Summary
Tidpunkten för exponeringen för ligander kan påverka deras utvecklingsmässiga konsekvenser. Här visar vi hur man bild release av en Drosophila Bone morfogenetiska protein (bmp) kallas DPP från celler i Wing Disc.
Abstract
Den omvandla tillväxtfaktor-beta (TGF-β) superfamiljen är viktigt för tidig embryonal mönster och utveckling av vuxna strukturer i flercelliga organismer. Den TGF-β superfamiljen omfattar TGF-β, ben morfogenetiska protein (BMPs), Activins, tillväxt och differentiering faktorer, och Nodals. Det har länge varit känt att mängden ligand utsätts för celler är viktigt för dess effekter. Det ansågs att långväga koncentrations gradienter inrätta embryonala mönster. Men nyligen har det blivit klart att tidpunkten för exponeringen för dessa ligander är också viktigt för deras nedströms transkriptionella konsekvenser. En TGF-β-superfamilj ligand kan inte ha en utvecklingsmässig konsekvens förrän den frigörs från den cell där den producerades. Tills nyligen var det svårt att avgöra när dessa ligander släpptes från celler. Här visar vi hur man mäter frisläppandet av en Drosophila BMP kallas Decapentaplegic (DPP) från cellerna i Wing primordium eller Wing Disc. Denna metod kan ändras för andra system eller signalering ligands.
Introduction
Ben morfogenetiska proteiner (BMPs) är viktiga för tidig embryogenes och mönstringen av vuxna strukturer. BMPs produceras och utsöndras för att påverka transkription av målgener som behövs för tillväxt och celldifferentiering i att reagera celler. Decapentaplegic (DPP) är en Drosophila homolog av BMP4 som är viktig för utvecklingen av embryonala och vuxna strukturer som Wing1,2,3,4. Flera grupper har fokuserat på rollen som DPP i mönstringen Adult fly Wings eftersom 1) vingarna består av två transparenta epitel ark med en konsekvent Ådringen mönster som lätt kan bedömas; 2) vingen skivorna är också rimligt platt, kan odlas utanför larven, och är enkla att bild och kvantifiera skillnader i mönster; och 3) Ving mönstret utveckling är känsligt för DPP så att små störningar i vägen kommer att påverka Wing Ådringen mönster.
DPP produceras i celler som finns i den främre/bakre gränsen av Wing Disc5,6,7,8. DPP binder till ett komplex av typ 1-och typ 2-serin/treoninkinasreceptorer9,10. Vid DPP-bindning, typ 2-receptorn fosforylater typ 1-receptorn som sedan fosforylerar mödrar mot DPP (MAD), en SMAD 1/5/8 homolog. Fosforylerade SMAD rekryterar en extra Co-SMAD (Medea), som gör det möjligt att komma in i kärnan där den reglerar målgener, vilket leder till nedströms effekter såsom proliferation eller differentiering4,11.
Nyligen har Bates Lab visat att felaktig frisättning av DPP inom Wing-skivan kan leda till en minskning av Mad fosforylering, minskning av mål genuttryck, och Ving mönster defekter12,13. Flera Jon kanaliserar får effektutveckling av drosophilaen påskyndar och tillhörande strukturerar14,15. Dessa jonkanaler kan också vara involverade i DPP-utgåvan. Vid bestämning av mekanismen för morphogen release, det är viktigt att det finns en metod för att visualisera release händelser.
DRS. Aurelio Teleman och Stephen Cohen skapade en DPP-GFP fusion protein som kan rädda förlust av DPP, vilket innebär att det är biologiskt aktiv och släpps på ett biologiskt relevant sätt16. Här beskriver vi hur vi visualisera DPP release händelser med hjälp av denna DPP-GFP. Detta fusionsprotein är särskilt användbart eftersom GFP är pH-känsligt så att när det är i sura blåsor, är fluorescensen släckt17. Därför, när ett protein som är märkta med GFP frigörs från en vesikel i den mer neutrala extracellulära miljön, ökar GFP fluorescens intensitet17. Vi utnyttjade pH-känsligheten hos GFP för att avgöra om DPP-GFP är bosatt i sura blåsor. Vi avbildade Wing skivor uttrycker DPP-GFP före och efter tillsats av ammoniumklorid, som neutraliserar intracellulära fack blåsor18. Vi fann en signifikant ökning av fluorescensen av Auktor efter tillsats av ammoniumklorid, vilket tyder på att intracellulära DPP-GFP är släckt innan tillsats av ammoniumklorid18. Vi drar slutsatsen att intracellulära DPP-GFP bosatt i sura membran-bundna avdelningar, såsom blåsor, och är OSLÄCKT vid tillsats av ammoniumklorid att neutralisera pH i intracellulära fack18. Detta gör Live Imaging av DPP-GFP en användbar teknik för att visualisera dynamiken i DPP i Drosophila Wing skivan som den släpps från sura fack i den extracellulära miljön.
Här beskriver vi den metod vi använder för att visualisera DPP release händelser med hjälp av DPP-GFP. DPP-GFP kan uttryckas i sitt ursprungliga mönster i Drosophila Wing skivor med hjälp av UAS-GAL4 system19. Detta är den metod som användes för att fastställa att IRK kanaler Impact DPP release18. Vi validerade metoden genom Live-Imaging z-stackar. Vi ser inte DPP-GFP Auktor rör sig inom det plan av fokus i tidsserier om vi förvärvade i ett plan av fokus. Vi ser inte heller förflyttning av DPP-GFP Auktor om vi avbildas i en z-stack. Vi drar slutsatsen att DPP-GFP Auktor sett med denna metod är release händelser snarare än förflyttning av vesikler intracellulärt. Denna metod för Live-avbildning av DPP-GFP kan potentiellt användas för att testa andra förmodade modifierare av DPP release för deras inverkan på DPP dynamik eller kan ändras för att titta på dynamiken i andra ligander
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samla ägg för att generera larver för dissektion
- Cross 30-40 Virgin Female DPP-GAL4/TM6 TB hu flyger till 10-15 hane SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB hu.
Anmärkning: Två genotyper som innehåller DPP-GAL4 och UAS-DPP-GFP får användas så länge belastningsutjämnare har larv markörer som möjliggör val av lämplig avkomma under larvstadiet. - För att samla ägg, vänd korsade flugor i en ny flaska med mat och låt dem lägga till 3 – 4 h innan du tar bort dem från injektionsflaskan. För att uppmuntra äggläggning, en liten mängd jäst pasta gjord av granulerad jäst blandas med en liten mängd vatten kan läggas till toppen av maten innan flugorna introduceras till injektionsflaskan. Samma uppsättning korsade flugor kan hållas och användas för upp till 7 dagar av äggsamlingar.
Anmärkning: Alla vanliga Drosophila majsmjöl mat recept bör vara acceptabelt. Används här är mat receptet som beskrivs av Hazegh och Reis20. - Förvara ägg uppsamlings flaskorna vid 25 ° c i ca 144 h tills larverna befinner sig på tredje INSTAR-stadiet (vandrande).
- För att välja lämpliga larver för dissektion (de som uttrycker både DPP-GAL4 och UAS-DPP-GFP) först välja larver som är icke-TB. Dessa larver kommer att vara normal längd snarare än kort och fett.
- Bland de icke-TB larverna kommer det att finnas larver som uttrycker CyO-GFP och larver som uttrycker DPP-GFP. För att välja de DPP-GFP som uttrycker larverna, se dem under ett fluorescensstereomikroskop. Även om både DPP-GFP och CYO-GFP uttrycker larv kommer att ha några GFP fluorescens, den DPP-GFP uttrycker larver kan särskiljas i att GFP är begränsad till vinge skivor och fluorescens är mycket mindre ljus än CYO-GFP uttrycker larver. Välj dessa mindre ljusa larver för dissektion.
2. förberedelse lösning för larv avbildning och dissektion
- För Live-avbildning av Ving skivor, Förbered modifierad HL3 Media21 (70 mm NaCl, 5 mm KCL, 1,5 mm CaCl2 dyhydrat, 4 mm mgcl2, 10 mm NaHCO3, 5 mm trehalos dyhydrat, 115 mm sackaros, 5 mm Hepes). Med detta medium kan Ving skivan hållas vid liv för avbildning21.
- Justera pH till 7,1 med hjälp av HEPES och filter med ett 0,22 μm filter. Använd det här mediet för både Wing Disc dissektioner och som monteringsmedia för Live Imaging.
3. förbereda diabilder för Wing skiva montering
- Placera två stycken färglösa dubbelhäftande tejp bredden över ett Mikroskop bild, vilket ger ett utrymme på ca 5 mm mellan dem. De bitar av tejp bör vara tillräckligt länge att ändarna av tejpen ligger jäms med kanterna på Mikroskopbilden.
- Använd en platt kant (t. ex. handtaget slutet av ett par dissekera pinpett) för att pressa bandet ordentligt till bilden så att inga medier kan sippra under den.
- Placera 25 μL modifierat HL3-medium mellan de två band bitarna. Ving skivan kommer att monteras i denna droppe av media mellan tejpen så att tejpen förhindrar täckbrickan från att krossa skivan (figur 1a).
4. dissekera och monterings vinge skivor för avbildning
- Dissekera larver i den förberedda modifierade HL3 Media26.
- Försiktigt riva larver i hälften med hjälp av två par pinpett och kassera den bakre halvan av larven.
- Ta tag i mitten av den främre halvan av larven med ett par tång och använda ett annat par slutna tång för att driva munnen krokar tillbaka i larven tills larven är helt inverterad.
- Ving skivorna kan lättast hittas genom att leta efter de skarpa böjar i de två mörkare färgade primära grenar av trakeae som kör ner båda sidor av larverna. Vingskivorna ligger direkt under dessa kurvor i trakeae i en inverterad larv.
- Ta försiktigt bort Ving skivorna och överför dem till 25 μL av HL3-mediet på den preparerade Mikroskopbilden. Det är viktigt att se till att inga delar av luftstrupen är kvar knutna till dissekerade vinge skivor eftersom detta kan orsaka skivorna att flyta, vilket gör Imaging svårt.
- Ordna Ving skivan så att den peripodial sidan av Ving påsen är vänd uppåt från Mikroskopbilden med skivan ligger plant (se figur 1A, B).
- Täck Ving skivan och tejpen med en täckslip och försegla täckbrickan med nagellack. När den polska är torr, omedelbart gå vidare till Imaging stegen nedan.
5. DPP-utgåva för Imaging
- Bild monterad vinge skiva med hjälp av en konfokalmikroskopi laserskanning Mikroskop med en 40x olja mål och 488 nm Laser. Den DPP-GFP bör visas som en rand av GFP fluorescens ner i mitten av Wing skiva med små Auktor av DPP-GFP släpps från denna centrum rand av celler.
- Samla bilder med en hastighet av 2 Hz för 2 min att visualisera DPP release. För bästa resultat, ställa in lasern på en inställning som är precis tillräckligt stark för att få en klar bild av DPP-releasing celler för att undvika över-blekning under Bildinsamling. Bilderna kan samlas in som en tidsserie som sedan kan exporteras som AVI-filer (ingen komprimering, 3 frames/s) för att få videofiler i DPP release.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar representativa Live-Imaging resultat av detta protokoll. När protokollet är framgångsrikt, DPP-GFP kan ses som en rand ner i mitten av Wing skivan med kärnor synlig som icke-fluorescerande cirklar i DPP-GFP-regionen (figur 2). DPP-GFP release är synlig som fluorescerande Auktor som visas och försvinner. Vi har observerat DPP-GFP-fluorescens som dyker upp och försvinner i cell kropparna och långt från cell kropparna. DPP signalering är beroende av Actin-baserade filopodia-liknande strukturer som kallas cytonemes som sträcker sig långt från cellen kroppen22,23. Därför är det troligt att DPP-GFP Auktor som visualiseras långt från DPP-producerande cell kroppar i dessa presenterade videor är sannolikt i cytonemes eller på cytoneme "synapser"15. Dessa Auktor är mest uppenbara nära D/V-gränsen, som kan ses som gapet i DPP-GFP rand.
Figur 3 visar ett suboptimalt resultat. I den metod som beskrivs här monteras Ving skivorna så att peripodial sidan är vänd bort från Mikroskopbilden så att skivan avbildas från peripodial sidan (som visas i figur 1b). Om Ving skivan är avbildad från baksidan, det vill, peripodial sida mot Mikroskopbilden, kommer DPP-GFP fluorescens visas ur fokus och upplösningen kommer att vara dålig, vilket resulterar i suboptimala resultatet visas i figur 3. Steg 4,6 är därför avgörande för att se till att Ving skivan ligger plant i rätt orientering före avbildning för att undvika detta resultat.
Figur 4 visar en tidsserie bilder av en dpp > GFP (DPP-GAL4; UAS-GFP) tredje INSTAR larv Wing Disc. När GFP inte smält till DPP, vi inte observera utseendet på Auktor utanför cellen organ. Denna kontroll är viktig för slutsatsen att DPP-GFP beter sig annorlunda än GFP ensam.
Figur 5 visar en tidsserie bilder av en DPP-GAL4 drivrutin ensam tredje INSTAR larv Wing Disc. Bilder togs med samma Mikroskop förvärvs inställningar som alla andra prover. Dessa bilder visar att fluorescerande Auktor inte visas när DPP-GFP inte uttrycks.
Bild 1: illustration av Ving skivans monterings inställning. Till bild DPP-GFP release, dissekerade vinge skivor bör monteras som visas. (A) två stycken dubbelhäftande tejp placeras bredden över Mikroskopbilden med vinge skivan monterad i modifierad HL3 media mellan bandet. (B) sidovy av en korrekt monterad Ving skiva. Skivan är orienterad så att peripodial sidan av Ving påsen står uppåt mot täckbrickan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ video av DPP-GFP-utgåvan i Wing-skivan. DPP-GFP uttrycktes i Wing-skivan med hjälp av UAS-GAL4-systemet. Visas här är en representativ video av Live Imaging resultat av DPP-GFP release. Cell kärnor kan ses som cirkulära luckor i fluorescens. Utsöndras DPP-GFP kan ses som ljusa puncta. På grund av kontrasten, dessa ljusa Auktor är lättast att observera utanför regionen som inkluderar DPP-producerande cell organ. Ett sådant område indikeras av en rektangel som försvinner efter de första ramarna. Ving skivans ventrala och bakre riktningar indikeras med pilarna. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Figur 3: suboptimalt resultat av DPP-GFP release Imaging. Exempel på ett suboptimalt resultat som uppstår om Ving skivan är orienterad med peripodial sida nedåt. På grund av den felaktiga orienteringen av Wing-skivpåsen är DPP-GFP inte i fokus, tydliga kärnor kan inte ses, och upplösningen är fortfarande dålig oavsett hur parametrarna för mikroskopet justeras. Ving skivans ventrala och bakre riktningar indikeras med pilarna. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Figur 4: representativ video av GFP-uttryck i DPP-producerande celler av Ving skivan. GFP-uttryck verkar ljust i cellen förkroppsligar och visas inte som ljust Auktor utsläppt i peripheryen. Ving skivans ventrala och bakre riktningar indikeras med pilarna. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Figur 5: representativ video av DPP-Gal4 tredje INSTAR Wing skivor utan uttrycket av DPP-GFP eller GFP. Om Gal4 inte kan köra uttryck av GFP eller DPP-GFP på grund av brist på UAS-GFP eller UAS-DPP-GFP, ingen fluorescens observeras. Vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BMPs som DPP göra sin betydande inverkan när de binder ett komplex av membranbundna receptorer för att orsaka en kaskad av Intracellulär signalering i angränsande eller tydligen avlägsna celler. Dr Thomas Kornberg ' s Lab har visat att celler som producerar DPP signalkontakt celler som tar emot signalen med hjälp av aktin baserade tunna filapodia-liknande strukturer som kallas cytonemes15,24,25. Dessa data tyder på att utvecklingen cell-cellkommunikation i detta sammanhang kan likna en neuronala synaps26. I synaptisk kommunikation, dynamiken i signalsubstansen release är avgörande för dess effekt på postsynaptiska cellen. Likaså är dynamiken i DPP release också viktigt för dess nedströms konsekvenser12. Därför är det viktigt att kunna mäta dynamiken i DPP release i olika genetiska bakgrunder och villkor för att förstå vilka faktorer påverkar DPP release.
Här har vi presenterat den optimerade metoden för att bild DPP release. Vi har också försökt använda brunnar för att odla Ving skivan för avbildning. För djupt av en brunn kan resultera i svårighet som fokuserar på DPP-release händelserna. Dessutom kan Wing-skivan flyttas under Live Imaging, vilket komplierar analysen. Dubbelhäftande tejp ger tillräckligt med utrymme mellan locket slip och skjut för att förhindra krossning av Wing skivan, samtidigt som korrekt fokus. Vi har funnit att vrida mikroskopet en halv timme före avbildning för att låta mikroskopet att värma upp förhindrar avdrift av bilden under hela videon. Placeringen av Ving skivan med peripodial sidan av Ving påsen vänd uppåt är mycket viktigt för avbildning DPP release. Vi fann att motsatt orientering inte tillåter oss att bild DPP release händelser.
Denna metod kan användas för att leta efter genetiska modifierare av DPP release. Vi har observerat att hämning av en Jon kanal påverkar DPP release12. Andra jonkanaler kan också påverka DPP release Dynamics. Vi kan också testa hur miljöförhållanden som teratogener påverkar frisläppandet av DPP. modifierare av DPP release kan avslöja den molekylära mekanismen som styr ligand sekretion. Release Dynamics kan vara viktigt för efterföljande konsekvenser av flera olika utvecklingssignalligander. Även om vi bara har beskrivit hur vi bild DPP release, andra ligander såsom igelkott har observerats i cytoneme medierad signalering och kan regleras av en liknande mekanism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Sarala Pradhan för att ha arbetat med en tidigare version av detta protokoll. Vi skulle vilja tacka NSF-IOS 1354282 för finansiering medan vi utvecklat detta protokoll. Vi vill tacka NIH-NIDCR RO1DE025311 för finansiering av vårt labb för närvarande.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baker's yeast | Red Star | ||
| CaCl2 dyhydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Coverslips | VWR | 484-457 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
| Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu | This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center | ||
| Dumont Tweezers #5 | World Precision Instruments | 500233 | Forceps for dissecting |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| KCl | Fisher Scientific | AC193780010 | |
| Light Corn Syrup | Karo | ||
| Malt Extract | Breiss | ||
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC223210010 | |
| Microscope slides | Sigma Aldrich | S8400 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | |
| NaHCO3 | RPI | S22060-1000.0 | |
| Nail polish | Electron Micsroscopy Sciences | 72180 | |
| Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
| Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Sucrose | Fisher | S512 | |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
| Trehalose dyhydrate | Chem-Impex International, Inc. | 00766 | |
| Yellow Corn Meal | Quaker | ||
| Zeiss LSM 780 confocal microscope | Zeiss | Microscope for live imaging | |
| Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope | Zeiss | Microscope for dissections |
References
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo. Cell. 71 (3), 451-461 (1992).
- Ferguson, E. L., Anderson, K. V. Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo. Development. 114 (3), 583-597 (1992).
- Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo. Development. 117 (2), 807-822 (1993).
- Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila. Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).
- Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary. Development. 113 (1), 27-33 (1991).
- Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila. Development. 111 (3), 657-666 (1991).
- de Celis, J. F. Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing. Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Letsou, A., et al. Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family. Cell. 80 (6), 899-908 (1995).
- Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic. Cell. 78 (2), 225-237 (1994).
- Raftery, L. A., Sutherland, D. J. TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads. Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Dahal, G. R., et al. An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning. Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).
- George, L. F., et al. Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster. G3. 9 (4), Bethesda. 999-1008 (2019).
- Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
- Teleman, A. A., Cohen, S. M. Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc. Cell. 103 (6), 971-980 (2000).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release. Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hazegh, K. E., Reis, T. A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic. Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332 (6027), 354-358 (2011).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Cytonemes as specialized signaling filopodia. Development. 141 (4), 729-736 (2014).
- Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624 (2014).
- Kornberg, T. B., Roy, S. Communicating by touch--neurons are not alone. Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).
