Summary
La tempistica dell'esposizione ai ligandi può influire sulle loro conseguenze di sviluppo. Qui mostriamo come visualizzare l'immagine di una proteina morfogenetica ossea della Drosophila (BMP) chiamata Dpp dalle cellule del disco alare.
Abstract
La superfamiglia trasformante Growth Factor-beta (TGF-z) è essenziale per il patterning embrionale precoce e lo sviluppo di strutture adulte in organismi multicellulari. La superfamiglia TGF-z comprende la proteina morfogenetica ossea (BMP), gli Activins, i fattori di crescita e differenziazione e i Nodali. È noto da tempo che la quantità di ligando esposto alle cellule è importante per i suoi effetti. Si pensava che i gradienti di concentrazione a lungo raggio fossero un modello embrionale. Tuttavia, recentemente è diventato chiaro che la tempistica dell'esposizione a questi ligandi è importante anche per le loro conseguenze trascrizionali a valle. Un ligando di superfamiglia TGF -z non può avere una conseguenza di sviluppo fino a quando non viene rilasciato dalla cella in cui è stato prodotto. Fino a poco tempo fa, era difficile determinare quando questi ligando sono stati rilasciati dalle cellule. Qui mostriamo come misurare il rilascio di un BMP Drosophila chiamato Decapentaplegic (Dpp) dalle celle del primordium o disco alare. Questo metodo potrebbe essere modificato per altri sistemi o legature di segnalazione.
Introduction
Le proteine morfogenetiche ossee (BMP) sono essenziali per l'embriogenesi precoce e la modellazione di strutture adulte. I BMP sono prodotti e secreti per influenzare la trascrizione dei geni bersaglio necessari per la crescita e la differenziazione cellulare nelle cellule che rispondono. Decapentaplegic (Dpp) è un omologo di Drosophila di BMP4 che è importante per lo sviluppo di strutture embrionali e adulte come l'ala1,2,3,4. Diversi gruppi si sono concentrati sul ruolo del Dpp nel patterning adult ole di mosca perché 1) le ali sono costituite da due fogli di epitelia trasparenti con un modello di venazione coerente che può essere facilmente valutato; 2) i dischi ali sono anche ragionevolmente piatti, possono essere coltivati al di fuori della larva e sono semplici da immaginare e quantificare le differenze di modello; e 3) lo sviluppo del modello alare è sensibile al Dpp in modo tale che piccole perturbazioni nel percorso avranno un impatto sul modello di venazione dell'ala.
Dpp è prodotto in celle situate nel contorno anteriore/posteriore del disco alare5,6,7,8. Dpp si lega a un complesso di tipo 1 e tipo 2 serine / preonina recettori della chinasi9,10. Al momento dell'attacco Dpp, il recettore di tipo 2 fa fosforolaili del recettore di tipo 1 che poi fa fosfolato Madri contro Dpp (Mad), un omologa Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un'ulteriore co-Smad (Medea), che le consente di entrare nel nucleo dove regola i geni bersaglio, portando a effetti a valle come la proliferazione o la differenziazione4,11.
Recentemente, il Bates Lab ha dimostrato che il rilascio improprio di Dpp all'interno del disco alare può portare a una diminuzione del fosfororylazione pazza, alla riduzione dell'espressione genica bersaglio e ai difetti di patterning12,13. Diversi canali ionici influenzano lo sviluppo dell'ala della Drosophila e delle strutture associate14,15. Questi canali ionici potrebbero anche essere coinvolti nel rilascio di Dpp. Nel determinare il meccanismo di rilascio morfogeno, è importante che sia disponibile un metodo per visualizzare gli eventi di rilascio.
I dottori Aurelio Teleman e Stephen Cohen hanno creato una proteina di fusione Dpp-GFP che è in grado di salvare la perdita di Dpp, il che significa che è biologicamente attiva e viene rilasciata in modo biologicamente rilevante16. Qui, descriviamo come visualizziamo gli eventi di rilascio Dpp utilizzando questo Dpp-GFP. Questa proteina di fusione è particolarmente utile perché la GFP è sensibile al pH in modo tale che quando è in vescicoli acidi, la fluorescenza viene spenta17. Pertanto, quando una proteina etichettata con GFP viene rilasciata da una vescica nell'ambiente extracellulare più neutro, l'intensità della fluorescenza GFP aumentadi 17. Abbiamo sfruttato la sensibilità al pH di GFP per determinare se Dpp-GFP risiede in vesciche acide. Abbiamo immaginato dischi alari che esprimono Dpp-GFP prima e dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio, che neutralizza i compartimenti intracellulari vescicoli18. Abbiamo trovato un aumento significativo della fluorescenza della puncora dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio, suggerendo che il Dpp-GFP intracellulare viene spento prima dell'aggiunta di cloruro di ammonio18. Concludiamo che il Dpp-GFP intracellulare risiede in compartimenti acidi legati alla membrana, come le vescicle, ed è invaloreso dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio per neutralizzare il pH dei compartimenti intracellulari18. Questo rende l'imaging live di Dpp-GFP una tecnica utile per visualizzare la dinamica di Dpp nel disco alare della Drosophila quando viene rilasciato dai compartimenti acidi nell'ambiente extracellulare.
Qui descriviamo il metodo che usiamo per visualizzare gli eventi di rilascio Dpp utilizzando Dpp-GFP. Dpp-GFP può essere espresso nel suo modello nativo nei dischi alari della Drosophila utilizzando il sistema UAS-GAL419. Questo è il metodo utilizzato per determinare che i canali Irk influiscono sulla versione18di Dpp. Abbiamo convalidato il metodo con z-stack di imaging live. Non vediamo Puncta Dpp-GFP muoversi all'interno del piano di messa a fuoco in serie temporali se abbiamo acquisito in un piano di messa a fuoco. Inoltre non vediamo il movimento di Puncta Dpp-GFP se abbiamo immagine in uno z-stack. Concludiamo che la puncta Dpp-GFP vista con questo metodo sono eventi di rilascio piuttosto che movimento di vescicoli intracellulare. Questo metodo di imaging live di Dpp-GFP potrebbe essere potenzialmente utilizzato per testare altri modificatori putatti del rilascio di Dpp per il loro impatto sulla dinamica Dpp o potrebbe essere modificato per esaminare le dinamiche di altri ligandi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Raccolta di uova per generare larve per la dissezione
- Attraversare 30-40 donne vergini Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vola a 10-15 maschi Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
NOT: Qualsiasi due genotipi contenenti Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP possono essere utilizzati a condizione che gli bilanciatori abbiano marcatori larvali che consentono la selezione della progenie appropriata durante la fase larvale. - Per raccogliere le uova, capovolgere le mosche incrociate in una fiala fresca di cibo e permettere loro di posare per 3-4 h prima di rimuoverle dalla fiala. Per incoraggiare la deposizione delle uova, una piccola quantità di pasta di lievito fatta di lievito granulato mescolato con una piccola quantità di acqua può essere aggiunto alla parte superiore del cibo prima che le mosche vengono introdotte nella fiala. Lo stesso set di mosche incrociate può essere mantenuto e utilizzato per un massimo di 7 giorni di collezioni di uova.
NOT: Qualsiasi ricetta standard di farina di mais della Drosophila dovrebbe essere accettabile. Utilizzato qui è la ricetta alimentare descritta da Hazegh e Reis20. - Tenere le fiale di raccolta delle uova a 25 gradi centigradi per circa 144 h fino a quando le larve sono al terzo stadio instar (wandering).
- Per selezionare le larve appropriate per la dissezione (quelle che esprimono sia Dpp-GAL4 che UAS-Dpp-GFP) scelgono prima le larve che non sono Tb. Queste larve saranno di lunghezza normale piuttosto che corte e grasse.
- Tra le larve non Tb ci saranno larve che esprimeranno CyO-GFP e larve che esprimono Dpp-GFP. Per selezionare le larve che esprimono Dpp-GFP, visualizzale sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Mentre sia Dpp-GFP che CyO-GFP che esprimono larve avranno una certa fluorescenza GFP, le larve che esprimono Dpp-GFP possono essere distinte in quanto la GFP è limitata ai dischi ali e la fluorescenza è molto meno luminosa delle larve che esprimono CyO-GFP. Selezionare queste larve meno luminose per la dissezione.
2. Preparazione della soluzione per l'imaging e la dissezione larvale
- Per l'imaging dal vivo dei dischi ali, preparare i supporti HL3 modificati21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 disidratarsi, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM trehalose dyhydrate, 115 mM di saccarosio, 5 mM HEPES). Questo supporto consente di mantenere in vita il disco alare per l'imaging21.
- Regolare il pH a 7,1 utilizzando HEPES e filtrare con un filtro di 0,22 m. Utilizzare questo supporto sia per le dissezioni del disco alache che come supporto di montaggio per l'imaging live.
3. Preparazione dei vetrini per il montaggio del disco dell'ala
- Posizionare due pezzi di nastro a doppio lato incolore in modo ampio su un vetrino del microscopio, lasciando uno spazio di circa 5 mm tra di loro. I pezzi di nastro dovrebbero essere abbastanza lunghi che le estremità del nastro giacciono a filo con i bordi del vetrino del microscopio.
- Utilizzare un bordo piatto (ad esempio l'estremità della maniglia di una coppia di pinze dissetiche) per premere il nastro saldamente sulla diapositiva in modo che nessun supporto possa penetrare sotto di esso.
- Posizionare 25 l di supporti HL3 modificati tra i due pezzi di nastro adesivo. Il disco alare sarà montato in questa goccia di supporti tra pezzi di nastro in modo che il nastro impedisca alla coverslip di schiacciare il disco (Figura 1A).
4. Dissezione e montaggio di dischi alari per l'imaging
- Le larve di dissect nel supporto HL3 modificato preparato26.
- Larve lacrimano delicatamente a metà usando due coppie di pinze e scartano la metà posteriore della larva.
- Afferra la metà centrale della larva con un paio di pinze e usa un altro paio di pinze chiuse per spingere i ganci della bocca nella larva fino a quando la larva non è completamente invertita.
- I dischi ali possono essere trovati più facilmente cercando le curve strette nei due rami primari di colore più scuro della trachea che corrono lungo entrambi i lati delle larve. I dischi ali si trovano direttamente sotto queste curve nella trachea in una larva rovesciata.
- Rimuovere delicatamente i dischi d'ala e trasferirli al supporto HL3 da 25 gradi sul vetrino preparato al microscopio. È importante assicurarsi che nessun pezzo di trachea sia lasciato attaccato ai dischi delle ali sezionate in quanto ciò può causare il galleggiamento dei dischi, rendendo difficile l'imaging.
- Disporre il disco dell'ala in modo che il lato peripodico del sacchetto dell'ala sia rivolto verso l'alto dal vetrino del microscopio con il disco sdraiato (vedere Figura 1A,B).
- Coprire il disco e il nastro dell'ala con una coverslip e sigillare la coverslip con smalto. Una volta che lo smalto è asciutto, procedere immediatamente ai passaggi di imaging riportati di seguito.
5. Rilascio Dpp di imaging
- Immagina il disco dell'ala montato utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo di olio 40x e un laser da 488 nm. Il Dpp-GFP dovrebbe apparire come una striscia di fluorescenza GFP lungo il centro del disco alare con piccolo puncta di Dpp-GFP essere rilasciato da questa striscia centrale di cellule.
- Raccogli immagini a una velocità di 2 Hz per 2 min per visualizzare il rilascio di Dpp. Per ottenere risultati ottimali, impostare il laser su un'impostazione sufficientemente forte da ottenere un'immagine chiara delle celle che rilasciano Dpp per evitare lo sbiancamento eccessivo durante la raccolta delle immagini. Le immagini possono essere raccolte come una serie temporale che può quindi essere esportata come file AVI (nessuna compressione, 3 fotogrammi / s) per ottenere i file video della release Dpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 2 mostra i risultati rappresentativi dell'imaging in tempo reale di questo protocollo. Quando il protocollo ha successo, Dpp-GFP può essere visto come una striscia al centro del disco alare con nuclei visibili come cerchi non fluorescenti all'interno della regione Dpp-GFP (Figura 2). Rilascio Dpp-GFP è visibile come puncta fluorescente che appaiono e scompaiono. Abbiamo osservato la fluorescenza Dpp-GFP che appare e scompare nei corpi cellulari e lontano dai corpi cellulari. La segnalazione Dpp dipende da strutture simili a actina simili chiamate citonimi che si estendono lontano dal corpo cellulare22,23. Pertanto, è probabile che Puncta Dpp-GFP che sono visualizzati lontano dai corpi cellulari che producono Dpp in questi video presentati sono probabilmente in citonimi o a citoneme "sinapsi"15. Questi puncta sono più evidenti vicino al limite D/V, che può essere visto come lo spazio nella striscia Dpp-GFP.
Figura 3 Mostra un risultato non ottimale. Nel metodo qui descritto, i dischi alari sono montati in modo che il lato peripodico si affaccia lontano dal vetrino del microscopio in modo che il disco sia imaged dal lato peripodiale (come mostrato nella Figura 1B). Se il disco dell'ala è fotografato dal lato opposto, cioè lato peripodiale verso il vetrino del microscopio, la fluorescenza Dpp-GFP apparirà fuori fuoco e la risoluzione sarà scarsa, con il risultato non ottimale mostrato nella Figura 3. Il passaggio 4.6 è quindi fondamentale per garantire che il disco dell'ala sia disteso nell'orientamento corretto prima dell'imaging per evitare questo risultato.
La figura 4 mostra una serie temporale di immagini di un Dpp>GFP(dpp-GAL4; UAS-GFP) terzo disco alare larvale instar. Quando GFP non è fusa in Dpp, non osserviamo la comparsa di puncta al di fuori dei corpi cellulari. Questo controllo è importante per la conclusione che Dpp-GFP si comporta in modo diverso rispetto a GFP da solo.
La figura 5 mostra una serie temporale di immagini di un pilota dpp-GAL4 da solo il terzo disco ala larvale instar. Le immagini sono state scattate con le stesse impostazioni di acquisizione del microscopio di tutti gli altri campioni. Queste immagini mostrano che i puncta fluorescenti non appaiono quando Dpp-GFP non è espresso.
Figura 1: Illustrazione della configurazione del montaggio del disco alare. Per l'immagine Dpp-GFP rilascio, i dischi alano sezionato devono essere montati come mostrato. (A) Due pezzi di nastro a doppio lato sono posizionati in modo ampio attraverso il vetrino del microscopio con il disco alare montato in supporti HL3 modificati tra il nastro. (B) Vista laterale di un disco alare montato correttamente. Il disco è orientato in modo che il lato peripodico della sacca alare sia rivolto verso l'alto verso l'coperchio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Video rappresentativo della versione Dpp-GFP nel disco alare. Dpp-GFP è stato espresso nel disco alare utilizzando il sistema UAS-GAL4. Qui è mostrato un video rappresentativo dei risultati di imaging live della release Dpp-GFP. I nuclei cellulari possono essere visti come lacune circolari nella fluorescenza. Il Dpp-GFP segreto può essere visto come un puncta luminoso. A causa del contrasto, questi puncta luminosi sono più facili da osservare al di fuori della regione che include i corpi cellulari che producono Dpp. Tale area è indicata da un rettangolo che scompare dopo i primi fotogrammi. Le direzioni ventrali e posteriori del disco alare sono indicate dalle frecce. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura 3: Risultato non ottimale dell'imaging di rilascio Dpp-GFP. Esempio di risultato non ottimale che si verifica se il disco alare è orientato peripodiale lato face-down. A causa dell'orientamento errato della sacca del disco alare Dpp-GFP non è a fuoco, i nuclei chiari non possono essere visti, e la risoluzione rimane scarsa indipendentemente da come i parametri del microscopio sono regolati. Le direzioni ventrali e posteriori del disco alare sono indicate dalle frecce. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura 4: Video rappresentativo dell'espressione GFP nelle celle che producono Dpp del disco alare. Espressione GFP appare brillantemente nei corpi cellulari e non appare come puncta luminoso rilasciato nella periferia. Le direzioni ventrali e posteriori del disco alare sono indicate dalle frecce. Clicca qui per scaricare questo video.
Figura 5: Video rappresentativo dei dischi dpp-Gal4 terzo instar senza l'espressione di Dpp-GFP o GFP. Se Gal4 non è in grado di guidare l'espressione di GFP o Dpp-GFP a causa della mancanza di UAS-GFP o UAS-Dpp-GFP, non viene osservata alcuna fluorescenza. Clicca qui per scaricare questo video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BMP come Dpp fanno il loro impatto significativo quando legano un complesso di recettori legati alla membrana per causare una cascata di segnalazione intracellulare nelle cellule vicine o apparentemente lontane. Il laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha dimostrato che le cellule che producono le cellule di contatto del segnale Dpp che ricevono il segnale utilizzando strutture sottili filapodia basate su actin chiamati citonemi15,24,25. Questi dati suggeriscono che la comunicazione sviluppo cellula-cellula in questo contesto può essere simile a una sinapsi neuronale26. Nella comunicazione sinaptica, la dinamica del rilascio del neurotrasmettitore sono cruciali per il suo effetto sulla cellula post-sinaptica. Allo stesso modo, la dinamica del rilascio di Dpp sono anche importanti per le sue conseguenze a valle12. Pertanto, è importante essere in grado di misurare la dinamica del rilascio di Dpp in diversi background genetici e condizioni per capire quali fattori influenzano il rilascio di Dpp.
Qui abbiamo presentato il metodo ottimizzato per l'immagine Dpp rilascio. Abbiamo anche provato a utilizzare pozzi per la coltura del disco alare per l'imaging. Troppo profondo di un pozzo può provocare difficoltà di messa a fuoco sugli eventi di rilascio Dpp. Inoltre, il disco alare può muoversi durante l'imaging dal vivo, il che complica l'analisi. Il nastro fronte/retro consente spazio sufficiente tra lo slittamento del coperchio e lo slittamento per evitare la frantumazione del disco alare, consentendo al contempo una corretta messa a fuoco. Abbiamo scoperto che girare il microscopio su mezz'ora prima dell'imaging per consentire al microscopio di riscaldarsi impedisce la deriva dell'immagine per tutta la durata del video. Il posizionamento del disco alare con il lato peripodiale del sacchetto dell'ala rivolto verso l'alto è molto importante per il rilascio di Dpp di imaging. Abbiamo scoperto che l'orientamento opposto non ci permette di immaginare gli eventi di rilascio Dpp.
Questo metodo potrebbe essere utilizzato per cercare i modificatori genetici del rilascio di Dpp. Abbiamo osservato che l'inibizione di un canale ionico influisce sul rilascio di Dpp12. Altri canali ionici potrebbero anche influenzare le dinamiche di rilascio di Dpp. Potremmo anche testare come le condizioni ambientali come i teratogeni influenzano il rilascio di Dpp. Modificatori di rilascio di Dpp può rivelare il meccanismo molecolare che controlla la secrezione del ligando. Le dinamiche di rilascio possono essere importanti per le conseguenze a valle di diversi ligandi di segnalazione dello sviluppo. Mentre abbiamo solo descritto come immaginiamo il rilascio di Dpp, altri ligandi come Hedgehog sono stati osservati nella segnalazione mediata di citoneme e potrebbero essere regolati da un meccanismo simile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la dott.ssa Sarala Pradhan per aver lavorato su una versione precedente di questo protocollo. Vorremmo ringraziare NSF-IOS 1354282 per il finanziamento mentre abbiamo sviluppato questo protocollo. Ringraziamo NIH-NIDCR RO1DE025311 per aver finanziato il nostro laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
