Summary
وقد يؤثر توقيت التعرض للمضايق علي اثارها الانمائيه. هنا نعرض كيفيه الإفراج عن صوره من البروتين الوراثي العظام دروفوليا (BMP) تسمي النيابة التقدمية من خلايا القرص الجناح.
Abstract
عامل النمو تحويل-بيتا (tgf-β) [سوبرفميلي] ضروري لزخرفه الجنينية في وقت مبكر وتطوير هياكل الكبار في الكائنات متعددة الخلايا. وتشمل العائلة الفائقة TGF-β TGF-β ، بروتين العظام الموريفوجيني (BMPs) ، Activins ، والنمو وعوامل التمايز ، وعقيديه. ومن المعروف منذ فتره طويلة ان كميه الاربطه المعرضة للخلايا مهمة لأثاره. وكان يعتقد ان تدرجات التركيز طويلة المدى اعداد نمط الجنينية. ومع ذلك ، أصبح من الواضح في الاونه الاخيره ان توقيت التعرض لهذه اليغاندس مهم أيضا لعواقبها النقل النهائي. ولا يمكن ان يكون لهذه الاسره الفائقة الأثر التنموي حتى يتم إطلاقها من الخلية التي أنتجت فيها. وحتى وقت قريب ، كان من الصعب تحديد متى تم الإفراج عن هؤلاء المدافعين من الخلايا. هنا نعرض كيفيه قياس الإفراج عن دروفيسيلا BMP تسمي ديبننتابلاييك (النيابة التقدمية) من خلايا الجناح القرص أو الجناح. يمكن تعديل هذه الطريقة للانظمه الأخرى أو للاشاره إلى الإشارات الليفية.
Introduction
البروتينات الدهنية العظمية (BMPs) ضرورية لتولد الاجنه في وقت مبكر وزخرفه هياكل البالغين. يتم إنتاج BMPs ويفرز للتاثير علي النسخ من الجينات المستهدفة اللازمة للنمو وتمايز الخلايا في الخلايا المستجيبة. قطع الراس (النيابة التقدمية) هي دروفيميلا هوكولوغ من BMP4 التي هي مهمة لتطوير البني الجنينية والبالغين مثل الجناح1،2،3،4. وقد ركزت عده مجموعات علي دور النيابة العامة في اجنحه يطير الكبار زخرفه لان 1) وتتالف الاجنحه من اثنين من أوراق النعت شفافة مع نمط التعرق متسقة التي يمكن تقييمها بسهوله; 2) أقراص الجناح هي أيضا مسطحه بشكل معقول ، يمكن ان يكون مثقفا خارج اليرقة ، وبسيطه للصورة والاختلافات الكمية في نمط ؛ و 3) الجناح نمط التنمية حساسة لل النيابة العامة من هذا القبيل ان الاضطرابات الصغيرة في المسار سوف تؤثر علي نمط تعرق الجناح.
يتم إنتاج النيابة العامة في الخلايا الموجودة في الحدود الاماميه/الخلفية للقرص الجناح5،6،7،8. النيابة التقدمية يربط إلى مجمع من نوع 1 ونوع 2 سيرين/threonine كيناز مستقبلات9,10. علي [شف] ربط, النوع 2 مستقبل فوسفولات النوع 1 مستقبل اي بعد ذلك [فوسفورلتس] أمهات ضد [شف] ([ماد]), [سماد] 1/5/8 [هوولوغ]. [فوسفورلتد] [سماد] يجند اضافيه [ك-سماد] ([مديه]), اي يمكن هو دخلت إلى النواة حيث هو ينظم مورثات مستهدفه, يقود إلى مصب تاثيرات مثل انتشار أو تمييز4,11.
في الاونه الاخيره ، وقد أظهرت مختبر بيتس ان الإفراج غير لائق من النيابة العامة داخل القرص الجناح يمكن ان يؤدي إلى انخفاض في الفوسفات جنون ، والحد من التعبير الجيني المستهدف ، والجناح زخرفه العيوب12،13. العديد من القناات الايونيه تؤثر علي تطوير جناح دروفيبيلا والهياكل المرتبطة به14،15. ويمكن ان تشارك هذه القناات الايونيه أيضا في الإفراج عن النيابة العامة. في تحديد اليه الإفراج عن مورفجين ، من المهم ان هناك طريقه لتصور احداث الإصدار.
وقد إنشا السيد اوريليو تيلمان وستيفن كوهين بروتينا منصهرا للتقدمي-GFP قادرا علي إنقاذ فقدان النيابة العامة ، وهذا يعني انها نشطه بيولوجيا ويتم إطلاقها بطريقه ذات صله بيولوجيا16. هنا ، ونحن وصف كيف يمكننا تصور الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية باستخدام هذا الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP. هذا البروتين الانصهار مفيد بشكل خاص لان GFP حساسة لدرجه الحموضة حيث انه عندما يكون في الحويصلات الحمضية ، ويروي فلوري17. ولذلك ، عندما يتم الإفراج عن بروتين الموسومة مع GFP من حويصلة في بيئة أكثر حياديه خارج الخلية ، وزيادة كثافة الفلورية GFP17. أخذنا الاستفادة من حساسية الأس الهيدروجيني من GFP لتحديد ما إذا كان النائب العام التقدمي-GFP يقيم في الحويصلات الحمضية. نحن تصوير أقراص الجناح التعبير عن الحزب التقدمي الاشتراكي-gfp قبل وبعد أضافه كلوريد الأمونيوم ، والتي تحييد المقصورات داخل الخلايا الحويصلات18. وجدنا زيادة كبيره في مضان من الثقوب بعد أضافه كلوريد الأمونيوم ، مما يوحي بان التقدمي-GFP داخل الخلايا هو مروي قبل أضافه كلوريد الأمونيوم18. ونحن نستنتج ان النيابة العامة داخل الخلايا-GFP يتواجد في مقصورات الغشاء الحمضية ، مثل الحويصلات ، وغير مروي علي أضافه كلوريد الأمونيوم لتحييد الأس الهيدروجيني من المقصورات داخل الخلايا18. وهذا يجعل التصوير الحي للحزب التقدمي الاشتراكي-GFP أسلوبا مفيدا لتصور ديناميات النيابة العامة في قرص جناح دروفيسيلا حيث يتم إطلاقها من المقصورات الحمضية في البيئة خارج الخلية.
هنا ، ونحن وصف الطريقة التي نستخدمها لتصور الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية باستخدام الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP. ويمكن التعبير عن الحزب التقدمي الاشتراكي في نمطه الأصلي في أقراص جناح دروفيا باستخدام نظام GAL419. هذا هو الأسلوب الذي تم استخدامه لتحديد ان قنوات Irk تؤثر علي الإفراج عن النيابة العامة18. قمنا بالتحقق من صحة الأسلوب عن طريق التصوير الحي لأكوام z. نحن لا نري الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP ثقب في التحرك داخل الطائرة من التركيز في سلسله زمنيه إذا حصلنا علي مستوي واحد من التركيز. كما اننا لا نري حركه النيابة العامة-GFP ثقب إذا كنا الذين في كومه z. ونستنتج ان ثقب النيابة-GFP التي شوهدت باستخدام هذه الطريقة هي احداث الإفراج بدلا من حركه الحويصلات اينتراسيلولارلي. ويمكن استخدام هذه الطريقة من التصوير الحي للحزب التقدمي الاشتراكي-gfp لاختبار المعدلات المفترضة الأخرى من الإفراج عن النيابة التقدمية لتاثيرها علي ديناميات النيابة التقدمية أو يمكن تعديلها للنظر في ديناميات يغاندس الأخرى
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع البيض لتوليد اليرقات لتشريح
- الصليب 30-40 عذراء الإناث GAL4/TM6 Tb هو الذباب إلى 10-15 ذكر Sp/CyO-GFP ؛ UAS-الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP/TM6 Tb هو.
ملاحظه: ويمكن استخدام اي نوعين من الأنماط الجينية التي تحتوي علي GAL4 و uas-النيابة التقدمية ، طالما كان لموازن علامات يرقات تسمح باختيار النسل المناسب خلال مرحله اليرقات. - لجمع البيض ، والوجه عبرت الذباب في قارورة جديده من الطعام والسماح لهم لوضع ل 3-4 ح قبل ازالتها من القارورة. لتشجيع زرع البيض ، وكميه صغيره من عجينه الخميرة مصنوعة من حبيبات الخميرة مختلطة مع كميه صغيره من الماء يمكن ان تضاف إلى الأعلى من الطعام قبل ان يتم تقديم الذباب إلى القارورة. يمكن الاحتفاظ بنفس المجموعة من الذباب المتقاطع واستخدامها لمده تصل إلى 7 أيام من مجموعات البيض.
ملاحظه: اي وصفه غذائية لوجبة الذرة العادية يجب ان تكون مقبوله. يستخدم هنا هو وصفه الطعام الموصوفة من قبل Hazegh و Reis20. - الحفاظ علي قارورة جمع البيض في 25 درجه مئوية لحوالي 144 ساعة حتى اليرقات في المرحلة instar الثالث (يتجول).
- لتحديد اليرقات المناسبة لتسلخ (أولئك الذين يعبرون عن كل من GAL4 و UAS-النيابة التقدمية-GFP) أولا اختيار اليرقات التي هي غير السل. ستكون هذه اليرقات الطول الطبيعي بدلا من القصير والدهون.
- ومن بين اليرقات غير السل ستكون هناك يرقات تعبر عن CyO-GFP واليرقات التي تعبر عن التقدمي-GFP. لتحديد اليرقات التي تعبر عن يرقات ، قم بعرضها تحت المجسم الفراغي الفلوري. في حين ان كلا من النيابة العامة-GFP و CyO-GFP التعبير عن larve سيكون لها بعض الفلورية GFP ، والنيابة العامة-GFP التعبير عن اليرقات يمكن تمييزها في ان GFP يقتصر علي أقراص الجناح والفلوري هو اقل إشراقا من CyO-GFP التعبير عن اليرقات. حدد هذه اليرقات اقل إشراقا لتشريح.
2. اعداد الحل للتصوير الlarval وتشريح
- للتصوير الحي للأقراص الجناح ، واعداد تعديل HL3 وسائل الاعلام21 (70 mm كلوريد الصوديوم ، 5 ملم kcl ، 1.5 Mm cacl2 Dyhydrate ، 4 مم mgcl2، 10 ملم نهكو3، 5 مم تريهالوز الهيدرات ، 115 mm السكروز ، 5 مم hepes). هذه الوسائط تسمح للقرص الجناح ان تبقي علي قيد الحياة للتصوير21.
- ضبط درجه الحموضة إلى 7.1 باستخدام HEPES وتصفيه مع فلتر 0.22 μm. استخدم هذه الوسائط لفصل كل من قرص الجناح والوسائط المتصاعدة للتصوير المباشر.
3. اعداد الشرائح لتركيب القرص الجناح
- وضع قطعتين من الشريط عديم اللون علي الوجهين widthwise عبر شريحة المجهر ، وترك مساحة حوالي 5 ملم بينهما. يجب ان تكون قطعه من الشريط طويلة بما يكفي ان نهايات الشريط تكمن دافق مع حواف الشريحة المجهر.
- استخدام حافه مسطحه (مثل نهاية مقبض زوج من الملقط تشريح) للضغط علي الشريط بحزم إلى الشريحة بحيث لا يمكن ان تتسرب الوسائط تحته.
- ضع 25 μL من الوسائط المعدلة HL3 بين قطعتي الشريط. سيتم تركيب القرص الجناح في هذه القطرة من وسائل الاعلام بين قطعه من الشريط بحيث يمنع الشريط كوفيرسليب من سحق القرص (الشكل 1a).
4. تشريح وتركيب أقراص الجناح للتصوير
- تشريح يرقات في ال يعد يعدل [HL3 مديا]26.
- المسيل للدموع بلطف اليرقات في النصف باستخدام اثنين من أزواج من ملقط وتجاهل النصف الخلفي من اليرقة.
- فهم منتصف النصف الامامي من اليرقة مع زوج واحد من ملقط واستخدام زوج آخر من ملقط مغلقه لدفع السنانير الفم مره أخرى إلى اليرقة حتى يتم مقلوب اليرقة تماما.
- يمكن العثور علي أقراص الجناح بسهوله أكبر من خلال البحث عن الانحناءات الحاده في الفرعين الرئيسيين الداكنين الملونين للقصبة الهوائية التي تعمل أسفل جانبي اليرقات. تقع الاقراص الجناح مباشره تحت هذه الانحناءات في القصبة الهوائية في يرقه مقلوبه.
- أزاله بلطف أقراص الجناح ونقلها إلى 25 μL من وسائل الاعلام HL3 علي الشريحة المجهر المعدة. من المهم التاكد من عدم ترك اي قطع من القصبة الهوائية ملتصقة بأقراص الجناح التي تم تشريحها لان هذا يمكن ان يتسبب في تعويم الاقراص ، مما يجعل التصوير صعبا.
- ترتيب القرص الجناح بحيث الجانب peripodial من الحقيبة الجناح يواجه التصاعدي بعيدا عن الشريحة المجهر مع القرص الاستلقاء شقه (انظر الشكل 1ا ، ب).
- تغطيه القرص الجناح والشريط مع كوفيرسليب وختم كوفيرسليب باستخدام طلاء الأظافر. بمجرد جفاف البولندية ، انتقل فورا إلى خطوات التصوير أدناه.
5. تصوير النيابة التحرير
- صوره القرص الجناح شنت باستخدام مجهر المسح بالليزر البؤري مع الهدف النفط 40x والليزر 488 nm. يجب ان تظهر النيابة التقدمية-GFP كشريط من الفلوري GFP أسفل مركز القرص الجناح مع ثقب صغير من النيابة التقدمية-GFP يتم الإفراج عنهم من هذا الشريط مركز الخلايا.
- جمع الصور بسرعة 2 هرتز لمده 2 دقيقه لتصور الإفراج عن النيابة التقدمية. للحصول علي أفضل النتائج ، اضبط الليزر في اعداد قوي بما يكفي للحصول علي صوره واضحة للخلايا التي تطلق النيابة التقدمية لتجنب الإفراط في التبييض اثناء جمع الصور. يمكن جمع الصور كسلسلة زمنيه والتي يمكن بعد ذلك تصديرها كملفات AVI (بدون ضغط ، 3 إطارات/s) للحصول علي ملفات الفيديو للإفراج عن النيابة التقدمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 2 نتائج التصوير الحي التمثيلية لهذا البروتوكول. وعندما يكون البروتوكول ناجحا ، يمكن اعتبار الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP مخططا أسفل وسط القرص الجناح مع وجود نوى مرئية كدوائر غير فلورية داخل منطقه النيابة التقدمية-GFP (الشكل 2). الإفراج عن النيابة التقدمية-GFP مرئية كما ثقب الفلورسنت التي تظهر وتختفي. وقد لاحظنا الظهور والاختفاء في الهيئات الخلوية وبعيدا عن الأجسام الخلوية. وتعتمد إشارات النيابة التقدمية علي البنيات الشبيهة بالخلايا التي تسمي cytonemes والتي تمتد بعيدا عن جسم الخلية22،23. ولذلك ، فمن المرجح ان النيابة العامة-GFP ثقوب التي يتم تصورها بعيدا عن الهيئات المنتجة للحزب التقدمي الاشتراكي في هذه الفيديوهات المقدمة من المرجح في cytonemes أو في cytoneme "الاشتباكات العصبية"15. هذه الثقوب هي الأكثر وضوحا بالقرب من الحدود D/V ، والتي يمكن ان ينظر اليها علي انها الفجوة في شريط النيابة العامة-GFP.
ويبين الشكل 3 نتيجة دون الأمثل. في الطريقة الموصوفة هنا ، يتم تحميل الاقراص الجناح بحيث يواجه الجانب peripodial بعيدا عن الشريحة المجهر بحيث يتم تصوير القرص من الجانب peripodial (كما هو موضح في الشكل 1b). إذا كان القرص الجناح من الجانب المعاكس ، وهذا هو ، الجانب peripodial نحو الشريحة المجهر ، وسوف تظهر فلوري-GFP من التركيز والقرار سيكون الفقراء ، مما ادي إلى النتيجة دون الأمثل المبينة في الشكل 3. الخطوة 4.6 لذلك حاسمه لضمان ان القرص الجناح هو الكذب شقه في الاتجاه الصحيح قبل التصوير لتجنب هذه النتيجة.
ويبين الشكل 4 سلسله زمنيه من صور المدعي الخاص > gfp (GAL4 ؛ Uas-gfp) الثالث instar الجناح يرقات القرص. عندما لا تنصهر GFP إلى النيابة التقدمية ، ونحن لا نلاحظ ظهور ثقوب خارج الهيئات الخلية. هذا عنصر تحكم مهمة للاستنتاج ان [جدب-غدب] يتصرف بطريقه مختلفه من [غدب] فحسب.
ويبين الشكل 5 سلسله زمنيه من الصور لسائق GAL4 وحده الثالث instar الجناح يرقات القرص. التقطت الصور مع نفس إعدادات الحصول علي المجهر مثل جميع العينات الأخرى. تظهر هذه الصور ان ثقب الفلورسنت لا يظهر عندما لا يتم التعبير عن النيابة التقدمية-GFP.
الشكل 1: رسم توضيحي لاعداد قرص الجناح المتصاعد. للصورة الإفراج عن النيابة التقدمية-GFP ، يجب تركيب أقراص الجناح تشريح كما هو مبين. (ا) يتم وضع قطعتين من الشريط علي الوجهين widthwise عبر الشريحة المجهر مع القرص الجناح التي شنت في تعديل HL3 وسائل الاعلام بين الشريط. (B) عرض جانبي لقرص الجناح المثبت بشكل صحيح. ويوجه القرص بحيث يواجه الجانب peripodial من الحقيبة الجناح التصاعدي نحو coverslip. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فيديو تمثيلي للإفراج عن المدعي العام في قرص الجناح. وأعرب عن النيابة العامة-GFP في القرص الجناح باستخدام نظام UAS-GAL4. يظهر هنا شريط فيديو تمثيلي لنتائج التصوير الحي لإصدار النيابة العامة-GFP. ويمكن رؤية نوى الخلية كفجوات دائريه في الفلورية. يفرز النائب التقدمي الاشتراكي-GFP يمكن ان ينظر اليه علي انه ثقب ساطع. ونظرا للتباين ، فان هذه الثقوب الساطعة سهله المشاهدة خارج المنطقة التي تضم الهيئات الخلوية المنتجة للنيابة التقدمية. يشار إلى هذه المنطقة بواسطة مستطيل يختفي بعد الإطارات القليلة الاولي. يشار إلى الاتجاات البطنية والخلفية للقرص الجناح من الأسهم. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الشكل 3: النتيجة المثلي للتصوير الصادر عن النيابة التقدمية-GFP. مثال لنتيجة دون الأمثل التي تحدث إذا كان القرص الجناح الموجه الجانب peripodial وجها لأسفل. نظرا للاتجاه غير الصحيح للقرص الجناح القرص النائب العام التقدمي-GFP ليست في التركيز ، لا يمكن رؤية نوى واضحة ، والقرار لا يزال الفقراء مهما كانت المعلمات من المجهر يتم ضبطها. يشار إلى الاتجاات البطنية والخلفية للقرص الجناح من الأسهم. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الشكل 4: فيديو تمثيلي لتعبير GFP في الخلايا المنتجة للحزب التقدمي الذي ينتج القرص الجناح. يظهر التعبير GFP الزاهية في الهيئات الخلية ولا يظهر كثقوب مشرقه صدر في المحيط. يشار إلى الاتجاات البطنية والخلفية للقرص الجناح من الأسهم. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الشكل 5: الفيديو التمثيلي لGal4 الثالثة لأقراص الجناح instar دون التعبير عن النيابة العامة-gfp أو gfp. إذا كان Gal4 لا يمكن محرك الاقراص التعبير عن GFP أو النيابة التقدمية-GFP بسبب عدم وجود UAS-GFP أو UAS-النيابة التقدمية-GFP ، لوحظ لا فلوري. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BMPs مثل النيابة العامة جعل تاثيرها الكبير عندما ربط معقده من المستقبلات غشاء ملزمه للتسبب في سلسله من الإشارات داخل الخلايا في المجاورة أو علي ما يبدو النائية. وقد أظهرت مختبر الدكتور توماس كورنبرغ ان الخلايا التي تنتج الخلايا الاتصال اشاره النيابة التقدمية التي تتلقي الاشاره باستخدام الاكتين القائم علي البنيات رقيقه تشبه filapodia تسمي cytonemes15،24،25. وتشير هذه البيانات إلى ان الاتصالات خليه خليه التنمية في هذا السياق قد تكون مشابهه للعصاق العصبية26. في الاتصالات متشابك, ديناميات الإفراج عن الناقل العصبي حاسمه لتاثيره علي الخلية بوستسينابتيك. المثل ، فان ديناميات الإفراج عن النيابة التقدمية مهمة أيضا لعواقبه المصب12. ولذلك ، من المهم ان تكون قادره علي قياس ديناميات الإفراج عن النيابة العامة في الخلفيات الوراثية المختلفة والظروف لفهم ما هي العوامل التي تؤثر علي الإفراج عن النيابة العامة.
هنا قدمنا الطريقة الأمثل للصورة الإفراج عن النيابة التقدمية. لقد حاولنا أيضا استخدام الآبار للثقافة القرص الجناح للتصوير. عميق جدا من بئر يمكن ان يؤدي إلى صعوبة في التركيز علي الاحداث الإفراج عن النيابة العامة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن للقرص الجناح التحرك اثناء التصوير الحي ، مما يعقد التحليل. الشريط مزدوجة من جانب يسمح مساحة كافيه بين زلة الغطاء والشريحة لمنع سحق القرص الجناح ، في حين يسمح التركيز المناسب. لقد وجدنا ان تحويل المجهر علي نصف ساعة قبل التصوير للسماح للمجهر لتسخين يمنع الانجراف من الصورة علي مدي مده الفيديو. وضع القرص الجناح مع الجانب peripodial من الحقيبة الجناح التي تواجه التصاعدي مهم جدا للتصوير الإفراج النيابة التقدمي. وجدنا ان الاتجاه المعاكس لا يسمح لنا لصوره الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية.
ويمكن استخدام هذه الطريقة للبحث عن المعدلات الجينية للإفراج عن النيابة التقدمية. لقد لاحظنا ان تثبيط قناه أيون يؤثر علي الإفراج عن المدعي الخاص12. القناات الايونيه الأخرى قد تؤثر أيضا علي ديناميات الإفراج عن النيابة التقدمية. يمكننا أيضا اختبار كيف تؤثر الظروف البيئية مثل teratogens علي الإفراج عن النيابة التقدمية. معدلات الإفراج عن النيابة التقدمية قد تكشف عن اليه الجزيئية التي تتحكم في الاربطه وإفراز. قد تكون ديناميكية الإطلاق مهمة للعواقب المصب للعديد من الإشارات التنموية المختلفة. في حين اننا قد وصفت فقط كيف نحن صوره الإفراج النيابة العامة ، وقد لوحظت يغاندس أخرى مثل القنفذ في الإشارات توسط cytoneme ويمكن تنظيمها من قبل اليه مماثله.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونود ان نشكر الدكتورة سارالا برادان علي العمل علي إصدار سابق لهذا البروتوكول. ونود ان نشكر NSF-دائره الرقابة الخارجية 1354282 للحصول علي التمويل في حين وضعنا هذا البروتوكول. نود ان نشكر المعاهد القومية للصحة-NIDCR RO1DE025311 لتمويل مختبرنا حاليا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
