Summary
接触配体的时机可能会影响其发育后果。在这里，我们展示如何图像释放的果蝇骨形态遗传蛋白（BMP），称为Dpp从翅膀盘的细胞。
Abstract
转化的生长因子-β（TGF-β）超级家族对于多细胞生物中早期胚胎模式的形成和成人结构的发展至关重要。TGF-+超级家族包括TGF-α、骨形态遗传蛋白（BMPs）、活动因子、生长和分化因子以及诺达尔。人们早就知道，暴露于细胞的配体量对它的影响很重要。据认为，远距离浓度梯度建立了胚胎模式。然而，最近很明显，接触这些配体的时机对于它们的下游转录结果也很重要。TGF-+超级家族配体在从产生它的细胞中释放出来之前不能有发育后果。直到最近，还很难确定这些配体何时从细胞中释放出来。在这里，我们展示如何测量一种称为十苯酚（Dpp）的果蝇BMP从翼子板或翼盘的细胞中释放。此方法可以修改为其他系统或信令配体。
Introduction
骨形态遗传蛋白（BMPs）对于早期胚胎生成和成人结构模式形成至关重要。BBM 被生成和分泌，以影响响应细胞中生长和细胞分化所需的靶基因的转录。十进制（Dpp）是BMP4的果蝇同源体，对胚胎和成人结构的发展，如翼1，2，3，4是重要的。几个团体关注民进党在图案化成人飞翼的角色，因为1）翅膀由两张透明的上皮片组成，其图案一致，易于评估;2）翼盘也相当平坦，可在幼虫外培养，且易于成像和量化图案差异;3）翼型发展对民进党很敏感，因此路径上的小扰动会影响翼形图案。
Dpp是在位于翼盘5、6、7、8的前/后边界的细胞中产生的。Dpp绑定到1型和2型丝氨酸/色氨酸激酶受体9，10的复合体。在Dpp结合时，2型受体磷化1型受体，然后磷化母亲对Dpp（Mad），一个Smad 1/5/8同源。磷酸化SMAD招募了额外的共同Smad（美地），它使它进入细胞核，在那里它调节目标基因，导致下游效应，如增殖或分化4，11。
最近，贝茨实验室显示，在翼盘内不当释放Dpp会导致狂磷化减少，目标基因表达减少，以及机翼图案缺陷12、13。几个孔通道影响果蝇翼和相关结构的发展14，15。这些子通道也可能参与民进党的释放。在确定变形原释放的机制时，必须采用一种方法来可视化释放事件。
奥雷利奥·泰尔曼博士和斯蒂芬·科恩博士发明了一种Dpp-GFP融合蛋白，能够挽救Dpp的损失，这意味着它在生物学上是活跃的，并且以与生物学相关的方式释放16。在这里，我们描述我们如何可视化 Dpp 发布事件使用此 Dpp-GFP。这种融合蛋白是特别有用的，因为GFP是pH敏感，以至于当它是在酸性囊泡，荧光是淬火17。因此，当标有GFP的蛋白质从囊泡释放到更中性的细胞外环境中时，GFP荧光强度增加17。我们利用GFP的pH敏感性来确定Dpp-GFP是否存在于酸性囊泡中。我们图像翼盘表达Dpp-GFP之前和之后添加氯化铵，其中中和细胞内腔囊泡18。我们发现，在添加氯化铵后，普克塔的荧光显著增加，这表明在添加氯化铵18之前，细胞内Dpp-GFP是淬火的。我们得出结论，细胞内Dpp-GFP驻留在酸性膜结合的隔间，如囊泡，并在添加氯化铵后解脱，以中和细胞内腔内18的pH值。这使得Dpp-GFP的实时成像成为一种有用的技术，可以可视化Dpp在果蝇翼盘中的动态，因为它从酸性隔间释放到细胞外环境中。
在这里，我们描述了我们使用 Dpp-GFP 可视化 Dpp 发布事件的方法。Dpp-GFP可以用UAS-GAL4系统19在果蝇翼盘的本土模式来表达。这是用来确定Irk频道影响Dpp版本18的方法。我们通过实时映像 z 堆栈验证了该方法。如果我们在一个焦点平面上获得，我们看不到Dpp-GFP puncta在时间序列的焦点平面内移动。如果我们在 z 堆栈中成像，我们也看不到 Dpp-GFP 的庞塔移动。我们得出结论，使用这种方法看到的Dpp-GFP puncta是释放事件，而不是细胞内囊泡的运动。这种民进党-GFP的实时成像方法，有可能用于测试民进党释放的其他假定修饰符对民进党动态的影响，也可以修改，以观察其他配体的动态
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Protocol
1. 收集鸡蛋以生成幼虫进行解剖
- 交叉 30-40 处女 Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu 飞到 10-15 男性 Sp/CyO-GFP;UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
注：只要平衡器具有幼虫标记，允许在幼虫阶段选择适当的后代，可以使用任何包含 Dpp-GAL4 和 UAS-Dpp-GFP 的基因型。 - 要收集鸡蛋，将交叉的苍蝇翻转到新鲜的食物小瓶中，让它们放3⁄4小时，然后从小瓶中取出它们。为了鼓励产卵，在将苍蝇引入小瓶之前，可以在食物顶部加入少量的酵母膏，由颗粒状酵母与少量水混合而成。同一组交叉苍蝇可以保存和使用长达7天的鸡蛋收集。
注：任何标准的果蝇玉米粉食品配方都应该可以接受。这里使用的是哈泽格和里斯20描述的食物食谱。 - 将卵子收集瓶保持在25°C左右，持续约144小时，直到幼虫处于第三星（游荡）阶段。
- 要选择适当的幼虫进行解剖（那些同时表达 Dpp-GAL4 和 UAS-Dpp-GFP 的幼虫）首先选择非 Tb 的幼虫。这些幼虫将是正常的长度，而不是短和脂肪。
- 在非Tb幼虫中，有表达CyO-GFP的幼虫和表达Dpp-GFP的幼虫。要选择Dpp-GFP表达幼虫，请在荧光立体显微镜下查看它们。虽然Dpp-GFP和CyO-GFP表达幼虫都有一些GFP荧光，但民进党-GFP表达幼虫可以区分，GFP仅限于翼盘，荧光远不如CyO-GFP表达幼虫明亮。选择这些不太明亮的幼虫进行解剖。
2. 准备用于幼虫成像和解剖的解决方案
- 对于翼盘的实时成像，准备经过修改的 HL3 介质21 （70 mM NaCl， 5 mM KCl， 1.5 mM CaCl2水合物， 4 mM MgCl2， 10 mM NaHCO3， 5 mM 沙沙洛水合物， 115 mM 蔗糖， 5 mM HEPES）。这种介质允许机翼盘保持活动状态，以便成像21。
- 使用 HEPES 将 pH 值调整为 7.1，并使用 0.22 μm 过滤器进行滤芯。使用此介质进行翼盘解剖和安装介质进行实时成像。
3. 准备用于翼盘安装的幻灯片
- 将两块无色双面胶带宽度放在显微镜幻灯片上，在它们之间留出约 5 mm 的空间。胶带的片断应足够长，使胶带的末端与显微镜滑动的边缘齐平。
- 使用平边（如一对解剖钳的手柄端）将胶带牢固地压到幻灯片上，以便其下方没有介质渗出。
- 在两块胶带之间放置 25 μL 的经过修改的 HL3 介质。翼盘将安装在磁带片之间的介质滴中，以便胶带防止盖玻片压碎光盘（图1A）。
4. 用于成像的分离和安装翼盘
- 解剖幼虫在制备的改性HL3介质26。
- 用两对钳子轻轻撕下幼虫的一半，并丢弃幼虫的后半部分。
- 用一对钳子抓住幼虫前半部分的中间，用另一对封闭的钳子将嘴钩推回幼虫，直到幼虫完全倒置。
- 通过寻找气管两个颜色较深的主要分支的尖锐弯曲，最容易找到翼盘，这些分支沿着幼虫的两侧运行。翼盘直接位于气管中倒置幼虫的这些弯曲处。
- 轻轻取出翼盘，并将其转移到准备好的显微镜幻灯片上的 HL3 介质的 25 μL。请务必确保没有将气管碎片附在解剖的翼盘上，因为这可能导致椎间盘漂浮，使成像变得困难。
- 排列翼形盘，使机翼袋的侧朝上远离显微镜滑块，光盘平放（参见图 1A，B）。
- 用盖玻片盖住翼盘和胶带，并使用指甲油密封盖玻片。抛光干燥后，立即执行下面的成像步骤。
5. 成像 Dpp 释放
- 使用带 40x 油镜和 488 nm 激光的共聚焦激光扫描显微镜对安装的翼盘进行成像。Dpp-GFP应该以GFP荧光条纹的形式出现在翼盘的中心，从这个细胞的中心条纹中释放下民进党-GFP的小双子。
- 以 2 Hz 的速度收集图像 2 分钟，以可视化 Dpp 释放。为获得最佳效果，将激光设置在足够强的设置下，以获得 Dpp 释放细胞的清晰图像，以避免在图像收集过程中过度漂白。图像可以收集为一个时间序列，然后可以导出为AVI文件（无压缩，3帧/秒），以获得民进党版本的视频文件。
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Representative Results
图 2显示了该协议的代表性实时映像结果。当协议成功时，Dpp-GFP可以被看作是翼盘中心的条纹，在Dpp-GFP区域中，核可以作为非荧光圆可见（图2）。Dpp-GFP释放是可见的荧光双发，出现和消失。我们观察到Dpp-GFP荧光在细胞体中出现和消失，远离细胞体。民进党信号依赖于基于行为素的菲洛波迪亚状结构，称为cytonemes，远离细胞体22，23。因此，在这些呈现的视频中，从民进党生产的细胞体远非"突触"的Dpp-GFP puncta，很可能在cytoneme或cytoneme"突触"15中出现。这些双关语最明显的是接近 D/V 边界，这可以被视为 Dpp-GFP 条带中的间隙。
图 3显示了次优结果。在本文描述的方法中，安装翼盘，使侧翼面远离显微镜滑动，以便从侧向圆盘进行成像（如图1B所示）。如果从反面成像，即朝显微镜滑动，Dpp-GFP荧光将显示出焦点，分辨率会差，导致图3所示的次优结果。因此，步骤 4.6 对于确保翼盘在成像前平放正确方向至关重要，以避免出现此结果。
图 4显示了 Dpp>GFP（dpp-GAL4;UAS-GFP） 第三星幼虫翼盘.当GFP不融合到Dpp时，我们不会观察到细胞体外的双子形的外观。这种控制对于Dpp-GFP的行为不同于GFP本身的结论非常重要。
图 5显示了一个时间序列的图像，仅 dpp-GAL4 驱动器就拥有第三个星幼翼盘。图像拍摄时与所有其他样品的显微镜采集设置相同。这些图像显示，当Dpp-GFP不表达时，荧光双塔不会出现。
图 1：翼盘安装设置图。要成像 Dpp-GFP 释放，应如图所示安装解剖的翼盘。（A） 两块双面胶带在显微镜幻灯片上以宽度放置，翼盘安装在胶带之间经过修改的 HL3 介质中。（B） 正确安装的翼盘的侧面视图。光盘朝向，使翼袋的侧朝向盖玻片向上。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在翼盘中发布Dpp-GFP的代表视频。Dpp-GFP在机翼光盘中使用UAS-GAL4系统表示。这里展示的是Dpp-GFP发布现场成像结果的代表性视频。细胞核可被视为荧光中的圆形间隙。隐秘的民进党-GFP可以被看作是光明的标。由于对比，这些明亮的双光是最容易观察以外的区域，包括产生Dpp的细胞体。此类区域由在前几个帧后消失的矩形表示。翼盘的通风口和后向由箭头指示。请点击此处下载此视频。
图3：Dpp-GFP释放成像的次优结果。如果翼盘朝向侧朝下定向，则出现次优结果的示例。由于机翼盘袋方向不正确，Dpp-GFP不聚焦，无法看到清晰的核，无论显微镜的参数如何调整，分辨率都很差。翼盘的通风口和后向由箭头指示。请点击此处下载此视频。
图4：在方盘的Dpp生成细胞中GFP表达的代表视频。GFP 表达在细胞体中显得明亮，在外围不以明亮的双子形显示。翼盘的通风口和后向由箭头指示。请点击此处下载此视频。
图5：没有民进党-GFP或GFP表达的dpp-Gal4第三星翼光盘的代表视频。如果 Gal4 由于缺少 UAS-GFP 或 UAS-Dpp-GFP 而无法驱动 GFP 或 Dpp-GFP 的表达，则不观察到荧光。请点击此处下载此视频。
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Discussion
公诉人等BSP在结合复杂的膜结合受体，在邻近或显然是遥远的细胞中引起细胞内信号的级联时，会产生显著的影响。ThomasKornberg博士的实验室已经表明，产生Dpp信号接触细胞的细胞使用基于活性素的瘦丝波迪亚状结构（称为cytonemes15、24、25）接收信号。这些数据表明，这种背景下的发育细胞-细胞通信可能类似于神经元突触26。在突触交流中，神经递质释放的动态对突触后细胞的影响至关重要。同样，民进党释放的动态也对其下游后果12也很重要。因此，重要的是要能够测量不同遗传背景和条件下的民进党释放动态，了解影响民进党释放的因素。
在这里，我们提出了优化的方法，以图像Dpp释放。我们还尝试使用井来培养用于成像的翼盘。井深过深会导致难以关注民进党的释放事件。此外，翼盘可以在实时成像过程中移动，这使得分析复杂化。双面胶带允许在盖滑和滑动之间留出足够的空间，以防止压碎翼盘，同时允许适当的对焦。我们发现，在成像前半小时打开显微镜，让显微镜预热，防止图像在视频持续时间内漂移。翼盘的放置与翼袋的侧朝上是成像Dpp释放是非常重要的。我们发现，相反的方向不允许我们形象Dpp发布事件。
该方法可用于寻找Dpp释放的遗传修饰剂。我们观察到，抑制一个子通道影响民进党释放12。其他的ion通道也可能影响Dpp的释放动态。我们还可以测试诸如太子根这样的环境条件如何影响Dpp的释放。 Dpp释放的修饰者可能揭示控制配体分泌的分子机制。释放动力学对于几个不同发育信号配体的下游后果可能很重要。虽然我们只描述了我们如何形象Dpp释放，其他配体，如刺猪已经观察到在cytoneme中介信号，并可以由类似的机制调节。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢萨拉拉·普拉丹博士为这一议定书的早期版本开展工作。我们要感谢 NSF-IOS 1354282 在开发此协议时提供的资金。我们要感谢NIH-NIDCR RO1DE025311目前为实验室提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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