Summary
Сроки воздействия лигандов могут повлиять на их последствия для развития. Здесь мы покажем, как изображение выпуска drosophila кости морфогенетического белка (BMP) называется Dpp из клеток крыла диска.
Abstract
Трансформирующая сверхсемейная группа Фактор роста (TGF-я) имеет важное значение для раннего эмбрионального узорства и развития взрослых структур в многоклеточных организмах. Суперсемейка TGF-я включает в себя TGF-я, костяного морфогенетического белка (BMPs), активицинов, факторов роста и дифференциации, и нодаль. Давно известно, что количество лиганда, подвергаемого воздействию клеток, имеет важное значение для его воздействия. Считалось, что градиенты концентрации на длинных дистанциях создали эмбриональную модель. Однако в последнее время стало ясно, что сроки воздействия этих лиганд также имеет важное значение для их вниз по течению транскрипционных последствий. Суперсемейная лига н.е. TGF-я не может иметь следствие развития до тех пор, пока не высвобождается из клетки, в которой она была произведена. До недавнего времени было трудно определить, когда эти лиганды были освобождены из клеток. Здесь мы покажем, как измерить высвобождение Дрозофилы БМП под названием Decapentaplegic (Dpp) из клеток крыла примордия или диска крыла. Этот метод может быть изменен для других систем или сигнализации лигандов.
Introduction
Морфогенетические белки костей (БМП) необходимы для раннего эмбриогенеза и узорства взрослых структур. BMPs производятся и выделяются, чтобы повлиять на транскрипцию генов-мишеней, необходимых для роста и дифференциации клеток в ответных клетках. Decapentaplegic (Dpp) является Drosophila омолог БМП4, что важно для развития эмбриональных и взрослых структур, как крыло1,2,3,4. Несколько групп сосредоточили свое внимание на роли Dpp в узорчатом крыльях взрослых мух, потому что 1) крылья состоят из двух прозрачных листов эпителии с последовательной моделью venation, которые могут быть легко оценены; 2) диски крыла также разумно плоские, могут быть культивированы вне личинки, и просты для изображения и количественноразличия различий в шаблоне; и 3) развитие модели крыла чувствительно к Dpp так, что малые perturbations в тропе повлияют на картину venation крыла.
Dpp производится в клетках, расположенных в передней/ задней границе диска крыла5,6,7,8. Dpp связывается с комплексом типа 1 и типа 2 серина / трионин киназы рецепторов9,10. После Dpp связывания, тип 2 рецепторфориды типа 1 рецептор, который затем фосфорилаты матерей против Dpp (Mad), Smad 1/5/8 омолог. Фосфорилированный SMAD набирает дополнительный co-Smad (Медея), который позволяет ему войти в ядро, где он регулирует целевые гены, что приводит к вниз по течению эффекты, такие как распространение или дифференциация4,11.
Недавно, Бейтс Лаборатория показала, что ненадлежащее освобождение Dpp в крыло диска может привести к снижению Mad фосфорилирования, снижение экспрессии генов цели, и крыло шаблонных дефектов12,13. Несколько ионных каналов влияют на развитие крыла Дрозофилы и связанных с ним структур14,15. Эти ионные каналы также могут быть вовлечены в выпуск Dpp. При определении механизма высвобождения морфогена важно, чтобы был метод визуализации событий релиза.
Доктора Аурелио Телеман и Стивен Коэн создали белок синтеза Dpp-GFP, который способен спасти потерю Dpp, что означает, что он биологически активен и высвобождается биологически значимым образом16. Здесь мы описываем, как мы визуализировать события выпуска Dpp с помощью этого Dpp-GFP. Этот белок синтеза особенно полезен, потому что GFP является рН чувствительным таким образом, что, когда он находится в кислых пузырьков, флуоресценция закаляется17. Поэтому, когда белок, помеченный GFP, высвобождается из везикли в более нейтральную внеклеточную среду, интенсивность флуоресценции GFP увеличивается на17. Мы воспользовались чувствительностью pH GFP, чтобы определить, находится ли Dpp-GFP в кислых пузырьках. Мы изображения дисков крыла, выражающих Dpp-GFP до и после добавления хлорида аммония, который нейтрализует внутриклеточные отсеки пузырьков18. Мы обнаружили значительное увеличение флуоресценции пунктуры после добавления хлорида аммония, предполагая, что внутриклеточные Dpp-GFP затушевывается до добавления хлорида аммония18. Мы пришли к выводу, что внутриклеточные Dpp-GFP находится в кислых мембранных отсеков, таких как пузырьки, и не утоляется при добавлении хлорида аммония, чтобы нейтрализовать рН внутриклеточных отсеков18. Это делает живую визуализацию Dpp-GFP полезным методом визуализации динамики Dpp в диске крыла Drosophila, поскольку он высвобождается из кислых отсеков во внеклеточной среде.
Здесь мы описываем метод, который мы используем для визуализации событий выпуска Dpp с помощью Dpp-GFP. Dpp-GFP может быть выражен в его родной шаблон в drosophila крыла дисков с использованием системы UAS-GAL419. Это метод, который был использован, чтобы определить, что Irk каналы воздействия Dpp релиз18. Мы проверили метод с помощью живых изображений z-stacks. Мы не видим Dpp-GFP puncta движущихся в плоскости фокуса в временных рядах, если мы приобрели в одной плоскости фокуса. Мы также не видим движения Puncta Dpp-GFP, если мы изображены в z-стеке. Мы пришли к выводу, что пунктта Dpp-GFP, увиденная с помощью этого метода, является событиями высвобождения, а не движением пузырьков внутриклеточного. Этот метод живой визуализации Dpp-GFP потенциально может быть использован для тестирования других модификаторов dpp релиз для их воздействия на динамику Dpp или может быть изменен, чтобы посмотреть на динамику других лигандов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сбор яиц для создания лари для вскрытия
- Крест 30-40 девственной самки Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu летает до 10-15 самцов Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые два генотипа, содержащие Dpp-GAL4 и UAS-Dpp-GFP, могут использоваться до тех пор, пока балансеры имеют личинок маркеров, позволяющих подбирать соответствующее потомство во время личиночной стадии. - Чтобы собрать яйца, переверните скрещенных мух в свежий флакон с едой и позвольте им заложить 3-4 ч, прежде чем удалить их из флакона. Для поощрения откладки яиц, небольшое количество дрожжевой пасты из гранулированных дрожжей, смешанных с небольшим количеством воды могут быть добавлены в верхней части пищи, прежде чем мухи вводятся в флакон. Такой же набор скрещенных мух можно хранить и использовать на срок до 7 дней коллекции яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любой стандартный рецепт питания Drosophila кукурузной муки должен быть приемлемым. Используется здесь рецепт питания, описанный Hazegh и Reis20. - Держите флаконы коллекции яиц при 25 градусах по Цельсию в течение примерно 144 ч, пока личинки не будут на третьем этапе instar (блуждающих).
- Для выбора подходящих личинок для вскрытия (тех, которые выражают как Dpp-GAL4, так и UAS-Dpp-GFP) сначала выберите личинки, которые не являются ТБ. Эти личинки будут нормальной длины, а не короткие и жирные.
- Среди личинок, не относящих туберкулез, будут личинки, выражающие CyO-GFP и личинки, выражающие Dpp-GFP. Чтобы выбрать Dpp-GFP, выражающий личинки, просмотрите их под флуоресценцией стереомикроскоп. В то время как Dpp-GFP и CyO-GFP, выражающие личинку, будут иметь некоторую флуоресценцию GFP, Dpp-GFP, выражающие личинки, можно отличить в том, что GFP ограничен дисками крыла, а флуоресценция гораздо менее яркая, чем CyO-GFP, выражающая личинки. Выберите эти менее яркие личинки для вскрытия.
2. Подготовка решения для личинки изображения и вскрытия
- Для живой визуализации крыльев дисков, подготовить модифицированные HL3 media21 (70 мм NaCl, 5 мм KCl, 1,5 мм CaCl2 дигидрат, 4 мМ MgCl2, 10 мм NaHCO3, 5 мм трегалозы дигидрат, 115 мм сахароза, 5 мм HEPES). Это носители позволяет крыло диска, чтобы быть в живых для изображения21.
- Отрегулируйте pH до 7.1 с помощью HEPES и профильтруйте фильтром 0,22 мкм. Используйте этот носители как для вскрытия диска крыла, так и в качестве монтажного носителя для живой визуализации.
3. Подготовка слайдов для монтажа диска крыла
- Поместите два куска бесцветной двусторонней ленты шириной через слайд микроскопа, оставляя пространство около 5 мм между ними. Куски ленты должны быть достаточно длинными, чтобы концы ленты лежали заподлицо с краями слайда микроскопа.
- Используйте плоский край (например, конец ручки пары рассекающих щипцы), чтобы прижать ленту к слайду, чтобы никакие носители не могли просачиваться под ним.
- Поместите 25 зл модифицированных носителей HL3 между двумя кусками ленты. Диск крыла будет установлен в этой капле носителя между кусками ленты, так что лента предотвращает крышку от дробления диска (Рисунок 1A).
4. Рассекание и монтаж дисков крыла для визуализации
- Вскрыть личинки в подготовленных модифицированных HL3носителей 26.
- Аккуратно разрыв личинок пополам с помощью двух пар щипцы и отбросить заднюю половину личинки.
- Возьмитесь за середину передней половины личинки одной парой щипцы и использовать другую пару закрытых щипцы, чтобы подтолкнуть рот крючки обратно в личинки, пока личинка полностью перевернуты.
- Диски крыла можно легко найти, глядя на острые изгибы в двух темных цветных первичных ветвей трахеи, которые проходят по обе стороны от личинок. Диски крыла лежат прямо под этими изгибами в трахее в перевернутой личинке.
- Аккуратно снимите диски крыла и перенесите их в 25 л носителей HL3 на подготовленном слайде микроскопа. Важно, чтобы убедиться, что никакие части трахеи не остаются прикреплены к расчлененных дисков крыла, поскольку это может привести к дискам плавать, что затрудняет визуализацию.
- Упорядочить диск крыла так, что peripodial сторона крыла мешок сталкивается вверх от микроскопа слайд с диском лежал плоский (см. Рисунок 1A,B).
- Обложка крыла диска и ленты с крышкой и печать coverslip с помощью лака для ногтей. Как только польский высохнет, немедленно перейдите к изображению шаги ниже.
5. Освобождение изображений Dpp
- Изображение установленного диска крыла с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с 40-м масляным объективом и лазером 488 нм. Dpp-GFP должен появиться как полоса флуоресценции GFP вниз по центру диска крыла с небольшой puncta Dpp-GFP освобождается от этой центральной полосы клеток.
- Собирайте изображения со скоростью 2 Гц в течение 2 минут, чтобы визуализировать выпуск Dpp. Для достижения наилучших результатов установите лазер в обстановке, достаточно сильной, чтобы получить четкое изображение клеток Dpp-releasing, чтобы избежать чрезмерного отбеливания во время сбора изображений. Изображения могут быть собраны в виде временных рядов, которые затем могут быть экспортированы в виде файлов AVI (без сжатия, 3 кадра/с) для получения видеофайлов релиза Dpp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты работы этого протокола. Когда протокол успешен, Dpp-GFP можно рассматривать как полосу вниз по центру диска крыла с ядрами видимыми как нефлуоресцентные круги в пределах dpp-GFP области (Рисунок 2). Dpp-GFP релиз виден как флуоресцентные puncta, которые появляются и исчезают. Мы наблюдали, как флуоресценция Dpp-GFP появлялась и исчезала в клеточных телах и вдали от клеточных тел. Dpp сигнализации зависит от actin основе филоподия-подобных структур, называемых цитонемы, которые простираются далеко от клеточного тела22,23. Таким образом, вполне вероятно, что Dpp-GFP пунктта, которые визуализированы далеко от Dpp-производящих клеточных органов в этих представленных видео, скорее всего, в цитонемы или в цитонеме "синапсы"15. Эти пунктты наиболее очевидны близко к границе D/V, что можно рассматривать как разрыв в полосе Dpp-GFP.
Рисунок 3 показывает неоптимальный результат. В описанном здесь методе, диски крыла установлены так, что периферийная сторона сталкивается от слайда микроскопа так, что диск изображен с периферийной стороны (как показано на рисунке 1B). Если диск крыла изображен с обратной стороны, то есть, периферийная сторона к слайду микроскопа, флуоресценция Dpp-GFP будет выходить из фокуса и разрешение будет плохим, в результате чего неоптимальный результат показан на рисунке 3. Поэтому шаг 4.6 имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы диск крыла лежал ровно в правильной ориентации перед визуализацией, чтобы избежать этого результата.
На рисунке 4 показана временные ряды изображений Dpp'gt;GFP(dpp-GAL4; UAS-GFP) третий в звездном личиночном крыле диска. Когда GFP не сливается с Dpp, мы не наблюдаем появление puncta вне клеточных тел. Этот контроль важен для вывода о том, что Dpp-GFP ведет себя иначе, чем GFP в одиночку.
На рисунке 5 показана временные ряды изображений водителя dpp-GAL4 только третьего в звездного личиночного диска крыла. Изображения были сделаны с теми же настройками приобретения микроскопа, что и все другие образцы. Эти изображения показывают, что флуоресцентные puncta не появляются, когда Dpp-GFP не выражается.
Рисунок 1: Иллюстрация установки крепления диска крыла. Для изображения Dpp-GFP релиз, расчлененные диски крыла должны быть установлены, как показано на рисунке. (A) Две части двусторонней ленты расположены шириной по всей слайд микроскопа с крылом диска, установленного в модифицированных HL3 средств массовой информации между лентой. (B) Вид сбоку правильно установленного диска крыла. Диск ориентирован так, что периподиальной стороне крыла мешок выходит вверх к coverslip. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель видео Dpp-GFP релиз в крыле диска. Dpp-GFP был выражен в диске крыла с использованием системы UAS-GAL4. Здесь представлено репрезентативное видео результатов живой визуализации релиза Dpp-GFP. Ядра клеток можно рассматривать как круговые зазоры при флуоресценции. Засекреченный Dpp-GFP можно рассматривать как яркую пункту. Из-за контраста, эти яркие puncta легче всего наблюдать за пределами региона, который включает в себя Dpp-производящих клеточных тел. На такую область указывает прямоугольник, который исчезает после первых нескольких кадров. Вентральные и задние направления диска крыла обозначены стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Рисунок 3: Субоптимальный результат изображения релиза Dpp-GFP. Пример неоптимального результата, который возникает, если диск крыла ориентирован на периферийную сторону лицом вниз. Из-за неправильной ориентации крыла диска мешок Dpp-GFP не находится в фокусе, четкие ядра не видно, и разрешение остается плохим независимо от того, как параметры микроскопа регулируются. Вентральные и задние направления диска крыла обозначены стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Рисунок 4: Представитель видео gFP выражения в Dpp-производящих клеток диска крыла. Выражение GFP ярко появляется в клетковых телах и не выглядит как яркая пунктура, выпущенная на периферии. Вентральные и задние направления диска крыла обозначены стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Рисунок 5: Представитель видео dpp-Gal4 третий в звездном крыле дисков без выражения Dpp-GFP или GFP. Если Gal4 не может управлять выражением GFP или Dpp-GFP из-за отсутствия UAS-GFP или UAS-Dpp-GFP, не наблюдается флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BMPs, такие как Dpp сделать их значительное влияние, когда они связывают комплекс мембранных связанных рецепторов, чтобы вызвать каскад внутриклеточной сигнализации в соседних или, видимо, далеких клеток. Лаборатория доктора Томаса Корнберга показала, что клетки, которые производят контактные клетки сигнала Dpp, которые получают сигнал, используя на основе актина тонкие фипаподия-подобные структуры, называемые цитонемы15,24,25. Эти данные свидетельствуют о том, что развитие клеток клеточной связи в этом контексте может быть похож на нейрональный синапс26. В синаптической связи, динамика высвобождения нейромедиатора имеют решающее значение для его влияния на постсинаптическую клетку. Аналогичным образом, динамика выпуска Dpp также важна для его последствий вниз по течению12. Поэтому важно уметь измерять динамику выпуска Dpp в различных генетических фонах и условиях, чтобы понять, какие факторы влияют на высвобождение Dpp.
Здесь мы представили оптимизированный метод для изображения Dpp релиз. Мы также пытались использовать скважины для культуры крыла диска для визуализации. Слишком глубокое колодца может привести к трудностям, сосредоточившись на событиях выпуска Dpp. Кроме того, диск крыла может двигаться во время живой визуализации, что усложняет анализ. Двусторонняя лента позволяет достаточно места между крышкой скольжения и слайд, чтобы предотвратить дробление диска крыла, в то время как позволяет надлежащего внимания. Мы обнаружили, что включение микроскопа на полчаса до изображения, чтобы позволить микроскопу разогреться предотвращает дрейф изображения в течение всего срока видео. Размещение диска крыла с перипидиальной стороной крылышки, обращенной вверх, очень важно для высвобождения изображения Dpp. Мы обнаружили, что противоположная ориентация не позволяет нам изображения Dpp релиз событий.
Этот метод может быть использован для поиска генетических модификаторов dpp релиз. Мы заметили, что ингибирование ионного канала влияет на выпуск Dpp12. Другие ионные каналы также могут повлиять на динамику выпуска Dpp. Мы могли бы также проверить, как условия окружающей среды, такие как тератогены влияют на выпуск Dpp. Модификаторы Dpp релиз может выявить молекулярный механизм, который контролирует лиганд секреции. Динамика выпуска может иметь важное значение для нижепом по течению последствиями нескольких различных сигнальных лигандов развития. Хотя мы только описали, как мы изображение Dpp релиз, другие лиганды, такие как Ежик были замечены в цитонеоооо-опосредованного сигнализации и может регулироваться аналогичным механизмом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Саралу Прадхан за работу над более ранней версией этого протокола. Мы хотели бы поблагодарить NSF-IOS 1354282 за финансирование в то время как мы разработали этот протокол. Мы хотели бы поблагодарить NIH-NIDCR RO1DE025311 за финансирование нашей лаборатории в настоящее время.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
