Summary
リガンドへの暴露のタイミングは、発達の結果に影響を与える可能性があります。ここでは、翼ディスクの細胞からDppと呼ばれるショウジョウバエレベートタンパク質(BMP)の画像放出を行う方法を示す。
Abstract
形容形成長因子β(TGF-β)スーパーファミリーは、多細胞生物における初期胚パターン化および成人構造の開発に不可欠である。TGF-βスーパーファミリーには、TGF-β、骨形態形成タンパク質(BMP)、アクチビン、増殖および分化因子、および節点が含まれる。細胞に曝露されるリガンドの量は、その効果のために重要であることは長い間知られています。長距離濃度勾配が胚パターンを設定すると考えられた。しかし、最近では、これらのリガンドへの曝露のタイミングが、その下流の転写結果にも重要であることが明らかになりました。TGF-βスーパーファミリーリガンドは、それが産生された細胞から放出されるまで発達的な結果を持つことはできない。最近まで、これらのリガンドがいつ細胞から放出されたのか判断することは困難であった。ここでは、翼プリモルジウムまたは翼ディスクの細胞からデカペンタペラギック(Dpp)と呼ばれるショウジョウバエBMPの放出を測定する方法を示す。この方法は、他のシステムまたはシグナリングリガンドに対して変更することができます。
Introduction
骨形態形成タンパク質(BMP)は、成人構造の早期胚発生およびパターニングに不可欠です。BMPは、応答細胞の増殖および細胞分化に必要な標的遺伝子の転写に影響を与えるために産生され、分泌される。デカペンタペティック(Dpp)は、翼1、2、3、4のような胚および成人構造の発達に重要であるBMP4のショウジョウバレギである。いくつかのグループは、1)翼が簡単に評価することができる一貫したベナミズパターンを持つ2つの透明な上皮シートで構成されているため、大人のフライウィングのパターン化におけるDppの役割に焦点を当てています。2)翼ディスクも合理的に平らであり、幼虫の外で培養することができ、パターンの違いを画像化し、定量化することが簡単です。3)翼パターンの発達は、経路内の小さな摂動が翼の静脈パターンに影響を与えるようなDppに敏感である。
Dppは、翼ディスク5、6、7、8の前/後部境界に位置する細胞内で産生される。Dppは、タイプ1およびタイプ2セリン/スレオニンキナーゼ受容体9、10の複合体に結合する。Dpp結合時に、タイプ2受容体は、Dpp(マッド)に対して母親をリン酸化するタイプ1受容体をリン酸化し、スマッド1/5/8ホモログである。リン酸化SMADは、標的遺伝子を調節する核に入ることを可能にする追加の共スマド(Medea)を募集し、増殖または分化4、11などの下流効果をもたらす。
近年、ベイツラボは、翼ディスク内のDppの不適切な放出が、マッドリン酸化の減少、標的遺伝子発現の減少、および翼パターニング欠陥12、13につながる可能性があることを示している。いくつかのイオンチャネルは、ショウジョウバアラ翼および関連構造物14、15の発達に影響を与える。これらのイオンチャネルは、Dpp リリースにも関与する可能性があります。モルホゲン放出のメカニズムを決定する際には、リリースイベントを可視化する方法が重要です。
アウレリオ・テレマン博士とスティーブン・コーエン博士は、Dppの喪失を助得ることができるDpp-GFP融合タンパク質を作成し、生物学的に活性であり、生物学的に関連する方法で放出されることを意味する。ここでは、この Dpp-GFP を使用して Dpp リリース イベントを視覚化する方法について説明します。この融合タンパク質は、GFPが酸性小胞にある場合、蛍光が17を急行するようなpH感受性であるため、特に有用である。したがって、GFPでタグ付けされたタンパク質が小胞からより中性の細胞外環境に放出されると、GFP蛍光強度は17増加する。GFPのpH感度を利用して、Dpp-GFPが酸性小胞に存在するかどうかを判断しました。塩化アンモニウムを添加する前後にDpp-GFPを発現する翼ディスクを画像化し、小胞18の細胞内コンパートメントを中和する。塩化アンモニウムを添加した後のパンクタの蛍光の有意な増加を発見し、塩化アンモニウム18を添加する前に細胞内Dpp-GFPが急行されることを示唆した。我々は、細胞内Dpp-GFPが小胞などの酸性膜結合区画に存在し、塩化アンモニウムを添加すると、細胞内コンパートメント18のpHを中和するとアンカンチされると結論付ける。これにより、Dpp-GFPの生きたイメージングは、酸性コンパートメントから細胞外環境に放出されるショウジョウバアラウィングディスク内のDppのダイナミクスを可視化するのに有用な技術です。
ここでは、Dpp-GFP を使用して Dpp リリース イベントを視覚化するために使用する方法について説明します。Dpp-GFPは、UAS-GAL4システム19を使用してショウジョウバエウィングディスクにおけるそのネイティブパターンで表現することができる。これは、Irk チャネルが Dpp リリース18に影響を与えることを判断するために使用された方法です。z スタックをライブイメージングしてメソッドを検証しました。Dpp-GFP punctaが焦点の1つの平面で取得した場合、時系列の焦点の平面内で移動するのを見ていません。また、Zスタックで画像を作成した場合、Dpp-GFPパンクタの動きは見当たりません。我々は、この方法を用いて見られるDpp-GFPパンクタは、細胞内で小胞の動きではなく、放出事象であると結論付ける。Dpp-GFP のライブイメージングのこの方法は、Dpp ダイナミクスへの影響について Dpp リリースの他のポティティブ修飾子をテストするために使用される可能性があり、または他のリガンドのダイナミクスを調べるように変更できます。
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Protocol
1. 解剖用幼虫を生成するための卵の収集
- クロス 30-40 処女女性 Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu は 10-15 男性 Sp/CyO-GFP に飛びます。UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
注:Dpp-GAL4およびUAS-Dpp-GFPを含む任意の2つの遺伝子型は、バランサが幼虫段階の間に適切な子孫の選択を可能にする幼虫マーカーを有する限り使用され得る。 - 卵を収集するには、交差したハエを食べ物の新鮮なバイアルに反転させ、バイアルからそれらを取り除く前に3〜4時間横たわるようにします。産卵を促すために、少量の水を混ぜた粒状酵母で作られた少量の酵母ペーストを、ハエがバイアルに導入する前に食品の上部に加えることができます。同じ交差ハエのセットを保持し、卵のコレクションの7日間まで使用することができます。
注:任意の標準的なショウジョウバアラコーンミール食品のレシピは許容されるべきです。ここで使用されるのは、ヘイズグとレイス20によって記述された食品レシピです。 - 卵採取バイアルは、幼虫が第3のインスター(放浪)段階になるまで、約144時間25°Cに保ちます。
- 解剖に適した幼虫(Dpp-GAL4とUAS-Dpp-GFPの両方を発現するもの)を選択するには、まず非結核の幼虫を選択する。これらの幼虫は、短くて脂肪ではなく、正常な長さになります。
- 非結核幼虫の中には、Dpp-GFPを発現するCyO-GFPおよび幼虫を発現する幼虫が存在する。幼虫を発現するDpp-GFPを選択するには、蛍光体顕微鏡で見る。Dpp-GFPとCyO-GFP発現ラーベの両方がいくつかのGFP蛍光を有するが、Dpp-GFP発現幼虫は、GFPが翼ディスクに制限され、蛍光は幼虫を発現するCyO-GFPよりもはるかに明るくないことを区別することができる。解剖のためにこれらのあまり明るい幼虫を選択してください。
2. 幼虫イメージングおよび解剖のためのソリューションの準備
- 翼ディスクのライブイメージングのために、修正されたHL3媒体21(70 mM NaCl、5 mM KCl、1.5 mM CaCl2ダイハイドレート、4 mM MgCl2、10mM NaHCO3、5mM トレハロースジハイドレート、115 mMスクロース、5 mM HEPES)を準備します。この媒体は、翼ディスクをイメージング21のために生き続けることを可能にする。
- HEPESを使用してpHを7.1に調整し、0.22μmフィルタでフィルタします。このメディアは、ウィングディスクの解剖とライブイメージング用の取り付けメディアの両方に使用します。
3. ウィングディスク取り付け用スライドの準備
- 2枚の無色両面テープを顕微鏡スライドに幅を合わせて配置し、その間に約5mmのスペースを残します。テープの破片は、テープの端が顕微鏡スライドの端でフラッシュするのに十分な長さでなければなりません。
- フラット エッジ(一対の解剖鉗子のハンドル端など)を使用して、テープをスライドにしっかりと押し込み、その下にメディアが浸透しないようにします。
- 2 つのテープの間に 25 μL の変更された HL3 メディアを配置します。翼ディスクはテープの間のメディアのこのドロップに取り付けられ、テープがカバースリップがディスクを押しつぶさないようにします(図1A)。
4. イメージング用ウィングディスクの解剖と取り付け
- 調製した改変HL3媒体26中の幼虫を解剖する。
- 2組の鉗子を使って幼虫を半分にやさしく裂き、幼虫の後半分を捨てる。
- 幼虫の前半分の中央を1組の鉗子でつかみ、別の一対の閉じた鉗子を使って、幼虫が完全に反転するまで口のフックを幼虫に押し戻す。
- 翼ディスクは、幼虫の両側を流れる気管の2つの暗い色の一次枝で鋭い曲がりを探すことによって最も簡単に見つけることができます。翼ディスクは、逆幼虫の気管内のこれらの曲がりの真下にあります。
- ウィングディスクをゆっくりと取り外し、準備した顕微鏡スライドの25°LのHL3メディアに移します。解剖された翼ディスクに気管の破片が取り付けられていないことを確認することが重要です。
- 翼の袋のペリポディアル側が、平らに横たわっているディスクを持つ顕微鏡スライドから上を向き合るように、翼ディスクを配置します(図1A,Bを参照)。
- ウイングディスクとテープをカバースリップで覆い、マニキュアを使ってカバースリップを密封します。ポリッシュが乾燥したら、直ちに以下のイメージング手順に進みます。
5. イメージング Dpp リリース
- 40倍のオイル目的と488nmレーザーを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、取り付けられた翼ディスクを画像化します。Dpp-GFPは、細胞のこの中心ストライプから放出されるDpp-GFPの小さなパンクタを持つ翼ディスクの中心を下るGFP蛍光のストライプとして表示されるはずです。
- Dpp リリースを視覚化するために 2 分間、2 Hz の速度で画像を収集します。最良の結果を得るには、画像収集中に過剰な漂白を避けるために、Dpp放出細胞の鮮明な画像を得るのに十分な強さの設定でレーザーを設定します。画像は時系列として収集することができ、その後、Dppリリースのビデオファイルを取得するためにAVIファイル(圧縮なし、3フレーム/s)としてエクスポートすることができます。
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Representative Results
図2は、このプロトコルの代表的なライブイメージング結果を示す。プロトコルが成功すると、Dpp-GFP は、Dpp-GFP 領域内の非蛍光円として見える核を持つ翼ディスクの中心を下るストライプと見なすことができます (図 2)。Dpp-GFP放出は、現れ消える蛍光パンクタとして見える。Dpp-GFP蛍光が細胞体に現れ、消失し、細胞体から遠く離れているのを観察しました。Dppシグナル伝達は、細胞体22、23から遠く伸びるシトンメと呼ばれるアクチンベースのフィロポディア様構造に依存する。従って、これらの提示されたビデオにおいてDpp産生細胞体から遠く可視化されたDpp-GFPパンクタは、シトンメまたはサイトーネム「シナプス」15において可能性が高い。これらの穿刺は、D/V境界に近く、Dpp-GFPストライプのギャップと見なすことができます。
図 3は、最適でない結果を示しています。ここで説明する方法では、翼ディスクが取り付けられ、円盤側が顕微鏡スライドから離れて向き、円盤がペリポジアル側からイメージされるようにする(図1B参照)。翼ディスクが裏側から画像化されている場合、すなわち顕微鏡スライドに向かってペリポアル側が見える場合、Dpp-GFP蛍光は焦点が合ずれ、解像度が低下し、結果として図3に示す最適でない結果が得られる。したがって、ステップ4.6は、この結果を避けるために、イメージングする前に翼ディスクが正しい方向に平らに横たわっていることを確認するために重要です。
図 4は、Dpp>GFP (dpp-GAL4;UAS-GFP)第3のインスター幼虫翼ディスク。GFPがDppに融合されていない場合、細胞体の外側のパンクタの出現は観察されません。このコントロールは、Dpp-GFP が GFP のみとは異なる動作をするという結論に重要です。
図5は、第3のインスター幼虫翼ディスクのdpp-GAL4ドライバのみの時系列画像を示す。画像は、他のすべてのサンプルと同じ顕微鏡取得設定で撮影した。これらの画像は、Dpp-GFPが発現していない場合、蛍光パンクタが現れないことを示しています。
図1:ウィングディスク取り付け設定の図Dpp-GFP リリースをイメージするには、次に示すように解剖された翼ディスクを取り付ける必要があります。(A) 両面テープの2枚は、テープ間の修正されたHL3媒体に取り付けられた翼ディスクで顕微鏡スライド全体に幅状に配置される。(B) 正しく取り付けられた翼ディスクの側面図。ディスクは、翼のポーチのペリポディアル側がカバースリップに向かって上向きになるように配向されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:翼ディスクでのDpp-GFPリリースの代表的なビデオ。Dpp-GFPは、UAS-GAL4システムを用いてウィングディスクで表現した。Dpp-GFPリリースのライブイメージング結果の代表的なビデオを以下に示します。細胞核は蛍光の円形ギャップと見なすことができる。分泌されたDpp-GFPは明るいパンクタとして見ることができます。対照的に、これらの明るい穿刺は、Dpp産生細胞体を含む領域の外側を観察するのが最も簡単です。このような領域は、最初の数フレームの後に消える四角形で示されます。翼ディスクの腹部および後方向は矢印で示される。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図3:Dpp-GFP放出イメージングの最適でない結果翼ディスクが指向の腹膜側のフェイスダウンの場合に生じる最適でない結果の例。ウィングディスクパウチDpp-GFPの向きが正しくないため、明確な核が見えず、顕微鏡のパラメータの調整方法に関係なく解像度が低下したままです。翼ディスクの腹部および後方向は矢印で示される。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図4:翼ディスクのDpp産生細胞におけるGFP発現の代表的なビデオ。GFP 発現は細胞体に明るく表示され、周辺で放出される明るい穿刺としては現されません。翼ディスクの腹部および後方向は矢印で示される。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図5:dpp-GFPまたはGFPの発現のないdpp-Gal4第3インスターウィングディスクの代表的なビデオ。Gal4がUAS-GFPまたはUAS-Dpp-GFPの欠如のためにGFPまたはDpp-GFPの発現を駆動できない場合、蛍光は観察されません。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DppなどのBMPは、膜結合受容体の複合体を結合して、隣接する細胞または明らかに遠くの細胞で細胞内シグナル伝達のカスケードを引き起こす際に、その大きな影響を与えます。トーマス・コーンバーグ博士の研究室は、シトンメム15、24、25と呼ばれるアクチンベースの薄いフィラポディア様構造を用いてシグナルを受信するDppシグナル接触細胞を産生する細胞を示した。これらのデータは、この文脈における発達細胞間通信がニューロンシナプス26に類似している可能性があることを示唆している。シナプスコミュニケーションでは、神経伝達物質放出のダイナミクスは、ポストナプティック細胞に及ぼす影響に重要である。同様に、Dpp リリースのダイナミクスは、その下流の結果12にも重要です。したがって、異なる遺伝的背景や条件でDpp放出のダイナミクスを測定し、Dpp放出にどのような要因が影響を与えるかを理解できることが重要である。
ここでは、イメージDppリリースに最適化された方法を提示しました。また、ウェルを使用して、イメージング用のウイングディスクを培養してみました。井戸の深さが深すぎると、Dpp リリース イベントに焦点を当てるのが困難になります。さらに、翼ディスクはライブイメージング中に動くことができ、分析が複雑になります。両面テープは、適切なフォーカスを可能にしながら、翼ディスクの破砕を防ぐためにカバースリップとスライドの間に十分なスペースを可能にします。顕微鏡を温めるためにイメージングの30分前に顕微鏡を回すと、ビデオの期間中の画像のドリフトを防ぐことができます。翼パウチのペリポジアル側を上向きにした翼ディスクの配置は、Dppリリースのイメージングに非常に重要です。逆の向きでは、Dpp リリース イベントをイメージ化できないことがわかりました。
この方法は、Dppリリースの遺伝的修飾を探すために使用することができる。イオンチャネルの阻害がDpp放出12に影響を及ぼすことが観察された。他のイオンチャネルも Dpp リリースダイナミクスに影響を与える可能性があります。また、テラトゲンなどの環境条件がDppの放出にどのように影響するかをテストすることもできる。リリースダイナミクスは、いくつかの異なる発達シグナリングリガンドの下流の結果にとって重要であり得る。我々はDppリリースをどのようにイメージするかを説明しただけですが、ヘッジホッグのような他のリガンドはシトーン媒介シグナリングで観察されており、同様のメカニズムによって調節される可能性があります。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
このプロトコルの以前のバージョンに取り組んでくれたサララ・プラダン博士に感謝します。このプロトコルを開発している間、NSF-IOS 1354282の資金調達に感謝します。現在、NIH-NIDCR RO1DE025311にラボに資金を提供してくださったおかげで、私たちは感謝申し上げたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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