningen mønster, der let kan vurderes; 2) vinge skiver er også rimeligt fladt, kan dyrkes uden for Larven, og er enkle at billede og kvantificere forskelle i mønster; og 3) vinge mønsteret udvikling er følsom over for DPP sådan, at små forstyrrelser i vejen vil påvirke vinge åretegningen mønster.
DPP produceres i celler beliggende i den forreste/bageste grænse af vinge skiven5,6,7,8. DPP binder sig til et kompleks af type 1 og type 2 Serin/threonine kinase receptorer9,10. Ved DPP binding, type 2 receptor fosforylerer type 1 receptor, som derefter fosforylerer mødre mod DPP (mad), en SMAD 1/5/8 homolog. Fosforylerede SMAD rekrutterede en yderligere Co-SMAD (Medea), som gør det muligt at komme ind i kernen, hvor det regulerer målgener, hvilket fører til downstream-effekter såsom spredning eller differentiering4,11.
For nylig, Bates Lab har vist, at forkert frigivelse af DPP i vinge skiven kan føre til et fald i mad fosforylering, reduktion i Target genekspression, og vinge mønster defekter12,13. Flere ion-kanaler påvirker udviklingen af Drosophila -fløjen og tilhørende strukturer14,15. Disse ion-kanaler kan også være involveret i DPP-udgivelse. Ved fastsættelsen af mekanismen i morphogen frigivelse, er det vigtigt, at der er en metode til at visualisere frigivelse begivenheder.
DRs. Aurelio Teleman og Stephen Cohen skabte et DPP-GFP-fusionsprotein, der kan redde tab af DPP, hvilket betyder, at det er biologisk aktivt og frigives på en biologisk relevant måde16. Her beskriver vi, hvordan vi visualiserer DPP-udgivelses hændelser ved hjælp af denne DPP-GFP. Dette fusionsprotein er især nyttigt, fordi GFP er pH-følsom, således at fluorescensen slukkes17, når det er i sure vesikler. Når et protein mærket med GFP frigives fra et vesikel til det mere neutrale ekstracellulære miljø, øger GFP-fluorescens intensitet17. Vi udnyttede GFP ' pH-følsomhed til at afgøre, om DPP-GFP bor i sure vesikler. Vi afbildet vinge skiver udtrykker DPP-gfp før og efter tilsætning af ammoniumklorid, som neutraliserer intracellulære rum vesikler18. Vi fandt en signifikant stigning i fluorescens af punkta efter tilsætning af ammoniumklorid, hvilket tyder på, at intracellulær DPP-GFP er slukket før tilsætning af ammoniumklorid18. Vi konkluderer, at intracellulære DPP-GFP bor i sure membranbundne rum, såsom vesikler, og er slukket ved tilsætning af ammoniumklorid for at neutralisere pH af intracellulære rum18. Dette gør levende billeddannelse af DPP-GFP en nyttig teknik til at visualisere dynamikken i DPP i Drosophila Wing disc, da det er frigivet fra sure rum i det ekstracellulære miljø.
Her beskriver vi den metode, vi bruger til at visualisere DPP-udgivelses hændelser ved hjælp af DPP-GFP. DPP-GFP kan udtrykkes i sit oprindelige mønster i Drosophila Wing discs ved hjælp af UAS-GAL4 system19. Dette er den metode, der blev brugt til at bestemme, at irk-kanaler påvirker DPP Release18. Vi validerede metoden ved Live-imaging z-stakke. Vi kan ikke se DPP-GFP punkta bevæger sig inden for det plan af fokus i Time Series, hvis vi har erhvervet i et plan af fokus. Vi kan heller ikke se bevægelsen af DPP-gfp punkta, hvis vi afbildet i en z-stak. Vi konkluderer, at DPP-GFP punkta set ved hjælp af denne metode er frigivelse hændelser snarere end flytning af vesikler intracellulært. Denne metode til Live-imaging af DPP-gfp kunne potentielt bruges til at teste andre formodede modifikatorer af DPP frigivelse for deres indvirkning på DPP dynamik eller kunne ændres til at se på dynamikken i andre ligander
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opsamling af æg til frembringe larver til dissektion
- Cross 30-40 jomfru kvindelige DPP-GAL4/TM6 TB Hu flyver til 10-15 mandlige SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB Hu.
Bemærk: Alle to genotyper, der indeholder DPP-GAL4 og UAS-DPP-GFP, kan anvendes, så længe balancerne har larve markører, som gør det muligt at vælge det relevante afkom i larvestadiet. - For at indsamle æg, flip de krydsede fluer i en frisk hætteglas med mad og tillade dem at lægge for 3 – 4 h før du fjerner dem fra hætteglasset. For at fremme æglægning, en lille mængde gær pasta lavet af granuleret gær blandet med en lille mængde vand kan tilsættes til toppen af fødevarer, før fluerne introduceres til hætteglasset. Det samme sæt krydsede fluer kan opbevares og anvendes i op til 7 dage af ægsamlinger.
Bemærk: Enhver standard Drosophila majsmel mad opskrift bør være acceptabelt. Brugt her er den mad opskrift beskrevet af Hazegh og Reis20. - Hætteglassene med ægsamlingen opbevares ved 25 °C i ca. 144 h, indtil larverne er på det tredje INSTAR stadie (Wandering).
- For at vælge den relevante larver for dissektion (dem, der udtrykker både DPP-GAL4 og UAS-DPP-gfp) først vælge larver, der er ikke-TB. Disse larver vil være normal længde i stedet for kort og fedt.
- Blandt de ikke-TB larver vil der være larver, som udtrykker CyO-GFP og larver, som udtrykker DPP-GFP. For at vælge DPP-GFP udtrykker larverne, se dem under et fluorescens stereomicroskop. Mens både DPP-gfp og CYO-gfp udtrykker kokon vil have nogle gfp fluorescens, DPP-gfp udtrykker larver kan skelnes i, at gfp er begrænset til vinge skiver og Fluorescens er langt mindre lyse end CYO-gfp udtrykker larver. Vælg disse mindre lyse larver til dissektion.
2. klargøring af opløsningen til larve dannelse og dissektion
- Til levende billeddannelse af vinge skiver, Forbered modificeret HL3 Media21 (70 mm NaCl, 5 mm kcl, 1,5 mm CaCl2 Dyhydrat, 4 mm mgcl2, 10 mm NaHCO3, 5 mM trehalosedihydrat dyhydrat, 115 mm saccharose, 5 mm Hepes). Dette medie gør det muligt at holde vinge skiven i live til billeddannelse21.
- Justér pH til 7,1 ved hjælp af HEPES og Filtrer med et 0,22 μm filter. Brug dette medie til både vinge skive dissektionerne og som monterings medie til live Imaging.
3. klargøring af slides til vinge skive montering
- Placer to stykker farveløs dobbeltsidet tape på tværs af et mikroskop slide, der efterlader et rum på ca. 5 mm mellem dem. De stykker af tape bør være lang nok, at enderne af båndet ligger flush med kanterne af mikroskopet dias.
- Brug en flad kant (f. eks. håndtagets ende af et par dissekere-pincet) til at trykke båndet fast på diaset, så der ikke kan trykkes på et medie nedenunder.
- Placer 25 μL modificerede HL3 medier mellem de to stykker tape. Vinge skiven vil blive monteret i denne dråbe af medier mellem stykker tape, således at båndet forhindrer dæksedlen i at knuse disken (figur 1a).
4. dissekting og monterings vinge skiver til billeddannelse
- Dissekere larver i det forberedte modificerede HL3 Media26.
- Forsigtigt rive larver i halve ved hjælp af to par tang og kassere den bageste halvdel af Larven.
- Tag fat i midten af den forreste halvdel af Larven med et par pincet, og brug et andet par lukkede pincet til at skubbe mund krogene tilbage i Larven, indtil Larven er helt inverteret.
- Vinge skiver kan let findes ved at lede efter de skarpe bøjninger i de to mørkere farvede primære grene af tracheae, der løber ned på begge sider af larverne. Vinge skiverne ligger direkte under disse bøjninger i tracheae i en inverteret Larva.
- Fjern forsigtigt vinge skiverne og overfør dem til de 25 μL HL3 medier på det forberedte mikroskopdias. Det er vigtigt at sikre, at der ikke er nogen stykker af luftrøret, som er fastgjort til de dissekterede vinge skiver, da det kan medføre, at skiverne flyder, hvilket gør billeddannelse vanskelig.
- Arranger vinge skiven, så den peripodial side af vinge posen vender opad fra mikroskop sliden med skiven liggende fladt (Se figur 1A, B).
- Dæk vinge skiven og tape med en dækseddel, og forsegl dæksedlen med neglelak. Når den polske er tør, straks gå videre til Imaging trin nedenfor.
5. frigivelse af Imaging DPP
- Billede den monterede vinge skive ved hjælp af en confokal Laserscanning mikroskop med en 40x olie mål og 488 nm laser. DPP-GFP skal fremstå som en stribe af GFP-fluorescens ned i midten af vinge skiven med en lille punkta af DPP-GFP, der frigives fra denne Center stribe af celler.
- Saml billeder med en hastighed på 2 Hz for 2 min at visualisere DPP frigivelse. For de bedste resultater, indstille laseren på en indstilling bare stærk nok til at få et klart billede af DPP-releasing celler for at undgå over-blegning under billedsamling. Billederne kan indsamles som en tidsserie, som derefter kan eksporteres som AVI-filer (ingen komprimering, 3 frames/s) for at få videofiler af DPP frigivelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser repræsentative Live-imaging resultater af denne protokol. Når protokollen er vellykket, kan DPP-GFP ses som en stribe ned i midten af vinge skiven med kerner, der er synlige som ikke-fluorescerende cirkler i DPP-GFP-regionen (figur 2). DPP-GFP-frigivelse er synlig som fluorescerende punkta, der vises og forsvinder. Vi har observeret DPP-GFP fluorescens optræder og forsvinder i cellen organer og langt fra cellen organer. DPP signalering er afhængig af actin-baserede filopodia-lignende strukturer kaldet cytonemes, der strækker sig langt fra cellen krop22,23. Derfor er det sandsynligt, at DPP-GFP punkta, der er visualiseret langt fra DPP-producerende celle organer i disse præsenterede videoer er sandsynligvis i cytonemes eller på cytoneme "synapser"15. Disse punkta er mest synlige tæt på D/V-grænsen, som kan ses som hullet i DPP-GFP-striben.
Figur 3 viser et suboptimalt resultat. I den beskrevne metode monteres vinge skiverne således, at den peripodial side vender væk fra mikroskop sliden, således at skiven er afbildet fra peripodial side (som vist i figur 1b). Hvis vinge skiven er afbildet fra bagsiden, der er peripodial side mod mikroskopet slide, vil DPP-gfp fluorescens fremstå ude af fokus og opløsningen vil være dårlig, hvilket resulterer i det suboptimale resultat vist i figur 3. Trin 4,6 er derfor afgørende for at sikre, at vinge skiven ligger fladt i den korrekte retning før billeddannelse for at undgå dette resultat.
Figur 4 viser en tidsserie af billeder af en dpp > gfp (DPP-GAL4; (Eller UAS-GFP) tredje INSTAR larve vinge skive. Når GFP ikke er smeltet til DPP, vi ikke observere udseendet af punkta uden for cellen organer. Denne kontrol er vigtig for den konklusion, at DPP-GFP opfører sig anderledes end GFP alene.
Figur 5 viser en tidsserie af billeder af en DPP-GAL4-driver alene tredje INSTAR larve Wing disc. Billeder blev taget med de samme mikroskop erhvervelse indstillinger som alle de andre prøver. Disse billeder viser, at der ikke forekommer fluorescerende punkta, når DPP-GFP ikke udtrykkes.
Figur 1: illustration af opsætning af vinge skive montering. For at afbilde DPP-GFP-frigivelse skal de dissekterede vinge skiver monteres som vist. (A) to stykker dobbeltklæbende tape anbringes på tværs afmikroskopetmed vinge skiven monteret i modificerede HL3 medier mellem båndet. B) side visning af en korrekt monteret vinge skive. Skiven er orienteret, så den peripodial side af vinge posen vender opad mod dæksedlen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ video af DPP-gfp-udgivelse i vinge skiven. DPP-GFP blev udtrykt i vinge skiven ved hjælp af UAS-GAL4 systemet. Vist her er en repræsentativ video af Live imaging resultater af DPP-GFP udgivelse. Cellekerner kan ses som cirkulære huller i fluorescens. Udskillet DPP-GFP kan ses som lyse punkta. På grund af kontrasten er disse lyse punkta lettest at observere uden for regionen, der omfatter DPP-producerende celle organer. Et sådant område er angivet med et rektangel, der forsvinder efter de første par billeder. De ventrale og bageste retninger af vinge skiven er angivet med pilene. Venligst klik her for at downloade denne video.
Figur 3: suboptimalt resultat af DPP-GFP Release Imaging. Eksempel på et suboptimalt resultat, der opstår, hvis vinge skiven er orienteret peripodial side nedad. På grund af den forkerte retning af vinge skiven pose DPP-GFP er ikke i fokus, klare kerner kan ikke ses, og opløsningen forbliver fattig, uanset hvordan parametrene for mikroskopet justeres. De ventrale og bageste retninger af vinge skiven er angivet med pilene. Venligst klik her for at downloade denne video.
Figur 4: repræsentativ video af GFP-udtryk i DPP-producerende celler i vinge skiven. GFP-udtryk vises smukt i celle ligene og vises ikke som en lys punkta, der frigives i periferien. De ventrale og bageste retninger af vinge skiven er angivet med pilene. Venligst klik her for at downloade denne video.
Figur 5: repræsentativ video af DPP-Gal4 tredje INSTAR vinge skiver uden ekspression af DPP-gfp eller gfp. Hvis Gal4 ikke kan drive ekspression af GFP eller DPP-GFP på grund af manglende UAS-GFP eller UAS-DPP-GFP, observeres der ingen fluorescens. Venligst klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BMPs som DPP gør deres betydelige indflydelse, når de binder et kompleks af membranbundne receptorer til at forårsage en kaskade af intracellulære signalering i tilstødende eller tilsyneladende fjerne celler. Dr. Thomas kornbergs laboratorium har vist, at celler, der producerer DPP signal kontakt celler, der modtager signalet ved hjælp af actin baseret tynde filapodia-lignende strukturer kaldet cytonemes15,24,25. Disse data tyder på, at udviklingsmæssige celle-celle kommunikation i denne sammenhæng kan være magen til en neuronal synapse26. I synaptisk kommunikation, dynamikken i neurotransmitter frigivelse er afgørende for dens virkning på den postsynaptiske celle. Tilsvarende er dynamikken i DPP-udgivelsen også vigtig for dens downstream-konsekvenser12. Derfor er det vigtigt at være i stand til at måle dynamikken i DPP frigivelse i forskellige genetiske baggrunde og betingelser for at forstå, hvilke faktorer påvirker DPP frigivelse.
Her har vi præsenteret den optimerede metode til billede DPP udgivelse. Vi har også forsøgt at bruge brønde til kultur vinge skiven til billeddannelse. For dybt af en brønd kan resultere i problemer med at fokusere på DPP frigivelse begivenheder. Desuden kan vinge skiven bevæge sig under Live imaging, hvilket komplicerer analysen. Dobbeltsidet tape giver plads nok mellem Cover glide og slide for at forhindre knusning af vinge skiven, samtidig med at den giver et ordentligt fokus. Vi har konstateret, at dreje mikroskopet på en halv time før billeddannelse at tillade mikroskop til at varme op forhindrer afdrift af billedet i løbet af videoens varighed. Placering af vinge skiven med peripodial side af vinge posen vender opad er meget vigtigt for Imaging DPP frigivelse. Vi fandt, at den modsatte orientering ikke tillader os at billede DPP frigivelse begivenheder.
Denne metode kan bruges til at lede efter genetiske modifikatorer af DPP frigivelse. Vi har observeret, at hæmning af en ion-kanal påvirker DPP Release12. Andre ion-kanaler kan også påvirke DPP Release Dynamics. Vi kunne også teste, hvordan miljøforhold som teratogener påvirker frigivelsen af DPP. modifikatorer af DPP frigivelse kan afsløre den molekylære mekanisme, der styrer ligand sekretion. Release dynamik kan være vigtigt for downstream konsekvenser af flere forskellige udviklingsmæssige signalering ligands. Mens vi kun har beskrevet, hvordan vi billede DPP frigivelse, andre ligander som pindsvin er blevet observeret i cytoneme medieret signalering og kunne reguleres af en lignende mekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Sarala Pradhan for at have arbejdet på en tidligere version af denne protokol. Vi vil gerne takke NSF-IOS 1354282 for finansiering, mens vi udviklede denne protokol. Vi vil gerne takke NIH-NIDCR RO1DE025311 for at finansiere vores laboratorium i øjeblikket.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
