Developmental Biology

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

Published: October 30, 2019 doi: 10.3791/60528

¹Department of Pediatrics, University of Colorado School of Medicine

Summary

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

Abstract

שינוי מקדם הצמיחה-בטא (TGF-β) סופר משפחה חיונית עבור המבנה העובריים המוקדמים ופיתוח של מבנים מבוגרים באורגניזמים רב-תאיים. TGF-β סופר משפחה כולל TGF-β, עצם חלבון מורורגנטי (BMPs), הפעלות, צמיחה ובידול, ו Nodals. זה כבר מזמן ידוע כי כמות ליגו חשוף לתאים חשוב השפעותיו. זה היה חשוב כי מעברי הריכוז לטווח ארוך להגדיר דפוס עובריים. עם זאת, לאחרונה התברר כי עיתוי החשיפה לליפות אלה חשוב גם עבור ההשלכות שלהם במורד הזרם. Tgf-β סופרמשפחה ליגנד לא יכול להיות תוצאה התפתחותית עד שהוא שוחרר מתא שבו הוא הופק. עד לאחרונה, היה קשה לקבוע מתי הליטרים האלה שוחררו מתאים. כאן אנו מראים כיצד למדוד את שחרורו של Drosophila ילה BMP הנקרא עריפת ראש (dpp) מן התאים של הראש הזרוע הפרידיום או הכנף. ניתן לשנות שיטה זו עבור מערכות אחרות או לאותת ליגנדס.

Introduction

עצם מורורגנטית חלבונים (BMPs) הם חיוניים עבור embryogenesis מוקדם והסדר של מבנים מבוגרים. BMPs מיוצרים ומופרש כדי להשפיע על תמלול של גנים היעד הדרושים הגידול התא בידול בתאים מגיבים. עריפת ראש (Dpp) היא מטוס הומוסוזוזה של BMP4 שחשוב לפיתוח מבנים עובריים ומבוגרים כמו כנף¹^,²^,³^,⁴. כמה קבוצות התמקדו בתפקיד של Dpp כנפיים לעוף מבוגרים בגלל 1) כנפיים מורכב משני גיליונות epithelia שקוף עם דפוס עקביות עקבית שניתן להעריך בקלות; 2) הדיסקים הכנף הם גם שטוחים באופן סביר, יכול להיות מתורבת מחוץ לזחל, והם פשוטים התמונה והבדלים לכמת בתבנית; ו 3) הפיתוח דפוס הכנף רגיש Dpp כגון רטבאליות קטן בשביל יהיה להשפיע הכנף והוא.

Dpp מופק בתאים הממוקמים בגבול הקדמי/אחורי של דיסק כנף⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Dpp נקשר לקומפלקס מסוג 1 ו-2 קולטני סרין/טראונין קינאז⁹^,¹⁰. עם כריכת Dpp, הסוג 2 קולטן זרחתיים את סוג 1 הקולטן אשר לאחר מכן זרחני אמהות נגד Dpp (משוגע), Smad 1/5/8 הומויומן. מגייסים מגויסים שכונתיות נוספת (מדיאה), אשר מאפשר לו להיכנס לגרעין שבו הוא מווסת את הגנים היעד, המוביל לתופעות למטה כגוןהתפשטות או^{בידול 4,}¹¹.

לאחרונה, מעבדת בייטס הראתה כי שחרורו הבלתי ראוי של dpp בתוך הדיסק הכנף יכול להוביל לירידה בזירחון מטורף, הפחתה בביטוי הגנים היעד, ופגמים כנף¹²^,¹³. מספר ערוצי יונים משפיעים על התפתחות אגף דרוזוהילה ומבנים משויכים¹⁴^,¹⁵. ערוצי יונים אלה יכולים גם להיות מעורבים במהדורת Dpp. בקביעת המנגנון של שחרור מורפוגן, חשוב כי יש שיטה להמחיש את האירועים שחרור.

ד"ר אאורליו טלמאן וסטיבן כהן יצרו חלבון היתוך Dpp-GFP אשר מסוגל להציל אובדן של Dpp, כלומר הוא פעיל ביולוגית ושוחרר באופן ביולוגית רלוונטי¹⁶. כאן, אנו מתארים כיצד אנו מדמיינים Dpp לשחרר אירועים באמצעות זה Dpp-GFP. חלבון זה היתוך שימושי במיוחד כי GFP הוא pH רגיש כך כאשר הוא בתוך שלפוחיות חומציים, הזריחה היא¹⁷. לכן, כאשר חלבון מתויג עם GFP הוא שוחרר שלפוחית לתוך הסביבה מגלותי יותר נייטרלי, עוצמת הזריחה GFP מגדילה¹⁷. ניצלנו את הרגישות של ה-pH של GFP כדי לקבוע אם Dpp-GFP נמצא בתוך שלפוחיות חומציים. אנו התמונה דיסקים כנף המבטא Dpp-GFP לפני ואחרי תוספת של אמוניום כלוריד, אשר מנטרל תאים תאיים ושלפוחיות¹⁸. מצאנו עלייה משמעותית בקרינה הפלואורסצנטית לאחר תוספת של אמוניום כלוריד, הרומז כי Dpp-GFP מצוי לפני התוספת של אמוניום כלוריד¹⁸. אנו מסיקים כי Dpp-GFP התאיים שוכן בתאי קרום חומצי מאוגד, כגון ושלפוחיות, והוא משוקם בתוספת של אמוניום כלוריד לנטרל את ה-pH של תאי תאיים¹⁸. זה עושה הדמיה חיה של Dpp-GFP טכניקה שימושית כדי להמחיש את הדינמיקה של Dpp בדיסק כנף Drosophila ילה כפי שהוא שוחרר מתאי חומצי לתוך הסביבה מגלומת.

כאן, אנו מתארים את השיטה אנו משתמשים כדי להמחיש את Dpp לשחרר אירועים באמצעות Dpp-GFP. Dpp-GFP ניתן להתבטא בתבנית מקורית שלה בתוך מערכת הדיסקים של Drosophila ילה באמצעות המערכת UAS-GAL4¹⁹. זוהי השיטה ששימש כדי לקבוע כי ערוצי Irk השפעה שחרור Dpp¹⁸. הצלחנו לאמת את השיטה. ע י הדמיה חיה בערימות אנחנו לא רואים Dpp-GFP לנוע בתוך מישור המיקוד בסדרת הזמן אם רכשנו במישור אחד של מיקוד. אנחנו גם לא רואים תנועה של Dpp-GFP דקדטתא אם אנו מתמונה במחסנית z. אנו מסיקים כי ה-Dpp-GFP שנראה באמצעות שיטה זו הם שחרור אירועים ולא תנועה של שלפוחיות intracellularly. שיטה זו של לחיות הדמיה של Dpp-GFP יכול לשמש כדי לבדוק מודיטים אחרים של המהדורה Dpp עבור השפעתם על הדינמיקה Dpp או יכול להיות שונה כדי להסתכל על הדינמיקה של ליגונים אחרים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. איסוף ביצים כדי ליצור הזחלים לחיתוך

לחצות 30-40 נקבה בתולה Dpp-GAL4/TM6 Tb הו זבובים ל 10-15 זכר Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
הערה: כל גנוסוגים המכילים Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP יכול לשמש כל עוד אזנים יש סמני זחל המאפשר מבחר של צאצאי המתאים במהלך הזחל.
כדי לאסוף ביצים, להפוך את הזבובים חצה לתוך בקבוקון טרי של מזון ולאפשר להם לשכב 3 – 4 h לפני הסרתם מן הבקבוקון. כדי לעודד הנחת ביצה, כמות קטנה של ממרח שמרים עשוי מגורען מעורבב עם כמות קטנה של מים ניתן להוסיף לחלק העליון של המזון לפני הזבובים מוצגים לבקבוקון. את אותה קבוצה של זבובים מצטלבים ניתן לשמור ולהשתמש עד 7 ימים של אוספי ביצים.
הערה: כל המאכלים הסטנדרטיים בארוחות הערב מגישים אוכל מקובל. משמש כאן הוא מתכון המזון המתואר על ידי Hazegh ו רייס²⁰.
שמרו את הבקבוקונים במבחנות ב-25 ° c תמורת כ-144 h עד שהזחלים נמצאים בשלב השלישי (נודד).
כדי לבחור את הזחלים המתאימים לחיתוך (אלה ביטוי הן Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP) הראשון לבחור הזחלים כי הם שאינם Tb. הזחלים האלה יהיו באורך נורמלי ולא נמוך ושמן.
בין הזחלים שאינם שחפת, יהיו הזחלים המבטאים את CyO-GFP וזחלים המבטא Dpp-GFP. כדי לבחור את הזחלים Dpp-GFP, להציג אותם תחת stereomicroscope פלואורסצנטית. בעוד ששניהם Dpp-GFP ו CyO-GFP ביטוי larve יהיה כמה זריחה GFP, Dpp-GFP הזחלים ביטוי יכול להיות מכובד כי GFP הוא מוגבל הדיסקים הכנף והפלואורסצנט הוא הרבה פחות בהיר מאשר CyO-GFP הבעת הזחלים. בחר את הזחלים הבהירים פחות האלה לניתוח.

2. הכנת הפתרון לדימות ולחיתוך זחל

עבור הדמיה חיה של דיסקי כנף, להכין שונה HL3 מדיה²¹ (70 מ"מ, 5 מ"מ kcl, 1.5 mm cacl₂ הידרוקסיד, 4 מ"מ mgcl₂, 10 mm נחקו₃, 5 מילימטר טרהלוז לימה, 115 mm סוכות, 5 מ"מ hepes). מדיה זו מאפשרת את הדיסק הכנף להישמר בחיים עבור הדמיה²¹.
להתאים את ה-pH ל 7.1 באמצעות hepes ולסנן עם מסנן 0.22 יקרומטר. השתמש במדיה זו הן עבור הניתוח של דיסק הכנף והן כאמצעי האחסון הגובר להדמיה חיה.

3. הכנת שקופיות להרכבה בדיסק כנף

מניחים שתי חתיכות של קלטת כפולה ומאוזנת בתוך משטח מיקרוסקופ, ומשאירה מרווח של כ-5 מ"מ ביניהם. פיסות הסרט אמורות להיות ארוכות מספיק כדי שקצות הקלטת יהיו מיושרים עם קצות שקופית המיקרוסקופ.
השתמש בקצה שטוח (כגון קצה הידית של צמד מלקחיים) כדי להקיש על הקלטת בחוזקה על השקופית כך שאף מדיה לא תוכל לחלחל מתחתיו.
מקום 25 μL של שינויים HL3 מדיה בין שתי פיסות הקלטת. הדיסק הכנף יהיה מותקן בירידה זו של מדיה בין פיסות הקלטת, כך הקלטת מונעת את הכיסויים למחוץ את הדיסק (איור 1A).

4. מבתר והרכבה של דיסקים להדמיה

הזחלים מנתחים בHL3 מוכן שונה²⁶מדיה.
קורעים בעדינות את הזחלים במחצית באמצעות שני זוגות של מלקחיים ולהשליך את החצי האחורי של הזחל.
אחוז באמצע המחצית הקדמית של הזחל עם זוג אחד של מלקחיים ולהשתמש זוג אחר של מלקחיים סגורים כדי לדחוף את ווים הפה לתוך הזחל עד הזחל הוא הפוך לחלוטין.
את הדיסקים הכנף ניתן למצוא בקלות רבה יותר על ידי מחפש את העיקולים חדה בשני הענפים העיקריים בצבעים כהים של הגרניים כי לדרוס את שני הצדדים של הזחלים. הדיסקים הכנף משקרים ישירות תחת כפיפות בקנה הנשימה בזחל הפוך.
הסר בעדינות את דיסקי הכנף והעבר אותם ל-25 μL של HL3 media בשקופית המוכנה של המיקרוסקופ. חשוב לוודא כי אין פיסות קנה הנשימה שנותרו מחוברים הדיסקים לגזור הכנף כמו זה יכול לגרום לדיסקים לצוף, מה שהופך את ההדמיה קשה.
סדר את הדיסק הכנף כך שהצד הפריפוייתי של נרתיק הכנף פונה כלפי מעלה מתוך שקופית המיקרוסקופ עם הדיסק שטוח (ראה איור 1א, ב).
לכסות את הדיסק כנף וקלטת עם שמיכות ולאטום את העטיפה באמצעות לק הציפורן. ברגע שפולנית יבשה, המשך מיד לשלבי ההדמיה להלן.

5. הדמיה Dpp שחרור

תמונה הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד סריקה עם מטרה שמן 40x ו 488 ננומטר לייזר. Dpp-GFP צריך להופיע כרצועה של הזריחה GFP במורד המרכז של דיסק כנף עם דקדטה קטן של Dpp-GFP שוחרר ממרכז זה פס של תאים.
לאסוף תמונות במהירות של 2 Hz עבור 2 דקות כדי להמחיש לשחרר Dpp. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להגדיר את הלייזר בהגדרה רק חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים Dpp-משחרר כדי למנוע הלבנת מעל במהלך איסוף התמונה. התמונות ניתן לאסוף כסדרה זמן אשר ניתן לייצא כקבצי AVI (אין דחיסה, 3 מסגרות/s) כדי להשיג קבצי וידאו של המהדורה Dpp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 מראה את תוצאות ההדמיה החיה הייצוגית של פרוטוקול זה. כאשר הפרוטוקול הוא מוצלח, Dpp-GFP ניתן לראות פס במורד המרכז של דיסק כנף עם גרעינים גלויים כמו עיגולים שאינם פלורסנט בתוך אזור Dpp-GFP (איור 2). השחרור dpp-GFP גלוי כמו פלורסנט המופיעים ונעלמים. הבחנו בקרינה Dpp-GFP המופיעים ונעלמים בגופי התא ורחוקים מגופי התא. Dpp איתות תלוי במבנים מבוססי actin המבוסס על מבנים בשם cytonemes הנמתחים הרחק מגוף התא²²^,²³. לכן, סביר להניח כי Dpp-GFP דקדטתא כי הם דמיינו הרחק Dpp-הפקת גופים התא בקטעי וידאו אלה הוצגו צפויים בסייטונאו או ב cytonemes "סינפסות"¹⁵. הדקדטה האלה קרובים למראית עין לגבול D/V, שניתן לראות כפער ברצועה Dpp-GFP.

איור 3 מראה תוצאה מיטבית. בשיטה המתוארת כאן, הדיסקים של הכנף נטענים כך שהצד הפריפוגי פונה הרחק משקופית המיקרוסקופ, כך שהדיסק מופיע בתמונה מהצד הפריפוגי (כפי שמוצג באיור 1B). אם הדיסק הכנף הוא התמונה מהצד ההפוך, כלומר, בצד peripodial לכיוון שקופית המיקרוסקופ, הזריחה Dpp-GFP יופיע מחוץ לפוקוס והרזולוציה יהיה עני, וכתוצאה מכך את התוצאה האופטימלית להציג באיור 3. שלב 4.6 הוא לפיכך קריטי כדי לוודא שהדיסק הכנף שוכב בכיוון הנכון לפני הדמיה כדי למנוע תוצאה זו.

איור 4 מראה סדרת זמן של תמונות של dpp > gfp (DPP-GAL4; UAS-GFP) השלישי דיסק הזחל הגוף. כאשר GFP הוא לא התמזגו Dpp, אנחנו לא רואים את המראה של דקדטה מחוץ לגופי התא. פקד זה חשוב למסקנה כי Dpp-GFP מתנהג באופן שונה מ-GFP בלבד.

איור 5 מראה סדרה זמן של תמונות של מנהל התקן dpp-GAL4 לבד שלישי הגוף זחל האגף השלישי. תמונות צולמו עם אותה הגדרות רכישת מיקרוסקופ כמו כל הדגימות האחרות. תמונות אלה מראות כי הפלורסנט לא מופיע כאשר Dpp-GFP אינו מבוטא.

איור 1: איור של כיוונון התקנה של דיסק כנף. למהדורת Dpp-GFP של תמונה, יש לטעון את הדיסקים שניתן לגזור כמוצג. (א) שתי חתיכות של קלטת כפולה ממוקמות מתרחב לאורך שקופית המיקרוסקופ עם דיסק כנף רכוב בHL3 מדיה שונה בין הקלטת. (B) לצד התצוגה הצדדית של דיסק כנף שנטען כראוי. הדיסק מונחה כך שהצד הפריפוגי של כיס הכנף פונה כלפי מעלה לכיוון הכיסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: וידאו נציג של שחרור Dpp-GFP בדיסק כנף. Dpp-GFP ביטא בדיסק כנף באמצעות מערכת UAS-GAL4. המוצג כאן הוא וידאו נציג של תוצאות הדמיה חיה של שחרור Dpp-GFP. גרעיני התא ניתן לראות כפערים עגולים בקרינה פלואורסצנטית. ניתן לראות את Dpp-GFP מופרש בהיר. בשל הניגוד, הדבר הטוב ביותר להתבונן מחוץ לאזור הכולל את הגופים הסלולריים המייצרים Dpp. אזור כזה מצוין על-ידי מלבן שנעלם לאחר המסגרות הראשונות. החיצים הפוכים והאחוריים של הדיסק הכנף מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

איור 3: תוצאה אופטימלית של הדמיה מהדורת Dpp-GFP. דוגמה לתוצאה מיטבית המתרחשת כאשר הדיסק הכנף מחוייג בצד כלפי מטה. בשל הכיוון הלא נכון של נרתיק דיסק הכנף Dpp-GFP הוא לא בפוקוס, גרעיני ברור לא ניתן לראות, והרזולוציה נשאר עני לא משנה איך הפרמטרים של המיקרוסקופ מותאמים. החיצים הפוכים והאחוריים של הדיסק הכנף מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

איור 4: וידאו נציג של ביטוי GFP ב-Dpp-הפקת תאים של דיסק הכנף. ביטוי GFP מופיע בבהירות בגופי התאים ואינו מופיע כדקדטה בוהק ששוחרר בפריפריה. החיצים הפוכים והאחוריים של הדיסק הכנף מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

איור 5: וידאו נציג של dpp-Gal4 השלישי דיסקים האגף ללא הביטוי של dpp-gfp או gfp. אם Gal4 לא יכול לנהוג ביטוי של GFP או Dpp-GFP בשל חוסר UAS-GFP או UAS-Dpp-GFP, לא הקרינה הוא נצפתה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BMPs כגון Dpp להפוך את ההשפעה המשמעותית שלהם כאשר הם לאגד מורכבות של קולטנים מאוגדים קרום כדי לגרום מפל של איתות תאיים בתאים השכנה או מרחוק כנראה. מעבדתו של ד ר תומס קורנברג הראו כי תאים המייצרים את אות dpp בתאי מגע המקבלים את האות באמצעות אקטין מבוסס filapodia דק מבנים כמו המכונה cytonemes¹⁵^,²⁴^,²⁵. נתונים אלה מצביעים על כך שתקשורת סלולרית התפתחותית בהקשר זה עשויה להיות דומה לסינפסה העצבית²⁶. בתקשורת סינפטית, הדינמיקה של שחרור נוירוטרנסמיטר הם חיוניים להשפעה שלה על התא הפוסט-סינפטית. באופן דומה, הדינמיקה של מהדורת Dpp חשוב גם עבור התוצאות שלה במורד הזרם¹². לכן, חשוב להיות מסוגל למדוד את הדינמיקה של שחרור Dpp ברקעים גנטיים שונים ותנאים כדי להבין מה גורמים ההשפעה Dpp לשחרר.

כאן הצגנו את השיטה אופטימיזציה Dpp התמונה לשחרר. ניסינו גם להשתמש בבארות לתרבות הכנף להדמיה. עמוק מדי של באר יכול לגרום לקושי להתמקד באירועים לשחרר Dpp. בנוסף, דיסק הכנף יכול לנוע במהלך הדמיה חיה, אשר מסבך את הניתוח. קלטת כפולה מאפשרת מרווח מספיק בין שקופית הכריכה לבין השקופית כדי למנוע ריסוק של הדיסק הכנף, תוך מתן מיקוד תקין. גילינו כי הפיכת המיקרוסקופ על חצי שעה לפני הדמיה כדי לאפשר למיקרוסקופ להתחמם מונע הסחף של התמונה במשך הווידאו. מיקום הדיסק כנף עם צד peripodial של כיס הכנף פונה כלפי מעלה חשוב מאוד לשחרר את Dpp הדמיה. מצאנו כי הכיוון ההפוך אינו מאפשר לנו תמונה Dpp לשחרר אירועים.

שיטה זו יכולה לשמש כדי לחפש מודיקטורי גנטי של שחרור Dpp. הבחנו כי עיכוב של ערוץ יונים משפיע Dpp שחרור¹². ערוצי יונים אחרים יכולים גם להשפיע על הדינמיקה של Dpp שחרור. אנחנו יכולים גם לבדוק איך התנאים הסביבתיים כגון teratogens להשפיע על שחרורו של Dpp. מודיפיקטורי של השחרור Dpp עשוי לחשוף את המנגנון המולקולרי השולט ליגהפרשה. הדינמיקה של שחרור עשויה להיות חשובה לתוצאות המטה של מספר אותות התפתחותיים שונים. בעוד יש לנו רק תיאר כיצד אנו התמונה Dpp לשחרר, ליגונים אחרים כגון קיפוד נצפו ב cytoneme בתיווך איתות והוא יכול להיות מוסדר על ידי מנגנון דומה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

ברצוני להודות לד ר סאראלה פראדהן על עבודה על גרסה מוקדמת יותר של פרוטוקול זה. אנחנו רוצים להודות NSF-IOS 1354282 למימון בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול. היינו רוצים להודות NIH-נדבך RO1DE025311 למימון המעבדה שלנו כרגע.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baker's yeast	Red Star
CaCl₂ dyhydrate	Fisher Scientific	C79-500
Coverslips	VWR	484-457
Double-sided tape	Scotch
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu			This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center
Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu			This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center
Dumont Tweezers #5	World Precision Instruments	500233	Forceps for dissecting
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
KCl	Fisher Scientific	AC193780010
Light Corn Syrup	Karo
Malt Extract	Breiss
MgCl₂	Fisher Scientific	AC223210010
Microscope slides	Sigma Aldrich	S8400
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
NaHCO₃	RPI	S22060-1000.0
Nail polish	Electron Micsroscopy Sciences	72180
Propionic Acid	VWR	U330-09
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Trehalose dyhydrate	Chem-Impex International, Inc.	00766
Yellow Corn Meal	Quaker
Zeiss LSM 780 confocal microscope	Zeiss		Microscope for live imaging
Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope	Zeiss		Microscope for dissections