Summary
هنا ، نصف طريقة بسيطة وغير مكلفة تسمح بالقياس الكمي للخلايا السرطانية اللاصقة إلى أقسام التبريد في العقدة الليمفاوية (LN). يتم التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية LN المنضمة عن طريق المجهر الخفيف وتأكيدها من خلال طريقة تعتمد على الفلورسينس ، مما يعطي مؤشر التصاق يكشف عن تقارب الخلايا السرطانية الملزمة لLN parenchyma.
Abstract
العقد الليمفاوية التي تستنزف الورم ليست مجرد مرشحات للنفايات الناتجة عن الورم. وهي واحدة من المواقع الإقليمية الأكثر شيوعا من الإقامة المؤقتة من الخلايا السرطانية المنشورة في المرضى الذين يعانون من أنواع مختلفة من السرطان. الكشف عن هذه الخلايا السرطانية LN المقيمة هو علامة حيوية هامة المرتبطة سوء التكهن وقرارات العلاج المصاحب. وقد أشارت نماذج الماوس الأخيرة إلى أن الخلايا السرطانية المقيمة LN يمكن أن يكون مصدرا كبيرا للخلايا الخبيثة للانبثاث البعيد. القدرة على قياس مدى التهيفية للخلايا السرطانية إلى LN parenchyma هو مقياس حاسم في البحوث التجريبية التي تركز على تحديد الجينات أو مسارات الإشارات ذات الصلة للنشر اللمفاوي / النقيلي. لأن LNs هي هياكل ثلاثية الأبعاد معقدة مع مجموعة متنوعة من المظاهر والتراكيب في أقسام الأنسجة اعتمادًا على مستوى القسم ، يصعب تكرار المصفوفات تجريبيًا في المختبر بطريقة يتم التحكم فيها بالكامل. هنا ، نصف طريقة بسيطة وغير مكلفة تسمح بالقياس الكمي للخلايا السرطانية اللاصقة إلى أقسام التبريد LN. باستخدام أقسام المسلسل من نفس LN، ونحن تكييف الطريقة الكلاسيكية التي وضعتها برودت لاستخدام التسميات غير المشعة والعد مباشرة عدد الخلايا السرطانية الملتزمة في منطقة سطح LN. يتم التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية LN-المنضمة بواسطة المجهر الخفيف وأكد من خلال طريقة تستند إلى الفلورسينس، وإعطاء مؤشر التصاق يكشف عن تقارب الخلية ملزمة لLN parenchyma، وهو دليل موحية من التعديلات الجزيئية في ربط تقارب integrins إلى ارتباطها LN-ligands.
Introduction
الانبثاث السرطاني هو السبب الرئيسي لفشل العلاج والجانب المهيمن الذي يهدد الحياة من السرطان. كما افترض قبل 130 عاما، والنتائج انتشار النقيلي عندما نخبة من الخلايا السرطانية المنتشرة (DTCs، "البذور") اكتساب قدرات بيولوجية محددة التي تسمح لهم للتهرب من المواقع الأولية وإقامة النمو الخبيث في مواقع بعيدة ("التربة")1. في الآونة الأخيرة ، ظهرت العديد من المفاهيم الجديدة المتعلقة بعلاقات "البذور والتربة" ، مثل تحريض المنافذ premetastatic (تصور بأنها "تربة خصبة" اللازمة لازدهار "البذور" ) ، والبذر الذاتي للأورام الأولية من قبل DTCs ، و "البذور" السكون في الأعضاء الثانوية ونموذج التقدم الموازي للانبثاث2.
بالنسبة لمعظم الأورام الخبيثة الصلبة ، يمكن أن تقيم DTCs ويتم اكتشافها في العديد من الأعضاء المتوسطة ، مثل نخاع العظام والغدد الليمفاوية (LNs) في المرضى الذين يعانون من أو بدون دليل على الانبثاث السريري. لأن LNs استنزاف الورم هي الموقع الأول للانتشار الإقليمي للDTCs، LN الوضع هو مؤشر التنبؤ ية الهامة وغالبا ما يرتبط مع قرارات العلاجالمصاحب3. بالنسبة لبعض أنواع الأورام ، فإن الارتباط بين حالة LN والنتائج الأسوأ قوي ، بما في ذلك الرأس والرقبة4،5، الثدي6، البروستاتا7، الرئة8، المعدة9، القولون والمستقيم10،11 وسرطان الغدة الدرقية12.
LNs هي أجهزة صغيرة في الجهاز اللمفاوي ، مغطاة بخلايا شبكية ومحاطة بالأوعية اللمفاوية. هذه الأجهزة ضرورية للغاية لعمل الجهاز المناعي13. تعمل LNs كمنصات جذب للخلايا المناعية المتداولة ، مما يجمع الخلايا الليمفاوية والخلايا التي تقدم المستضدمع معًا14. ومع ذلك، تجذب LNs أيضًا الخلايا السرطانية المتداولة. على مدى عقود، تم تصوير LNs كطرق سلبية للنقل للخلايا السرطانية النقيلية. ومع ذلك ، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الخلايا السرطانية قد تسترشد أيضًا نحو LNs عن طريق التكتيك الكيميائي (chemokines) و / أو العظة (عناصر مصفوفة خارج الخلية) التي يفرزها البطانة اللمفاوية15. وكمثال على ذلك، فإن التعبير المفرط لمستقبلات CCR7 في الخلايا السرطانية يسهل توجيه خلايا الورم الميلانيني النقيلي نحو LNs التي تستنزف الورم16. بالإضافة إلى ذلك ، توفر بروتينات LN خارج الخلية سقالة لاصقة لتجنيد وبقاء الخلايا السرطانية المتداولة17. في الواقع ، توفر LNs التي تستنزف الأورام تربة خصبة لبذر DTCs ، والتي يمكن الحفاظ عليها في الدول التكاثرية أو الخاملة بواسطة إشارات بيئية صغيرة LN محددة18. والمصير النهائي لهذه البلدان النامية النامية المقيمة في الجيش الوطني مثير للجدل؛ تشير بعض الأعمال إلى أن هذه الخلايا هي مؤشرات سلبية للتقدم النقيلي19، في حين يقترح آخرون أنهم مؤسسي المقاومة على الأرجح (عن طريق المواقع الأولية ذاتية البذر) و / أو بمثابة خزانات خلوية للانبثاث (نشر "بذور" لنمو السرطان الثالث)20،21. في الآونة الأخيرة ، وذلك باستخدام نماذج ما قبل السريرية ، وقد ثبت أن جزءا صغيرا من هذه DTCs LN المقيمين غزت بنشاط الأوعية الدموية ، ودخلت في الدورة الدموية واستعمرت الرئتين21.
وبالنظر إلى أن وجود الخلايا السرطانية في LNs هو علامة لعدوانية السرطان والغازية ، في هذه الدراسة ، قمنا بتحسين طريقة كلاسيكية طورها Brodt22 لقياس التصاق الخلايا السرطانية إلى LNs في المختبر. سمح لنا استخدام إجراء اختبار قائم على الفلورسينس بتطوير بروتوكول منخفض التكلفة وسريع وحساس وصديق للبيئة (غير مشع) للكشف عن التعديلات اللاصقة بين الخلايا السرطانية وأقسام التبريد LN. باستخدام خلايا سرطان الثدي MCF-7 التي تعبر عن مستويات مختلفة من التعبير الجيني NDRG4 والمقاطع المجمدة جرذ LN لتجسيد الأسلوب، أظهرنا أن هذا البروتوكول سمح بارتباط جيد بين التصاق خلايا الورم إلى LNs في المختبر وLN الانبثاث لوحظ في مرضى سرطان الثدي24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استرداد LNs من جثث جديدة من الفئران Wistar البالغة الصحية التي ضحت بها خلع عنق الرحم. اتبعنا المبادئ التوجيهية للصحة الوطنية للألم والضيق في الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات والبحوث الحيوانية التابعة لمعهد البحث والتعليم في مستشفى سيريو ليبان (CEUA P 2016-04).
ملاحظة: تعتبر جميع الأنسجة المجمدة الطازجة خطرة بيولوجياً وينبغي التعامل معها باستخدام احتياطات السلامة البيولوجية المناسبة.
1. استئصال الغدد اللمفاوية والتبريد
- ضع جثث ًا طازجة لفئران Wistar البالغة (180-220 جم) ملقاة في الرُكَم الظهري على لوحة تشريح نظيفة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب جمع LNs حتى 30 دقيقة بعد القتل الرحيم. - رش الذبيحة الفئران مع الكحول ايزوبروبيل 70٪ واستخدام الأدوات المعقمة لحصاد LN.
- ارفع جلد البطن بمساعدة ملاقط وافتح تجويفًا بشق ٍ سيّوي دون الإضرار بالأنسجة الأساسية ، مما يعرض لزوجة البطن. سحب الأمعاء وLNs الصدر والبطن تصبح مرئية(الشكل 1).
- استئصال بعناية LNs من كل الفئران مع استخدام مقص طرف حادة لتجنب إصابة الشريان الارسالية متفوقة الكذب وراء.
ملاحظة: اعتمادًا على موقع العقدة الليمفاوية المنتزَسة، من الضروري تنظيف الأنسجة الأخرى التي تم الالتزام بها، مثل الأنسجة المسارية. - حصاد LNs في 15 مل أنابيب مخروطية تحتوي على 5 مل من الفوسفات المعقم المالحة العازلة (PBS).
- تجاهل بشكل صحيح جثث الفئران.
- إزالة LNs الطازجة من برنامج تلفزيوني، لفة وتجفيف العقدة على ورقة تصفية الجافة. وضعه في طبق بيتري صغير وإضافة محلول تضمين لعينات الأنسجة المجمدة (O.C.T.) لمدة 2 دقيقة.
- نقل وتوجيه وجه LN إلى أسفل في موقف المطلوب في قاعدة cryomold، مع ما يكفي فقط O.C.T لتغطية ذلك. تجنب الفقاعات بالقرب من الأنسجة. سطح المقطع هو الجزء السفلي من cryomold.
- على الفور المفاجئة تجميد cryomold في برودة الستايروفوم مع الجليد الجاف. عندما لا يزال هناك جزء صغير من O.C.T. غير المجمدة (~ 20-35 ق)، ونقل العينة إلى رقائق الألومنيوم ووضعها في برودة مع الجليد الجاف مع الاستمرار في تجميد عينات أخرى. في النهاية، قم بتخزين جميع العينات عند -80 درجة مئوية حتى القسمة.
- قسم LN مع سمك قسم ضبط cryostat إلى 5-8 ميكرومتر نقل أقسام البكاء على الشرائح المجهر.
ملاحظة: قبل المقطع، قم بإزالة العينات المجمدة من الفريزر -80 درجة مئوية والسماح لها بالتوازن إلى درجة الحرارة في غرفة الميكروتومي ة في cryostat عند -22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبًا. يمكن تخزين الشرائح المحتوية على LN عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. وضع العلامات الخلوية مع الأصباغ الفلورية
ملاحظة: تستخدم الأصباغ الفلورية على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا. نحن نفضل استخدام طويلة سلسلة dialkylcarbocyanines تسمية (DiI (C18)،الإثارة 549 نانومتر، الانبعاثات 565 نانومتر) لأنها مشرقة ومستقرة ويمكن إضافتها مباشرة إلى وسائل الإعلام الثقافة، لا يؤثر على صلاحية الخلية أو خصائص لاصقة الخلية25،26.
- خلايا الإنفصال تنمو في ظل ظروف مثالية (أي في وسط كامل) وإعادة تعليق في وسط خالية من المصل بكثافة من 106 خلايا / مل.
- أضف 1 مل من تعليق الخلايا (106 خلايا) إلى أنبوب مخروطي a15 مل وملصق مع Dil (C18)(2 ميكروغرام/مل) لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بعد 5 دقيقة، قم بتحريك الأنابيب بلطف لتجنب ترسيب الخلايا وتلطيخ الخلايا الرسوبية. تتطلب الكثافات الأكبر أوقات حضانة أطول للتلطيخ الموحد. يختلف وقت الحضانة الأمثل لتلطيخ الخلايا باختلاف خط الخلية. ويمكن أن يكون أفضل كميا باستخدام FL2 تدفق التقليدية قناة الكشف عن القياس الخلوي(الشكل 2A). - الطرد المركزي أنابيب التعليق المسمى في 300 × ز لمدة 4 دقيقة.
- إزالة supernatant وغسل مرتين في 10 مل من وسط خالية من المصل. استعادة الخلايا والكريات الحمراء. إعادة تعليق الخلايا في 106 خلايا / مل في وسط خال من المصل مع 0.1٪ الزلال مصل البقر (BSA).
3. أطباق Precoating مع حل بولي-L-ليسين أو BSA كتحكم البذر (اختياري)
ملاحظة: استخدمنا أطباق زراعة الخلايا المغلفة بـ PLL كأسطح إيجابية لمراقبة التحميل لضمان أن مجموعات تجريبية مختلفة من الخلايا السرطانية تم بذرها بنفس العدد ، وكذلك الأسطح المغلفة بـ BSA كعناصر تحكم سلبية.
- في ظل ظروف معقمة، لإعداد الآبار المغلفة PLL- أو BSA، إضافة 300 ميكرولتر من PLL (0.1٪ ث / v في H2O) أو BSA (مخففة في 2.5٪ ث / v في H2O) مباشرة إلى لوحة 24-well واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
- إزالة الحل عن طريق الطموح، بلطف شطف السطح مع برنامج تلفزيوني معقم والهواء الجاف لوحة في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الأنسجة الثقافة قبل البذر الخلية.
ملاحظة: يجب تعديل المجلدات النهائية من PLL أو BSA وفقًا لمنطقة لوحات الآبار المختلفة.
4. البذر الفلورسنت المسمى الخلايا السرطانية على LN أقسام التبريد أو PLL / BSA المغلفة الآبار
ملاحظة: كعناصر تحكم تجريبية، استخدمنا (1) أطباق زراعة الخلايا المغلفة بـ PLL أو BSA و (2) أقسام متتالية لنفس LN لكل تجربة (انظر هذه التفاصيل في الشكل 2D)، حيث سيقلل هذا الأخير من الاختلافات الإقليمية في تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) لكل قسم LN ، والذي بدوره يمكن أن يملي معدل التصاق الخلية. لالتالي اختبار التصاق خلايا الورم, حدد جودة عالية وتسلسل LN أقسام التبريد.
- اغسل يُشَكُر ُ كَرْبْتَي ْرْهْ مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة ترطيب مع برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- منع التصاق غير محدد لأقسام التبريد مع 2.5٪ BSA لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. استخدام المناعي هيستوكيمياء غسل الغرف ومهد الصفيحة لضمان أن كامل O.C.T تمت إزالتها أثناء غسل واحتضان.
- استنزاف BSA الزائدة على منشفة ورقية جافة، وتجفيف الخطوط العريضة للأقسام LN مع مسحة القطن وتطويق المقاطع باستخدام قلم PAP.
- لالخلايا الورم التصاق الالتصاق، إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (من الخطوة 2.4) إلى كل قسم LN مطوقة أو جيدا في لوحات 24-جيدا PLL المغلفة ووضعها في رف غرفة رطبة لمدة 1-2 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثقافة الخلية التقليدية.
ملاحظة: يجب تعديل الحجم النهائي لتعليق الخلية وفقًا لمنطقة LNs المحاطة المختلفة. - غسل بلطف قبالة الخلايا غير الملتصقة أربع مرات مع برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا الفلورية المتبقية مع 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. القياس الكمي اليدوي للمؤشر اللاصق
ملاحظة: تم تحقيق مؤشر لاصق (أي الخلايا السرطانية /LN mm2)باستخدام هدف 10X وحساب عدد الخلايا السرطانية يدويًا ، الذي تم تحديده بسهولة عن طريق المجهر الضوئي وأكده المجهر الفلوري(الشكل 2D)، لكل مناطق العقدة الليمفاوية في العديد من الحقول المستقلة (تم الحصول عليها باستخدام برنامج ImageJ/ فيجي التابع للمعهد الوطني للصحة).
- استخدم مجهرًا فلوريًا بهدف 10x لالتقاط صور TIFF منفصلة في قناتين تقابلان الحقول الساطعة والفلورية الحمراء(الشكل 2D). قم بتسمية هذه الصور وحفظها بشكل منهجي.
- بدء ImageJ / فيجي، وفتح الصور وتعيين المقياس. من الضروري استخدام مقياس معايرة (على سبيل المثال، مسطرة ميكرومترية 1 مم)(الشكل 2C).
- افتح صورة المسطرة المترية (أو ميكرومتر المرحلة)، وحدد أداة الخط المستقيم وارسم خطًا مستقيمًا يحدد مسافة معروفة.
- في القائمة تحليل، حدد تعيين مقياس. سيتم ملء المسافة بالبكسل استنادًا إلى طول الخط المرسوم في الخطوة 5.3 (بالبكسل). سيتم ملء المسافة المعروفة بالمسافة الحقيقية (في هذه الحالة ، بالملليمترات) ووحدة الطول في وحدة حقل الطول (في هذه الحالة ، بالملليمترات).
- انقر على Global (تنطبق هذه المعايرة على جميع الصور المفتوحة في جلسة ImageJ/فيجي هذه) واضغط موافق.
- قياس كمية منطقة العقدة الليمفاوية: حدد أداة العصا وبالنقر المزدوج، افتح إعدادات أداة العصا. تعيين الوضع إلى 8-متصل. انقر في الصورة وتعيين التسامح حتى حدد جميع الغدد الليمفاوية في الصورة واضغط موافق. لقياس المنطقة، افتح التحليل | قياس (CTRL + M). يتم التعبير عن المنطقة في الوحدات التي تم تعيينها في وقت سابق.
- تحديد كمية خلايا الورم: فتح الصور المجهرية الخفيفة / الفلورية في برنامج فيجي. حدد الإضافات | تحليل | عداد الخلية | عداد الخلية. انقر على الصورة ليتم قياسها كميا واضغط على زر تهيئة في إطار عداد الخلية. حدد نوع العداد (1-8) وانقر على الخلايا في الصورة. لتهيئة الصورة التالية، اضغط على زر إعادة الضبط في نافذة عداد الخلية، وافتح الصورة الجديدة وكرر جميع الخطوات.
ملاحظة: يتم التعبير عن مؤشر الالتصاق LN كعدد الخلايا السرطانية الملتصقة لكل منطقة مغطاة LN (الخلايا /مم2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن نوضح الفحص من خلال تقييم إمكانات LN اللاصقة لخلايا سرطان الثدي الفلورية الحمراء MCF-7 التي تعبر عن مستويات مختلفة من جين NDRG4 (يشار إليه باسم NDRG4-positive والخلايا السالبة NDRG4) ، وهو مغير سلبي من تجمع beta1-integrin على سطح الخلية24، من خلال فحص كسور خلايا الورم LN-المعتنقين للفئران. وترد أمثلة من الصور الخام لهذا البروتوكول في الشكل 2. كما لوحظ في الشكل 2B، يتم تقريب مورفولوجيا الخلايا الملتصقة في الشكل ، ويتم تفريقها بشكل غير متجانس في جميع أنحاء LN. مؤشر لاصق ة LN هو 2 أضعاف أعلى في NDRG4-سالبMCF-7 الخلايا (877 ± 124 خلية / مم2 من LN) مقارنة مع ذلك في الخلايا المقابلة NDRG4-إيجابية MCF-7 (412 ± 76 خلايا / ملم2 من LN، ف = 0.03)(الشكل 2D).
الشكل 1: الإجراء التدريجي لعزل LNs المُلذّة. (أ)شق الجلد فينترال منتصف الخط: تم وضع الفئران القتل الرحيم في موقف الركام الظهري و30-50 مم شق خط الوسط المحرز في الجلد فوق منتصف البطن، وفضح الأحشاء البطن (الكبد والأمعاء الدقيقة والمخنوق والمثانة). (ب)تم سحب الأمعاء الدقيقة بلطف من تجويف البطن تعريض LNs الارسالية الفئران جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الدهنية الحشوية. (ج)التشريح الإجمالي للجهاز الهضمي تشريح بعد إزالة. (D)تشريح الغدد الليمفاوية المساريقية من الأنسجة الدهنية الاتصال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لالتصاق الخلايا السرطانية بأقسام العقدة الليمفاوية للفئران. (أ)تحليل قياس التدفق المنجلي الذي يوضح شدة وضع العلامات على DiI (C18)(الربع العلوي) مقارنة بالخلايا غير الموسومة (الربع السفلي). (ب)الضوء (يسار) وصور المجهر الفلوري (الأيمن) لخلايا MCF-7 ذات العلامات الحمراء الملتصقة بأقسام LN بعد خطوة الغسيل. (C)بعد فحص الالتصاق ، يتم قياس الخلايا المرفقة على القسائم يدويًا باستخدام مقياس المعايرة لتقدير منطقة العقدة الليمفاوية والمجهر الفلوري لحساب الخلايا المباشر. (D)NDRG4 ضربة قاضية في خلايا ورم الثدي MCF-7 يزيد التصاق العقدة الليمفاوية. صور تمثيلية لخلايا MCF-7 الفلورية الحمراء (NDRG4-positive أو NDRG4-negative DiIC18-الخلايا المسماة) 30 دقيقة بعد البذر على 5 ميكرومتر أقسام العقدة الليمفاوية الفئران. يتم التعبير عن مؤشر LN اللاصق على أنه عدد الخلايا السرطانية الملتصقة لكل منطقة مغطاة LN (الخلايا / مم2). مقياس شريط = 200 ميكرومتر. * p < 0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتطلب نشر الخلايا السرطانية في الجهاز اللمفاوي مجموعة متنوعة من الأحداث المعقدة التي تحركها الخلايا. أنها تبدأ مع انفصال الخلية من الورم الأولي وإعادة عرض مصفوفة خارج الخلية (ECM) العمارة، ويدعمها chemotaxis المستمر والهجرة النشطة من خلال اللمفاويات afferent في طريقها إلى LNs الحارس. إذا انضمت الخلايا السرطانية والبقاء على قيد الحياة في LNs، فإنها يمكن أن تنتشر بسهولة إلى الأجهزة الثانوية الأخرى. هنا نصف طريقة سهلة للتحليل الوظيفي السريع والمنخفض التكلفة للتفاعلات اللاصقة المحددة بين الخلايا السرطانية وLNs المجمدة.
من الناحية الهيكلية ، LNs هي كتل منفصلة تشبه الإسفنج من شبكات كثيفة وواسعة من ألياف ECM ، يشار إليها في كثير من الأحيان باسم "الألياف الشبكية" ، والتي تعمل كمسارات لهجرة الخلايا وكقنوات للتسليم السريع للعوامل القابلة للذوبان (المستضدات و / أو chemokines) داخل LN parenchyma27. تدعم الألياف الشبكية المحفوظة للـ LNs المجمدة للأجهزة الاعتابية إشارات التعساء وتوفر السقالات لالتصاق خلايا الورم في المختبر. تتكون هذه الألياف في المقام الأول من البروتينات الهيكلية ، مثل الكولاجين الأول والثالث ، وعناصر ECM الثانوية ، مثل فيفينكتين ، تيناسسين ، لامينين ، فيترونكتين وكبريتات الهيباران proteoglycans28،29. بعد التصاق الخلية، توفر معظم هذه العوامل المستمدة من LN ECM الإشارات الجزيئية التي تحدد بقاء الخلية (حالات التكاثر أو السكون) أو موت الخلية (anoikis) من خلال إشارات بوساطة integrin.
هنا، ونحن نظهر فحص باستخدام الـ LNs الفئران xenogeneic وخط خلايا ورم الثدي البشري. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مصادر أخرى للضمانات المكانية. يتضمن تكوين الفئران أو الفأر أو LNs البشرية نفس البروتينات الهيكلية والوظيفية التي هي جزء من ECM الثدييات الأصلية، والحفاظ على جميع المواقع الملزمة المماثلة التي هي ضرورية لالتصاق الخلية23. والأهم من ذلك، أن الخطوة الحرجة الوحيدة هي استخدام شرائح متتالية من نفس LN لكل تجربة لتقليل الاختلافات الإقليمية في تكوين ECM لكل قسم LN، والتي بدورها يمكن أن تملي معدل التصاق الخلية.
عيب في المقاصهو هو أنه لا يُلخص الخطوات الأولى للنشر اللمفاوي ، مما يعكس فقط القوة اللاصقة للخلايا السرطانية إلى LNs. على سبيل المثال، البذر أقل عدوانية خلايا سرطان الثدي على أقسام LN، مثل MCF-7(الشكل 2)أو خطوط الخلايا السرطانية T47D24، يؤدي إلى التصاق قوي إلى أقسام LN في المختبر، على مستويات مماثلة من لوحظ لارتفاع العدوانية MDA-MB-231 الخلايا السرطانية (البيانات غير مبين). ومع ذلك ، فمن المعروف جيدا أن أورام MCF-7 xenograft التقويمية لا يمكن أن تصل إلى LNs الحارس ، في حين أن أورام MDA-MB-231 تنتشر تلقائيًا إليها30. من الواضح أن عنق الزجاجة الرئيسي لخلايا MCF-7 LN-metastasis التكوين تحدث في خطوات قبل أن تصل إلى LNs والالتزام بها، مثل عدم قدرة خلايا MCF-7 الهروب بكفاءة من الأورام الأولية. لذا ، فإن قوة الاستنسافي الموصوفة هنا لا تقيم علاقات مباشرة مع إمكانات LN-النقيلي ، ولكنها طريقة بسيطة لتحديد الخصائص اللاصقة لخلية الورم في ECM أكثر واقعية في المختبر. باستخدام الأنسجة المجمدة، تمثل أقسام التبريد التعقيد الطبيعي للـ LNs من حيث الهيكل والتركيب، والتي سيكون من المستحيل إعادة إنشائها باستخدام التقنيات الاصطناعية، وخاصة تلك التي تستخدم بروتينات ECM النقية.
القيود الإضافية للطريقة هي (1) أنها لا تسمح بتقييم الإمكانات الكيميائية للعوامل التي تفرزها LNs وأنه (2) لا يبلغ عن ما إذا كان الالتصاق الخاص بالخلية بأقسام LN هو نتيجة ربط تفضيلي لبروتينات ECM أو الخلايا أو أي هياكل أخرى موجودة في أقسام LN. ومع ذلك، شعرنا أن هذا النهج يمكن أن يكون ذا صلة ويجب النظر فيه بجدية في تطبيقات معينة، ولكنه خارج نطاق هذه المخطوطة بالذات. على سبيل المثال ، في دراسة حديثة ، حددنا الجين N-Myc المنظم في المصب 4 (NDGR4) كعلامة حيوية ميكانيكية للانبثاث LN في أورام الثدي24. ميكانيكيا، الخلايا السرطانية التي تفتقر إلى التعبير NDRG4 زيادة الالتصاق بأقسام التبريد من LNs من خلال تفضيل تجميع مستقبلات α1-integrin في الحافة الرائدة من خلايا سرطان الثدي. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام ضوابط إضافية، مثل الأطباق المغلفة مع البروتينات ECM المنقى، كشفنا أن الالتصاق التفاضلي إلى أقسام LN هو نتيجة لارتباط انتقائي مع vitronectin24.
وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن هذه الطريقة لا تقتصر على أقسام LNs ويمكن إعدادها لتقييم التصاق الخلايا بالأعضاء الحية المختلفة، مثل أقسام التبريد في الطحال أو الرئتين. الخلايا النقيلية تحمل العضوية وقياسات قوة لاصقة في أقسام المجمدة من مختلف الأجهزة في المختبر، يمكن أن يكون وسيلة مفيدة للتنبؤ نشر السرطان الجهاز محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونشكر الدكتورة روزانا دي ليما باغانو وأنا كارولينا بينهيرو كامبوس على المساعدة التقنية. تم دعم هذا العمل من خلال منح من: FAPESP - مؤسسة ساو باولو للأبحاث (2016/07463-4) ومعهد لودفيغ لأبحاث السرطان (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
