Summary
De timing van blootstelling aan liganden kan invloed hebben op hun ontwikkelings gevolgen. Hier laten we zien hoe het beeld vrijkomen van een Drosophila bot morfogenetische eiwit (BMP) genaamd DPP uit cellen van de vleugel schijf.
Abstract
De transformerende groei factor-Beta (TGF-β) superfamilie is essentieel voor het vroege embryonale patroon en de ontwikkeling van volwassen structuren in multicellulaire organismen. De TGF-β superfamilie omvat TGF-β, Bone morphogenetische proteïne (BMPs), Activins, groei-en differentiatie factoren, en Nodals. Het is al lang bekend dat de hoeveelheid ligand blootgesteld aan cellen is belangrijk voor de gevolgen ervan. Er werd gedacht dat lange-afstand concentratie gradiënten embryonale patroon instellen. Onlangs is echter duidelijk geworden dat de timing van blootstelling aan deze liganden ook belangrijk is voor hun stroomafwaartse transcriptionele gevolgen. Een TGF-β superfamilie ligand kan geen ontwikkelings consequentie hebben totdat het vrijkomt uit de cel waarin het werd geproduceerd. Tot voor kort was het moeilijk om te bepalen wanneer deze liganden uit cellen werden vrijgelaten. Hier laten we zien hoe de afgifte van een Drosophila BMP met de naam Decapentaplegic (DPP) uit de cellen van de Wing primordium of Wing disc te meten. Deze methode kan worden gewijzigd voor andere systemen of de signalering van liganden.
Introduction
Botmorfogenetische eiwitten (BMPs) zijn essentieel voor de vroege embryogenese en het patroon van volwassen structuren. Bmp's worden geproduceerd en uitgescheiden om de transcriptie te beïnvloeden van doel genen die nodig zijn voor groei en celdifferentiatie in reagerende cellen. Decapentaplegic (DPP) is een Drosophila homo van BMP4 dat belangrijk is voor de ontwikkeling van embryonale en volwassen structuren zoals de vleugel1,2,3,4. Verschillende groepen hebben zich geconcentreerd op de rol van DPP in patronen Adult Fly Wings omdat 1) de vleugels bestaan uit twee transparante epitheelia vellen met een consistent venatie patroon dat gemakkelijk kan worden beoordeeld; 2) de vleugel schijven zijn ook redelijk plat, kunnen worden gekweekt buiten de larve, en zijn eenvoudig te beeld en kwantificeren verschillen in patroon; en 3) de vleugel patroon ontwikkeling is gevoelig voor DPP zodanig dat kleine verstoringen in het traject van invloed zijn op het vleugel nerven patroon.
DPP wordt geproduceerd in cellen die zich in de voorste/achterste grens van de vleugel schijf5,6,7,8bevinden. DPP bindt aan een complex van type 1 en type 2 serine/Threonine kinase receptoren9,10. Bij DPP binding, de type 2-receptor fosforyleert de type 1-receptor die vervolgens fosforyleert moeders tegen DPP (MAD), een smad 1/5/8 homolog. Gefosforyleerd SMAD rekruteert een extra co-smad (Medea), die het mogelijk maakt om naar de Nucleus te gaan waar het doel genen reguleert, wat leidt tot downstream effecten zoals proliferatie of differentiatie4,11.
Onlangs heeft het Bates-laboratorium aangetoond dat de onjuiste afgifte van DPP binnen de vleugel schijf kan leiden tot een afname van de Mad fosforylering, vermindering van de doel-genexpressie en vleugel patronen van defecten12,13. Verschillende ionenkanalen beïnvloeden de ontwikkeling van de Drosophila vleugel en bijbehorende structuren14,15. Deze ionenkanalen kunnen ook worden betrokken bij de DPP-release. Bij het bepalen van het mechanisme van de morfogen release is het belangrijk dat er een methode is om vrijgave gebeurtenissen te visualiseren.
Drs. Aurelio Teleman en Stephen Cohen creëerde een DPP-GFP fusie-eiwit dat in staat is om verlies van DPP te redden, wat betekent dat het biologisch actief is en wordt vrijgegeven op een biologisch relevante manier16. Hier beschrijven we hoe we DPP release Events visualiseren met behulp van deze DPP-GFP. Dit fusie-eiwit is vooral nuttig omdat GFP pH-gevoelig is, zodat wanneer het in zure blaasjes is, de fluorescentie17wordt geblust. Daarom, wanneer een eiwit gelabeld met GFP is vrijgelaten uit een blaasje in de meer neutrale extracellulaire omgeving, GFP fluorescentie intensiteit stijgt17. We maakten gebruik van de pH-gevoeligheid van GFP om te bepalen of DPP-GFP zich in zure blaasjes bevindt. We afbeelding gemaakt vleugel schijven uitdrukken DPP-GFP voor en na de toevoeging van ammoniumchloride, die neutraliseert intracellulaire compartimenten blaasjes18. We vonden een significante toename van de fluorescentie van puncta na de toevoeging van ammoniumchloride, wat suggereert dat intracellulaire DPP-GFP wordt opge-blust vóór de toevoeging van ammoniumchloride18. We concluderen dat intracellulaire DPP-GFP zich in zure membraan-gebonden compartimenten bevindt, zoals blaasjes, en wordt ongeblust bij toevoeging van ammoniumchloride om de pH van intracellulaire compartimenten18te neutraliseren. Dit maakt live beeldvorming van DPP-GFP een bruikbare techniek om de dynamiek van DPP in de Drosophila-vleugel schijf te visualiseren, omdat deze uit zure compartimenten in de extracellulaire omgeving wordt vrijgegeven.
Hier beschrijven we de methode die we gebruiken om DPP-release-gebeurtenissen te visualiseren met behulp van DPP-GFP. DPP-GFP kan worden uitgedrukt in het oorspronkelijke patroon in Drosophila vleugel schijven met behulp van het UAS-GAL4 systeem19. Dit is de methode die werd gebruikt om te bepalen dat IRK kanalen invloed DPP release18. We hebben de methode gevalideerd door Live-Imaging z-stacks. We zien niet DPP-GFP puncta verplaatsen binnen het vlak van focus in time series als we in één vlak van focus verworven. We zien ook geen beweging van DPP-GFP puncta als we in een z-stack hebben gefotografeerd. We concluderen dat de DPP-GFP puncta gezien met behulp van deze methode release-gebeurtenissen in plaats van beweging van blaasjes intracellularly. Deze methode van Live-Imaging van DPP-GFP kan mogelijk worden gebruikt voor het testen van andere putatieve modifiers van DPP vrijlating voor hun impact op DPP dynamiek of kan worden aangepast om te kijken naar de dynamiek van andere liganden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. eieren verzamelen om larven voor dissectie te genereren
- Cross 30-40 Maagd vrouwelijke DPP-GAL4/TM6 TB hu vliegt naar 10-15 mannelijke SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB hu.
Opmerking: Elke twee genotypen die DPP-GAL4 en UAS-DPP-GFP bevatten, mogen worden gebruikt zolang de load balancers larvale markers hebben die de geschikte nakomelingen tijdens de larvale fase kunnen selecteren. - Om eieren te verzamelen, draai de gekruiste vliegen in een frisse flacon met voedsel en laat ze 3 – 4 uur leggen voordat ze uit de injectieflacon worden gehaald. Om het leggen van eieren aan te moedigen, kan een kleine hoeveelheid gist pasta gemaakt van gegranuleerde gist vermengd met een kleine hoeveelheid water aan de bovenkant van het voedsel worden toegevoegd voordat de vliegen worden geïntroduceerd in de injectieflacon. Dezelfde reeks gekruiste vliegen kan worden gehouden en gebruikt voor maximaal 7 dagen van ei collecties.
Opmerking: Elk standaard Drosophila maïsmeel voedsel recept moet aanvaardbaar zijn. Hier wordt het voedsel recept beschreven door Hazegh en reis20. - Bewaar de Eier collectie flesjes bij 25 °C gedurende ongeveer 144 uur totdat larven zich in het derde INSTAR (zwervende) stadium bevinden.
- Om de geschikte larven voor dissectie te selecteren (die zowel DPP-GAL4 als UAS-DPP-GFP uitdrukken) Kies eerst larven die niet-TB zijn. Deze larven zijn normale lengte in plaats van kort en vet.
- Onder de niet-TB larven zijn er larven die CyO-GFP uitdrukken en larven die DPP-GFP uitdrukken. Om de DPP-GFP uit te kiezen die larven uitdrukt, Bekijk ze onder een fluorescentie stereomicroscoop. Hoewel zowel DPP-GFP als CyO-GFP die larve uitdrukt een zekere GFP-fluorescentie zal hebben, kan de DPP-GFP die larven uitdrukt, worden onderscheiden doordat de GFP beperkt is tot de vleugel schijven en de fluorescentie veel minder helder is dan de CyO-GFP die larven uitdrukt. Selecteer deze minder heldere larven voor dissectie.
2. oplossing voorbereiden voor larvale beeldvorming en dissectie
- Voor Live beeldvorming van vleugel schijven, bereid gemodificeerde HL3 media21 (70 mm NaCl, 5 mm kcl, 1,5 mm CACL2 Dyhydraat, 4 mm MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose DYHYDRAAT, 115 mm sucrose, 5 mm Hepes). Met deze media kan de vleugel schijf in leven worden gehouden voor Imaging21.
- Pas de pH op 7,1 met behulp van HEPES en filter met een 0,22 μm filter. Gebruik deze media voor zowel de dissecties van de vleugel schijf als de montage media voor Live Imaging.
3. Dia's voorbereiden voorvleugel schijf montage
- Plaats twee stukjes kleurloze dubbelzijdige tape in de breedte van een Microscoop-dia, waardoor er een ruimte van ongeveer 5 mm tussen zit. De stukken tape moet lang genoeg zijn dat de uiteinden van de tape liggen vlak met de randen van de Microscoop-dia.
- Gebruik een platte rand (zoals het handvat-uiteinde van een paar ontleden Tang) om de tape stevig op de dia te drukken, zodat er geen media eronder kunnen sijpelen.
- Plaats 25 μL gemodificeerde HL3 media tussen de twee stukken tape. De vleugel schijf wordt in deze druppel media tussen stukjes tape gemonteerd, zodat de tape voorkomt dat de afdekplaat de schijf verpletterd (Figuur 1a).
4. ontleden en monteren van vleugel schijven voorbeeld vorming
- Dissect larven in de voorbereide gemodificeerde HL3 media26.
- Voorzichtig scheuren larven in tweeën met behulp van twee paren van de Tang en gooi de achterste helft van de larve.
- Pak het midden van de voorste helft van de larve met één paar tang en gebruik een ander paar gesloten tang om de mond haken terug in de larve te duwen totdat de larve volledig is omgekeerd.
- De vleugel schijven kunnen gemakkelijk worden gevonden door te zoeken naar de scherpe bochten in de twee donkerdere gekleurde primaire takken van de tracheae die langs beide zijden van de larven lopen. De vleugel schijven liggen direct onder deze bochten in de tracheae in een omgekeerde larve.
- Verwijder de vleugel schijven voorzichtig en breng ze over naar de 25 μL van HL3 media op de voorbereide Microscoop-dia. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen stukjes luchtpijp aan de ontleed vleugel schijven worden bevestigd, omdat dit de schijven kan laten zweven, waardoor beeldvorming moeilijk wordt.
- Plaats de vleugel schijf zodanig dat de peripodial zijde van het vleugel zakje naar boven is gericht, weg van de Microscoop glijbaan met de schijf plat (Zie Figuur 1A, B).
- Bedek de vleugel schijf en tape met een dekslip en sluit de afdekplaat af met nagellak. Zodra de Polish droog is, gaat u onmiddellijk verder met de onderstaande beeldvormings stappen.
5. Imaging DPP release
- Beeld de gemonteerde vleugel schijf met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 40x olie doelstelling en 488 nm laser. De DPP-GFP moet verschijnen als een streep van GFP fluorescentie in het midden van de vleugel schijf met kleine puncta van DPP-GFP wordt vrijgelaten uit deze middelste streep van cellen.
- Verzamel beelden met een snelheid van 2 Hz gedurende 2 minuten om de DPP-release te visualiseren. Voor de beste resultaten stelt u de laser in op een instelling die alleen sterk genoeg is om een duidelijk beeld te krijgen van de DPP-Releasing cellen om te voorkomen dat ze overbleken tijdens de beeld verzameling. De beelden kunnen worden verzameld als een tijdreeks die vervolgens kan worden geëxporteerd als AVI-bestanden (geen compressie, 3 frames/s) om videobestanden van de DPP-release te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afbeelding 2 toont representatieve Live-Imaging resultaten van dit protocol. Wanneer het protocol succesvol is, kan DPP-GFP worden gezien als een streep in het midden van de vleugel schijf met kernen die zichtbaar zijn als niet-fluorescerende cirkels binnen de DPP-GFP-regio (Figuur 2). DPP-GFP-release is zichtbaar als fluorescerende puncta die verschijnen en verdwijnen. We hebben waargenomen DPP-GFP fluorescentie verschijnen en verdwijnende in de cellichamen en ver van de cellichamen. DPP-signalering is afhankelijk van op actin gebaseerde filopodia-achtige structuren die cytonemen worden genoemd en die zich ver van het lichaam van de cel uitstrekken22,23. Daarom, het is waarschijnlijk dat DPP-GFP puncta die zijn gevisualiseerd ver van de DPP-producerende cellichamen in deze gepresenteerde Video's zijn waarschijnlijk in cytonemes of op cytoneme "synapses"15. Deze puncta zijn het meest zichtbaar dicht bij de D/V grens, die kan worden gezien als de kloof in de DPP-GFP streep.
Figuur 3 toont een suboptimaal resultaat. In de hier beschreven methode worden de vleugel schijven zodanig gemonteerd dat de peripodial zijde van de Microscoop schuift, zodat de schijf van de peripodial zijde wordt afgebeeld (zoals weergegeven in Figuur 1b). Als de vleugel schijf van de achterzijde wordt afgebeeld, dat wil doen, de peripodial zijde naar de Microscoop-dia, zal de DPP-GFP-fluorescentie buiten de focus komen te staan en zal de resolutie slecht zijn, wat resulteert in het suboptimale resultaat zoals weergegeven in Figuur 3. Stap 4,6 is daarom van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de vleugel schijf plat in de juiste richting ligt voorbeeld vorming om dit resultaat te voorkomen.
Afbeelding 4 toont een tijdreeks van beelden van een dpp > GFP (DPP-GAL4; UAS-GFP) derde INSTAR larvale vleugel schijf. Wanneer GFP niet is samengesmolten tot DPP, observeren we niet het uiterlijk van puncta buiten de cellichamen. Deze controle is belangrijk voor de conclusie dat DPP-GFP zich anders gedraagt dan alleen GFP.
Afbeelding 5 toont een tijdreeks van beelden van een DPP-GAL4 driver alleen derde INSTAR larvale Wing disc. Beelden werden genomen met dezelfde Microscoop acquisitie instellingen als alle andere monsters. Deze beelden tonen aan dat fluorescerende puncta niet verschijnen wanneer DPP-GFP niet wordt uitgedrukt.
Afbeelding 1: illustratie van de installatie van de vleugel schijf. Naar afbeelding DPP-GFP-release, moeten de ontleed vleugel schijven worden gemonteerd zoals afgebeeld. A) twee stukken dubbelzijdig tape worden geplaatst op de breedte van de Microscoop dia met de vleugel schijf gemonteerd in gemodificeerde HL3 media tussen de tape. B) zijaanzicht van een correct gemonteerde vleugel schijf. De schijf is zo georiënteerd dat de peripodial zijde van de vleugel Pouch naar boven gericht is op de dekslip. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: representatieve video van DPP-GFP-release in de vleugel schijf. DPP-GFP werd uitgedrukt in de vleugel schijf met behulp van het UAS-GAL4 systeem. Hier wordt getoond is een representatieve video van Live Imaging resultaten van DPP-GFP release. Celkernen kunnen worden gezien als cirkelvormige hiaten in fluorescentie. Uitgescheiden DPP-GFP kan worden gezien als heldere puncta. Vanwege het contrast zijn deze heldere puncta het gemakkelijkst te observeren buiten de regio die de DPP-producerende cellichamen omvat. Een dergelijk gebied wordt aangegeven door een rechthoek die na de eerste paar frames verdwijnt. Ventrale en posterieure richtingen van de vleugel schijf worden aangegeven met de pijlen. Klik hier om deze video te downloaden.
Figuur 3: suboptimaal resultaat van DPP-GFP release Imaging. Voorbeeld van een suboptimaal resultaat dat optreedt als de vleugel schijf gericht is aan de peripodial zijde naar beneden. Vanwege de onjuiste oriëntatie van de Wing disc Pouch DPP-GFP is niet scherp, heldere kernen kunnen niet worden gezien, en de resolutie blijft slecht, ongeacht hoe de parameters van de Microscoop worden aangepast. Ventrale en posterieure richtingen van de vleugel schijf worden aangegeven met de pijlen. Klik hier om deze video te downloaden.
Figuur 4: representatieve video van GFP-expressie in DPP-producerende cellen van de vleugel schijf. GFP expressie verschijnt helder in de cellichamen en verschijnt niet als helder puncta vrijgelaten in de periferie. Ventrale en posterieure richtingen van de vleugel schijf worden aangegeven met de pijlen. Klik hier om deze video te downloaden.
Figuur 5: representatieve video van DPP-Gal4 derde INSTAR vleugel schijven zonder de uitdrukking van DPP-GFP of GFP. Als Gal4 geen expressie van GFP of DPP-GFP kan stimuleren vanwege een gebrek aan UAS-GFP of UAS-DPP-GFP, wordt geen fluorescentie waargenomen. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BMPs zoals DPP maken hun aanzienlijke impact wanneer ze een complex van membraan gebonden receptoren binden aan een cascade van intracellulaire signalering in naburige of schijnbaar verre cellen veroorzaken. Het lab van Dr. Thomas Kornberg heeft aangetoond dat cellen die de DPP-signaal contact cellen produceren die het signaal ontvangen met behulp van actine-gebaseerde dunne filapodia-achtige structuren genaamd cytonemes15,24,25. Deze gegevens suggereren dat Developmental Cell-Cell communicatie in deze context vergelijkbaar met een neuronale Synapse26kan zijn. In synaptische communicatie, de dynamiek van de neurotransmitter release zijn cruciaal voor het effect ervan op de postsynaptische cel. Evenzo is de dynamiek van de DPP-release ook belangrijk voor de downstream-gevolgen12. Daarom is het belangrijk om te kunnen meten van de dynamiek van de DPP vrijlating in verschillende genetische achtergronden en voorwaarden om te begrijpen welke factoren van invloed DPP vrijlating.
Hier hebben we de geoptimaliseerde methode om de afbeelding DPP release gepresenteerd. We hebben ook geprobeerd putten te gebruiken om de vleugel schijf te kweken voorbeeld vorming. Te diep van een put kan resulteren in moeilijkheden richten op de DPP release gebeurtenissen. Bovendien kan de vleugel schijf bewegen tijdens Live beeldvorming, wat de analyse compliceert. Dubbelzijdige tape zorgt voor voldoende ruimte tussen de Afdekstrook en de glijbaan om het breken van de vleugel schijf te voorkomen, terwijl de juiste focus wordt toegestaan. We hebben geconstateerd dat het draaien van de Microscoop op een half uur vóór de beeldvorming zodat de Microscoop om op te warmen voorkomt drift van het beeld over de duur van de video. Plaatsing van de vleugel schijf met de peripodial zijde van de vleugel zakje naar boven gericht is zeer belangrijk voor Imaging DPP release. We constateerden dat de tegenovergestelde oriëntatie ons niet toestaat om DPP-release-gebeurtenissen te bekijken.
Deze methode kan worden gebruikt om te zoeken naar genetische modifiers van DPP vrijlating. We hebben geconstateerd dat remming van een ion-kanaal invloed op DPP release12. Andere ionenkanalen kunnen ook de DPP-release dynamiek beïnvloeden. We kunnen ook testen hoe omgevingscondities zoals teratogenen de afgifte van DPP beïnvloeden. modifiers van DPP release kan het moleculaire mechanisme dat de ligand secretie regelt onthullen. Release dynamiek kan belangrijk zijn voor de downstream gevolgen van verschillende verschillende ontwikkelings signalerings-liganden. Terwijl we hebben alleen beschreven hoe we beeld DPP vrijlating, andere liganden zoals egel zijn waargenomen in cytoneme gemedieerde signalering en kan worden gereguleerd door een soortgelijk mechanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Dr. Sarala Pradhan bedanken voor het werken aan een eerdere versie van dit protocol. We willen NSF-IOS 1354282 bedanken voor de financiering terwijl we dit protocol ontwikkelden. We willen NIH-NIDCR RO1DE025311 bedanken voor het financieren van ons lab op dit moment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
