Summary
El momento de la exposición a los ligandos puede afectar sus consecuencias en el desarrollo. Aquí mostramos cómo tomar imágenes de una proteína morfogenética ósea Drosophila (BMP) llamada Dpp de las células del disco del ala.
Abstract
La superfamilia transformadora de Factor de Crecimiento-beta (TGF-) es esencial para el patrón embrionario temprano y el desarrollo de estructuras adultas en organismos multicelulares. La superfamilia de TGF-o incluye TGF, proteína morfogenética ósea (BMP), Activinas, Factores de Crecimiento y Diferenciación, y Nodals. Durante mucho tiempo se ha sabido que la cantidad de ligando expuesto a las células es importante por sus efectos. Se pensó que los gradientes de concentración de largo alcance establecen un patrón embrionario. Sin embargo, recientemente ha quedado claro que el momento de la exposición a estos ligandos también es importante para sus consecuencias transcripcionales posteriores. Un ligando superfamiliar TGF-o no puede tener una consecuencia de desarrollo hasta que se libera de la célula en la que se produjo. Hasta hace poco, era difícil determinar cuándo estos ligandos se liberaban de las células. Aquí mostramos cómo medir la liberación de un BMP Drosophila llamado Decapentaplegic (Dpp) de las células del primordium del ala o disco de ala. Este método podría modificarse para otros sistemas o ligandos de señalización.
Introduction
Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) son esenciales para la embriogénesis temprana y el patrón de las estructuras adultas. Los BMP se producen y secretan para afectar la transcripción de los genes diana necesarios para el crecimiento y la diferenciación celular en las células que responden. Decapentaplegic (Dpp) es un homólogo Drosophila de BMP4 que es importante para el desarrollo de estructuras embrionarias y adultas como el ala1,2,3,4. Varios grupos se han centrado en el papel de Dpp en el patrón de las alas de mosca adultas porque 1) las alas se componen de dos hojas de epitelia transparente con un patrón de venación consistente que se puede evaluar fácilmente; 2) los discos de alas también son razonablemente planos, se pueden cultivar fuera de la larva, y son fáciles de imaginar y cuantificar las diferencias en el patrón; y 3) el desarrollo del patrón de ala es sensible a Dpp de tal manera que pequeñas perturbaciones en la vía afectarán el patrón de venación del ala.
Dpp se produce en celdas situadas en el límite anterior/posterior del disco de ala5,6,7,8. Dpp se une a un complejo de tipo 1 y tipo 2 receptores de serina/threonina quinasa9,10. Tras la unión Dpp, el receptor tipo 2 fosforila el receptor tipo 1 que luego fosforila a las madres contra Dpp (Mad), un homólogo Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un co-Smad adicional (Medea), que le permite entrar al núcleo donde regula los genes diana, dando lugar a efectos aguas abajo como la proliferación o diferenciación4,11.
Recientemente, el Bates Lab ha demostrado que la liberación incorrecta de Dpp dentro del disco del ala puede conducir a una disminución en la fosforilación Mad, reducción en la expresión génica objetivo, y defectos de patrón de ala12,13. Varios canales iónicos impactan el desarrollo del ala Drosophila y las estructuras asociadas14,15. Estos canales iónicos también podrían estar involucrados en la versión Dpp. Al determinar el mecanismo de liberación de morógeno, es importante que haya un método para visualizar eventos de liberación.
Los doctores Aurelio Teleman y Stephen Cohen crearon una proteína de fusión Dpp-GFP que es capaz de rescatar la pérdida de Dpp, lo que significa que es biológicamente activa y se libera de una manera biológicamente relevante16. Aquí, describimos cómo visualizamos los eventos de lanzamiento de Dpp usando este Dpp-GFP. Esta proteína de fusión es particularmente útil porque GFP es sensible al pH de tal manera que cuando está en vesículas ácidas, la fluorescencia se afeita17. Por lo tanto, cuando una proteína etiquetada con GFP se libera de una vesícula en el entorno extracelular más neutro, la intensidad de la fluorescencia de GFP aumenta17. Aprovechamos la sensibilidad al pH de GFP para determinar si Dpp-GFP reside en vesículas ácidas. Hemos dado imágenes de discos de ala que expresan Dpp-GFP antes y después de la adición de cloruro de amonio, que neutraliza las vesículas de los compartimentos intracelulares18. Encontramos un aumento significativo en la fluorescencia de puncta después de la adición de cloruro de amonio, lo que sugiere que el Dpp-GFP intracelular se apadece antes de la adición de cloruro de amonio18. Concluimos que el Dpp-GFP intracelular reside en compartimentos ácidos ligados a la membrana, como vesículas, y no se quega al adicionar cloruro de amonio para neutralizar el pH de los compartimentos intracelulares18. Esto hace que la imagen en vivo de Dpp-GFP sea una técnica útil para visualizar la dinámica de Dpp en el disco de ala Drosophila a medida que se libera de los compartimentos ácidos en el entorno extracelular.
Aquí, describimos el método que usamos para visualizar eventos de lanzamiento de Dpp mediante Dpp-GFP. Dpp-GFP se puede expresar en su patrón nativo en discos de ala Drosophila utilizando el sistema UAS-GAL419. Este es el método que se utilizó para determinar que los canales Irk afectan a la versión18de Dpp. Validamos el método mediante pilas z de imágenes en vivo. No vemos Dpp-GFP puncta moviéndose dentro del plano de enfoque en series temporales si adquirimos en un plano de enfoque. Tampoco vemos el movimiento de Dpp-GFP puncta si pusimos una imagen en una pila z. Concluimos que el Puncta Dpp-GFP visto usando este método son eventos de liberación en lugar de movimiento de vesículas intracelularmente. Este método de imagen en vivo de Dpp-GFP podría utilizarse potencialmente para probar otros modificadores putativos de la liberación de Dpp para su impacto en la dinámica de Dpp o podría ser modificado para mirar la dinámica de otros ligandos
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Protocol
1. Recolectar Huevos para Generar Larvas para la Disección
- Cross 30-40 virgen hembra Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vuela a 10-15 macho Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu.
NOTA: Los dos genotipos que contengan Dpp-GAL4 y UAS-Dpp-GFP podrán utilizarse siempre que los equilibradores tengan marcadores larvarios que permitan seleccionar la progenie adecuada durante la etapa larval. - Para recoger los huevos, voltee las moscas cruzadas en un vial fresco de alimentos y déjelos poner durante 3-4 horas antes de retirarlos del vial. Para fomentar la puesta de huevos, se puede añadir una pequeña cantidad de pasta de levadura hecha de levadura granulada mezclada con una pequeña cantidad de agua en la parte superior de los alimentos antes de que las moscas se introduzcan en el vial. El mismo conjunto de moscas cruzadas se puede mantener y utilizar hasta 7 días de colecciones de huevos.
NOTA: Cualquier receta estándar de alimentos de harina de maíz Drosophila debe ser aceptable. Se utiliza aquí la receta de alimentos descrita por Hazegh y Reis20. - Mantener los viales de recogida de óvulos a 25 oC durante aproximadamente 144 h hasta que las larvas se encuentren en la tercera etapa instar (wandering).
- Para seleccionar las larvas apropiadas para la disección (aquellas que expresan Dpp-GAL4 y UAS-Dpp-GFP) primero elija las larvas que no son Tb. Estas larvas tendrán una longitud normal en lugar de cortas y grasas.
- Entre las larvas no-Tb habrá larvas que expresan CyO-GFP y larvas que expresan Dpp-GFP. Para seleccionar el Dpp-GFP que expresa larvas, verlos bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Mientras que tanto Dpp-GFP como CyO-GFP express ingre distienen algo de fluorescencia de GFP, las larvas que expresan Dpp-GFP pueden distinguirse en que el GFP está restringido a los discos de las alas y la fluorescencia es mucho menos brillante que las larvas que expresan CyO-GFP. Seleccione estas larvas menos brillantes para la disección.
2. Preparación de la solución para imágenes y disección larvales
- Para imágenes en vivo de discos de alas, prepare medios HL3 modificados21 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 dishidrato, 4 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 mM de trehalosa dyhidrato, 115 mM de sacarosa, 5 mM HEPES). Este medio permite que el disco del ala se mantenga vivo para la toma de imágenes21.
- Ajuste el pH a 7.1 usando HEPES y filtre con un filtro de 0,22 m. Utilice este medio tanto para las disecciones de disco de ala como para el medio de montaje para imágenes en directo.
3. Preparación de diapositivas para montaje en disco de ala
- Coloque dos piezas de cinta incolora de doble cara en anchura a través de una diapositiva del microscopio, dejando un espacio de aproximadamente 5 mm entre ellas. Los trozos de cinta deben ser lo suficientemente largos como para que los extremos de la cinta se encuentren al ras con los bordes de la diapositiva del microscopio.
- Utilice un borde plano (como el extremo del mango de un par de fórceps de disección) para presionar la cinta firmemente a la diapositiva para que ningún medio pueda seep debajo de ella.
- Coloque 25 s de medios HL3 modificados entre las dos piezas de cinta. El disco del ala se montará en esta gota de soporte entre trozos de cinta para que la cinta impida que el cubreobjetos aplaste el disco(Figura 1A).
4. Dissecting y montaje de discos de ala para imágenes
- Diseccionar larvas en el medio HL3 modificado preparado26.
- Rasgar suavemente las larvas por la mitad usando dos pares de fórceps y desechar la mitad posterior de la larva.
- Agarre la mitad anterior de la larva con un par de fórceps y use otro par de fórceps cerrados para empujar los ganchos bucales de nuevo en la larva hasta que la larva esté completamente invertida.
- Los discos de las alas se pueden encontrar más fácilmente buscando las curvas afiladas en las dos ramas primarias de color más oscuro de la tráquea que corren por ambos lados de las larvas. Los discos de las alas se encuentran directamente debajo de estas curvas en las tráqueas en una larva invertida.
- Retire suavemente los discos de las alas y transfieralos a los 25 ml de medios HL3 de la corredera del microscopio preparada. Es importante asegurarse de que no queden trozos de tráquea unidos a los discos de ala diseccionados, ya que esto puede hacer que los discos floten, lo que dificulta la imagen.
- Coloque el disco del ala para que el lado peripodial de la bolsa del ala esté orientado hacia arriba lejos de la diapositiva del microscopio con el disco acostado (ver Figura 1A,B).
- Cubra el disco de ala y la cinta con un cubreobjetos y cierre la cubierta con esmalte de uñas. Una vez que el esmalte esté seco, proceda inmediatamente a los pasos de imagen a continuación.
5. Versión de Dpp por imágenes
- Imagen del disco de ala montado utilizando un microscopio de escaneo láser confocal con un objetivo de aceite de 40x y láser de 488 nm. El Dpp-GFP debe aparecer como una franja de fluorescencia GFP por el centro del disco del ala con una pequeña puncta de Dpp-GFP que se libera de esta franja central de células.
- Recopile imágenes a una velocidad de 2 Hz durante 2 minutos para visualizar la liberación de Dpp. Para obtener los mejores resultados, establezca el láser en un entorno lo suficientemente fuerte como para obtener una imagen clara de las células liberadoras de Dpp para evitar el exceso de blanqueo durante la recolección de imágenes. Las imágenes se pueden recopilar como una serie temporal que luego se puede exportar como archivos AVI (sin compresión, 3 fotogramas / s) para obtener archivos de vídeo de la versión Dpp.
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Representative Results
La Figura 2 muestra los resultados representativos de las imágenes en vivo de este protocolo. Cuando el protocolo es exitoso, Dpp-GFP se puede ver como una franja en el centro del disco de ala con núcleos visibles como círculos no fluorescentes dentro de la región Dpp-GFP(Figura 2). La liberación de Dpp-GFP es visible como puncta fluorescente que aparecen y desaparecen. Hemos observado fluorescencia Dpp-GFP apareciendo y desapareciendo en los cuerpos celulares y lejos de los cuerpos celulares. La señalización Dpp depende de estructuras filopodias basadas en actina llamadas citontomos que se extienden lejos del cuerpo celular22,23. Por lo tanto, es probable que Dpp-GFP puncta que se visualizan lejos de los cuerpos celulares productores de Dpp en estos videos presentados son probables en los citonos o en los citonas "sinapsis"15. Estos puncta son más evidentes cerca del límite D/V, que se puede ver como la brecha en la franja Dpp-GFP.
La Figura 3 muestra un resultado subóptimo. En el método descrito aquí, los discos de ala se montan de modo que el lado peripodial se aleja de la diapositiva del microscopio para que el disco se muestre en el lado peripodial (como se muestra en la Figura 1B). Si el disco del ala se muestra desde el reverso, es decir, el lado peripodial hacia la diapositiva del microscopio, la fluorescencia Dpp-GFP aparecerá fuera de foco y la resolución será pobre, lo que resulta en el resultado subóptimo que se muestra en la Figura 3. Por lo tanto, el paso 4.6 es fundamental para asegurarse de que el disco del ala está acostado en la orientación correcta antes de la toma de imágenes para evitar este resultado.
La Figura 4 muestra una serie temporal de imágenes de un Dpp>GFP (dpp-GAL4; UAS-GFP) tercer disco de ala larval instar. Cuando GFP no se fusiona con Dpp, no observamos la aparición de puncta fuera de los cuerpos celulares. Este control es importante para la conclusión de que Dpp-GFP se comporta de manera diferente que la GFP sola.
La Figura 5 muestra una serie temporal de imágenes de un controlador dpp-GAL4 solo tercer disco de ala larval instar. Se tomaron imágenes con los mismos ajustes de adquisición de microscopioquetas que todas las demás muestras. Estas imágenes muestran que la puncta fluorescente no aparece cuando no se expresa Dpp-GFP.
Figura 1: Ilustración de la configuración de montaje del disco del ala. Para la imagen de liberación Dpp-GFP, los discos de ala diseccionados deben montarse como se muestra. (A) Dos piezas de cinta de doble cara se colocan en anchura a través de la corredera del microscopio con el disco del ala montado en medios HL3 modificados entre la cinta. (B) Vista lateral de un disco de ala correctamente montado. El disco está orientado de modo que el lado peripodial de la bolsa del ala se dirija hacia arriba hacia el cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Vídeo representativo de la liberación de Dpp-GFP en el disco del ala. Dpp-GFP se expresaba en el disco de ala utilizando el sistema UAS-GAL4. Aquí se muestra un video representativo de los resultados de imágenes en vivo de la versión De Dpp-GFP. Los núcleos celulares se pueden ver como huecos circulares en la fluorescencia. Dpp-GFP secreto se puede ver como puncta brillante. Debido al contraste, estos puncta brillantes son más fáciles de observar fuera de la región que incluye los cuerpos celulares productores de Dpp. Tal área se indica mediante un rectángulo que desaparece después de los primeros fotogramas. Las direcciones ventrales y posteriores del disco del ala se indican mediante las flechas. Haga clic aquí para descargar este video.
Figura 3: Resultado subóptimo de la imagen de liberación Dpp-GFP. Ejemplo de un resultado subóptimo que se produce si el disco del ala está orientado al lado peripodial boca abajo. Debido a la orientación incorrecta de la bolsa de disco de ala Dpp-GFP no está en el foco, no se pueden ver núcleos claros, y la resolución sigue siendo pobre sin importar cómo se ajusten los parámetros del microscopio. Las direcciones ventrales y posteriores del disco del ala se indican mediante las flechas. Haga clic aquí para descargar este video.
Figura 4: Vídeo representativo de la expresión GFP en células productoras de Dpp del disco de ala. La expresión GFP aparece brillantemente en los cuerpos celulares y no aparece como puncta brillante liberada en la periferia. Las direcciones ventrales y posteriores del disco del ala se indican mediante las flechas. Haga clic aquí para descargar este video.
Figura 5: Vídeo representativo de los discos de ala de tercera estrella dpp-Gal4 sin la expresión de Dpp-GFP o GFP. Si Gal4 no puede impulsar la expresión de GFP o Dpp-GFP debido a la falta de UAS-GFP o UAS-Dpp-GFP, no se observa fluorescencia. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Los BMP como Dpp tienen un impacto significativo cuando se unen a un complejo de receptores unidos a la membrana para causar una cascada de señalización intracelular en células vecinas o aparentemente distantes. El laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha demostrado que las células que producen las células de contacto de señal Dpp que reciben la señal utilizando estructuras delgadas de filapodia basadas en actina llamadas citonmes15,24,25. Estos datos sugieren que la comunicación célula-célula del desarrollo en este contexto puede ser similar a una sinapsis neuronal26. En la comunicación sináptica, la dinámica de liberación de neurotransmisores son cruciales para su efecto en la célula postsináptica. Del mismo modo, la dinámica de la versión de Dpp también es importante para sus consecuencias posteriores12. Por lo tanto, es importante ser capaz de medir la dinámica de la liberación de Dpp en diferentes orígenes genéticos y condiciones para entender qué factores afectan la liberación de Dpp.
Aquí hemos presentado el método optimizado para la versión Dpp de imagen. También hemos intentado usar pozos para cultivar el disco del ala para la toma de imágenes. Demasiado profundo de un pozo puede resultar en dificultad para centrarse en los eventos de lanzamiento de Dpp. Además, el disco del ala puede moverse durante las imágenes en vivo, lo que complica el análisis. La cinta de doble cara permite suficiente espacio entre el deslizamiento de la cubierta y la diapositiva para evitar el aplastamiento del disco del ala, al tiempo que permite un enfoque adecuado. Hemos descubierto que girar el microscopio en media hora antes de la toma de imágenes para permitir que el microscopio se caliente evita la deriva de la imagen durante la duración del video. La colocación del disco del ala con el lado peripodial de la bolsa del ala hacia arriba es muy importante para la liberación de Dpp por imágenes. Encontramos que la orientación opuesta no nos permite crear una imagen de los eventos de lanzamiento de Dpp.
Este método podría utilizarse para buscar modificadores genéticos de la liberación de Dpp. Hemos observado que la inhibición de un canal iónico afecta a la versión12de Dpp. Otros canales iónicos también podrían afectar a la dinámica de liberación de Dpp. También podríamos probar cómo las condiciones ambientales como los teratógenos afectan la liberación de Dpp. Modificadores de liberación de Dpp pueden revelar el mecanismo molecular que controla la secreción de ligandos. La dinámica de liberación puede ser importante para las consecuencias posteriores de varios ligandos de señalización de desarrollo diferentes. Aunque sólo hemos descrito cómo image dpp release, otros ligandos como el erizo se han observado en la señalización mediada por el citono y podría ser regulado por un mecanismo similar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Sarala Pradhan por trabajar en una versión anterior de este protocolo. Nos gustaría agradecer a NSF-IOS 1354282 por la financiación mientras desarrollamos este protocolo. Nos gustaría agradecer a NIH-NIDCR RO1DE025311 por financiar nuestro laboratorio actualmente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
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