Summary
Här beskriver vi en enkel och billig metod som gör det möjligt att kvantifiera självhäftande tumörceller till lymfkörteln (LN) kryosektioner. LN-anhängare tumörceller är lätt identifieras med ljus mikroskopi och bekräftas av en fluorescens-baserad metod, vilket ger en vidhäftning index som avslöjar tumörcell-bindande affinitet till LN parenkym.
Abstract
Tumördränerande lymfkörtlar (LNs) är inte bara filter av tumörproducerat avfall. De är en av de vanligaste regionala platserna för provisorisk bosättning av spridas tumörceller hos patienter med olika typer av cancer. Upptäckten av dessa LN-bosatt tumörceller är en viktig biomarkör i samband med dålig prognos och adjuvant terapi beslut. Senaste musmodeller har indikerat att LN-bosatt tumörceller kan vara en betydande källa till maligna celler för avlägsna metastaser. Förmågan att kvantifiera tumörcellernas vidhäftighet till LN-parenkym är en kritisk mätare i experimentell forskning som fokuserar på identifiering av gener eller signalvägar som är relevanta för lymfatisk/metastaserande spridning. Eftersom LNs är komplexa 3D-strukturer med en mängd olika utseenden och kompositioner i vävnadssektioner beroende på sektionsplanet, är deras matriser svåra att replikera experimentellt in vitro på ett helt kontrollerat sätt. Här beskriver vi en enkel och billig metod som gör det möjligt att kvantifiera självhäftande tumörceller till LN kryosektioner. Med hjälp av seriella delar av samma LN anpassar vi den klassiska metoden som utvecklats av Brodt för att använda icke-radioaktiva etiketter och direkt räkna antalet angränsande tumörceller per LN-yta. LN-anhängare tumörceller identifieras lätt av ljusmikroskopi och bekräftas av en fluorescensbaserad metod, vilket ger en vidhäftning spektion index som avslöjar cell-bindande affinitet till LN parenkyma, vilket är suggestiva bevis på molekylära förändringar i affinitet bindande integrins till deras korrelera LN-ligands.
Introduction
Cancer metastasering är den främsta orsaken till behandlingssvikt och den dominerande livshotande aspekten av cancer. Som postulerade 130 år sedan, den metastaserande spridning resultat när en elit av spridda tumörceller (DTCs, "frön") förvärva specifika biologiska förmågor som tillåter dem att undvika primära platser och etablera malign tillväxt på avlägsna platser (den "jord")1. Nyligen har flera nya begrepp om "utsäde och jord" relationer uppstått, såsom induktion av premetastatiska nischer (konceptualiserade som en "bördig jord" som behövs för "frön" att frodas), självsådd av primära tumörer av DTCs, "utsäde" dvala på sekundära organ och parallell progression modell av metastasering2.
För de flesta solida maligniteter kan DTCs vistas och upptäckas i många mesenchymal organ, såsom benmärg och lymfkörtlar (LNs) hos patienter med eller utan bevis på klinisk metastasering. Eftersom tumördränerande LNs är den första platsen för den regionala spridningen av DTCs, är LN status en viktig prognostisk indikator och är ofta förknippad med adjuvant terapi beslut3. För vissa tumörtyper är korrelationen mellan LN-status och sämre resultat stark, inklusive huvud och hals4,5,bröst6,prostata7,lung8,mag9,kolorektal10,11 och sköldkörtelcancer12.
LNs är små ovala organ i det lymfatiska systemet, som är täckta med reticular celler och inneslutna med lymfkärl. Dessa organ är absolut nödvändiga förimmunsystemets funktion 13. LNs fungera som attractant plattformar för immun cirkulerande celler, föra lymfocyter och antigen-presentera celler tillsammans14. LNs lockar dock också cirkulerande tumörceller. Under årtionden var LNs avbildas som passiva transportvägar för metastaserande tumörceller. Emellertid, nyligen genomförda studier har visat att tumörceller kan också styras mot LNs av kemotaktiska (kemokiner) och / eller haptotactic (extracellulära matriselement) ledtrådar utsöndras av lymfatisk endothelium15. Som exempel, överuttryck av CCR7-receptorn i tumörceller underlättar vägledning en metastaserande melanom celler mot tumördränerande LNs16. Dessutom, extracellulära LN proteiner ger en självhäftande byggnadsställning för rekrytering och överlevnad cirkulerande tumörceller17. I själva verket, tumör-dränerande LNs ger bördig jord för sådd av DTCs, som kan upprätthållas i proliferativa eller vilande tillstånd av specifika LN mikromiljösignaler18. Det slutliga ödet för dessa LN-bosatta DTCs är kontroversiellt; vissa verk tyder på att dessa celler är passiva indikatorer på metastaserande progression19, medan andra föreslår att de är mer sannolika grundare av resistens (genom självsådd primära platser) och / eller fungera som cellulära reservoarer för metastaser (sprida "frön" för tertiär cancertillväxt)20,21. Nyligen, med hjälp av prekliniska modeller, har det visat sig att en bråkdel av dessa LN-bosatta DTCs aktivt invaderade blodkärl, trädde i blodcirkulationen och koloniserade lungorna21.
Med tanke på att förekomsten av cancerceller i LNs är en markör för cancer aggressivitet och invasivitet, i denna studie, optimerade vi en klassisk metod som utvecklats av Brodt22 för att kvantitativt mäta tumörcell vidhäftning till LNs in vitro. Användningen av en fluorescensbaserad analys gjorde det möjligt för oss att utveckla ett billigt, snabbt, känsligt och miljövänligt (icke-radioaktivt) protokoll för detektion av självhäftande förändringar mellan tumörceller och LN-kryosektioner. Med hjälp av MCF-7 bröstcancerceller uttrycker olika nivåer av NDRG4 genuttryck och råtta LN frysta sektioner för att exemplifiera metoden, visade vi att detta protokoll tillät en bra korrelation mellan tumörcell vidhäftning till LNs in vitro och LN metastasering observerats hos bröstcancerpatienter24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LNs återfanns från färska slaktkroppar av friska vuxna Wistar råttor som offrades av livmoderhalscancer störning. Vi följde NIH:s riktlinjer för smärta och nöd i laboratoriedjur och alla förfaranden godkändes av etikkommittén och djurforskningen vid Forsknings- och utbildningsinstitutet vid Sírio-Libanês sjukhus (CEUA P 2016-04).
OBS: Alla färska frysta vävnader anses vara biofarliga och bör hanteras med lämpliga försiktighetsåtgärder för biosäkerhet.
1. Lymfadenektomi och Cryosectioning
- Placera färska slaktkroppar av vuxna Wistar råttor (180-220 g) som ligger i dorsala recumbency på en ren dissekering ombord vid rumstemperatur.
OBS: LNs måste samlas in upp till 30 min post dödshjälp. - Spraya råttslakten med 70% isopropylalkohol och använd steriliserade instrument för LN-skörd.
- Lyft buken huden med hjälp av pincett och öppna en hålighet med ett medialt snitt utan att skada den underliggande vävnaden, utsätta buken inälvskraft. Dra ut tarmen och bröst- och buk-LNs blir synliga (figur 1).
- Försiktigt punktskatt LNs från varje råtta med hjälp av trubbigspets sax för att undvika att skada den överlägsna mesenteric gatan ligger bakom.
OBS: Beroende på placeringen av den resected lymfkörteln, är det nödvändigt att rengöra andra vävnader som följs den, såsom mesentiska vävnad. - Skörda LNs i 15 ml koniska rör som innehåller 5 ml sterilfosfatbuffrad koks (PBS).
- Kassera råttkropparna på rätt sätt.
- Ta bort färska LN s:n från PBS, rulla och torka noden på ett torrt filterpapper. Placera den i en liten Petri skålen och tillsätt inbäddninglösning för frystvävnad exemplar (OK) i 2 min.
- Överför och orientera LN nedåt i önskad position i basen av en cryomold, med precis tillräckligt MED OKT för att täcka den. Undvik bubblor nära vävnaden. Snittytan är botten av kryomold.
- Snäpp omedelbart fast kryomoldt i en frigolitkylare med torris. När det fortfarande finns en liten del av ofryst A.C.T. (~20-35 s), överför provet till aluminiumfolie och placera det i en kylare med torris samtidigt som du fortsätter att frysa andra prover. I slutet, förvara alla prover på -80 °C tills snittning.
- Avsnitt LN med en kryostatjustering avsnitt tjocklek till 5-8 μm. Överför kryddsektioner på mikroskop diabilder.
OBS: Innan snittning, ta bort de frysta proverna från frysen -80 °C och låt dem jämställas med temperaturen i kryostatmikrotomekammaren vid -22 °C i ca 30 min. LN-innehållande glidbanor kan lagras vid -80 °C i upp till en månad.
2. Cellulära märkning med fluorescerande färgämnen
OBS: Fluorescerande färgämnen används ofta i cellbiologi. Vi föredrar att använda lång-kedjan dialkylcarbocynines märkning (DiI (C18), excitation 549 nm, Emission 565 nm) eftersom de är ljusa, stabila och kan läggas direkt till kulturmedia, påverkar inte celllivskraft eller cell självhäftande egenskaper25,26.
- Dissociate celler växer under idealiska förhållanden (dvs. i komplett medium) och resuspend i serum-fritt medium med en densitet av 106 celler/ml.
- Tillsätt 1 ml cellsuspension (106 celler) till a15 ml koniskt rör och etikett med Dil(C18) (2 μg/mL) i 10 min vid 37 °C.
OBS: Efter 5 min, försiktigt agitera rören för att undvika cellsedimentering och underfärgning av sedimenterade celler. Större tätheter kräver längre inkubationstider för enhetlig färgning. En optimal inkubationstid för cellfärgning varierar med cellinjen. Det kan kvantifieras bättre med hjälp av den konventionella FL2 flöde cytometri detekteringskanal (figur 2A). - Centrifugera de märkta fjädringsrören vid 300 x g i 4 min.
- Ta bort supernatantoch tvätta två gånger i 10 ml serumfritt medium. Återställ cellerna som röda pellets. Resuspend cellerna på 106 celler/ml i serumfritt medium med 0,1% bovinserumalbumin (BSA).
3. Precoating Rätter med Poly-L-lysinlösning eller BSA som seedningskontroll (tillval)
OBS: Vi använde cellodlingrätter förbelagda med PLL som positiva laddningskontrollytor för att säkerställa att olika experimentella grupper av tumörceller såddes till samma antal, samt BSA-belagda ytor som negativa kontroller.
- Under sterila förhållanden, för att förbereda PLL- eller BSA-belagda brunnar, tillsätt 300 μl PLL (0,1 % w/v i H2O) eller BSA (utspädd på 2,5 % w/v i H2O) direkt till 24-brunnsplattan och inkubera över natten vid 4 °C.
- Ta bort lösningen genom aspiration, skölj försiktigt ytan med steril PBS och lufttorka plattan vid rumstemperatur i vävnadsodlingshuven innan cellsådd.
OBS: De slutliga volymerna av PLL eller BSA måste justeras beroende på området för olika brunnsplattor.
4. Sådd fluorescerande tumörceller på LN Kryosektioner eller PLL/BSA-belagda brunnar
OBS: Som experimentella kontroller använde vi (1) cellodlingsrätter förbelagda med PLL eller BSA och (2) i varandra avsnitt av samma LN per experiment (se denna detalj i figur 2D), där den senare kommer att minimera regionala variationer i extracellulär matris (ECM) sammansättning av varje LN avsnitt, vilket i sin tur kan diktera cellviddhesion hastighet. För följande tumörcell vidhäfting analys, välj hög kvalitet och sekventiella LN cryosections.
- Tvätta försiktigt kryosektionerna två gånger med PBS och rehydrera med PBS i 15 min vid rumstemperatur.
- Blockera ospecifik vidhäfting till kryosektioner med 2,5% BSA i 30 min vid 37 °C. Använd immunohistochemistry tvätta kammare och laminvagor för att säkerställa att hela O.C.T togs bort under tvättar och inkubations.
- Töm överflödiga BSA på en torr pappershandduk, torka konturerna av LN sektioner med en bomullspinne och omringa sektionerna med hjälp av en PAP-penna.
- För tumörcellvidhäftningsanalysen, tillsätt 100 μl cellsuspension (från steg 2.4) till varje omgiven LN-sektion eller väl i de 24-brunnspllbelagda plattorna och placera den i ett fuktat kammarställ i 1-2 h vid 37 °C i den konventionella cellkulturens inkubator.
OBS: Den slutliga volymen av cellfjädring behov justeras beroende på området för olika omringade LNs. - Tvätta försiktigt bort icke-anhängare celler fyra gånger med PBS. Fixa de återstående vidhäftande fluorescerande cellerna med 3,7% formaldehyd i PBS i 15 min vid rumstemperatur.
5. Manuell kvantifiering av limindex
OBS: Det självhäftande indexet (dvs. tumörceller/LN mm2)uppnåddes med hjälp av ett 10X-mål och räknade manuellt antalet tumörceller, lätt identifierade av ljusmikroskopi och bekräftas av en fluorescensmikroskopi (figur 2D), per lymfkörtelområden i flera oberoende områden (som erhållits med hjälp av National Institute of Health's ImageJ/FIJI-programvara).
- Använd ett fluorescerande mikroskop med ett 10x-mål för att ta separata TIFF-bilder i två kanaler som motsvarar de ljusa och rödlysrörsfälten(figur 2D). Namnge och spara dessa bilder systematiskt.
- Starta ImageJ/FIJI, öppna bilderna och ställ in vågen. Det är nödvändigt att använda en kalibreringsskala (t.ex. en mikrometrisk linjal 1 mm) (figur 2C).
- Öppna bilden av mikrometrisk linjal (eller en stegmikrometer), välj det raka linjeverktyget och rita en rak linje som definierar ett känt avstånd.
- Välj Ange skalapå menyn Analysera . Avståndet i pixlar fylls baserat på längden (i pixlar) på den linje som ritas i steg 5.3. Det kända avståndet fylls med det verkliga avståndet (i detta fall i millimeter) och längdenheten i längdenheten (i detta fall i millimeter).
- Klicka på Global (denna kalibrering gäller för alla bilder som öppnas i denna ImageJ / FIJI session) och tryck på OK.
- Lymfkörteln område kvantifiering: Välj Trollstavverktyget och genom att dubbelklicka, öppna Trollspö verktygsinställningarna. Ange läge till 8-anslutna. Klicka i bilden och ställ in toleransen tills du väljer alla lymfkörtlar i fotot och tryck på OK. Om du vill mäta området öppnar du Analysera | Åtgärd (CTRL + M). Området uttrycks i de enheter som ställts in tidigare.
- Tumörcell kvantifiering: Öppna ljusmikroskopi/fluorescensbilder i FIJI programvara. Välj Plugins | Analysera | Cellräknare | Cellräknare. Klicka på bilden för att kvantifieras och tryck på Knappen Initiera i cellräknarfönstret. Välj räknartyp (1-8) och klicka på cellerna i fotot. Om du vill initiera nästa bild trycker du på knappen Återställ i cellräknarfönstret, öppnar det nya fotot och upprepar alla steg.
OBS: LN-vidhäftningsindex uttrycks som antalet vidhäftande tumörceller per LN-täckt område (celler/mm2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi illustrerar analysen genom att utvärdera LN-självhäftande potential röda lysrör MCF-7 bröstcancerceller uttrycker olika nivåer av NDRG4 genen (kallad NDRG4-positiva och NDRG4-negativa celler), en negativ modulator av beta1-integrin klustring på cellytan24, genom att undersöka fraktionerna av råtta LN-anhängare tumörceller. Exempel på de råa bilderna av detta protokoll visas i figur 2. Som observerats i figur 2B,är morfologi av anhängare celler rundas i formade, och de är heterogent spridda i hela LN. LN-limindexet är 2 gånger högre i NDRG4-negativa MCF-7-celler (877 ± 124 celler/mm2 LN) jämfört med det i motsvarande NDRG4-positiva MCF-7-celler (412 ± 76 celler/mm2 LN, p = 0,03)(figur 2D).
Figur 1: Stegvis förfarande för isolering av råtta mesenteric LNs. (A) Ventral midline hud snitt: avlivade råttor placerades i dorsala recumbency position och en 30-50 mm midline snitt gjordes i huden överliggande mitten av buken, utsätta buken viscera (lever, tunntarm, cecum och urinblåsa). (B)Tunntarmen drogs försiktigt ut ur bukhålan som exponerade råttameseric LNs inbäddade i visceral fettvävnad. (C)Bruttoanatomi av dissekerat mag-tarmkanalen efter avlägsnande. D)Dissekerade märskiljbara lymfkörtlar från den anslutande fettvävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa resultat av tumörcell vidhäftning till råttlymfkörteln sektioner. A) Belysande flödecytometri analys som visar intensiteten i DiI(C18) märkning (övre kvadrant) jämfört med icke-märkta celler (lägre kvadrant). (B)Ljus (vänster) och fluorescerande (höger) mikroskopi bilder av rödmärkta MCF-7 celler som hörs till LN sektioner efter tvättsteget. (C)Efter vidhäftningsanalys kvantifieras bifogade celler på täckslar manuellt genom att använda en kalibreringsskala för att uppskatta lymfkörteln och fluorescerande mikroskopi till direkt cellräkning. (D) NDRG4 knockdown i MCF-7 bröst tumör celler ökar lymfkörteln vidhäftning. Representativa bilder av röda fluorescerande MCF-7 celler (NDRG4-positiva eller NDRG4-negativa DiIC18-märkta celler) 30 min efter sådd på 5 μm råttlymfkörteln sektioner. LN-limindexet uttrycks som antalet vidhäftande tumörceller per LN-täckt område (celler/mm2). Skalstång = 200 μm. *p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lymfsystemet spridning av cancerceller kräver en mängd komplexa cell-driven händelser. De initierar med cellavlossning från primär tumör och ombyggnad av den extracellulära matrisen (ECM) arkitektur, och stöds av ihållande chemotaxis och aktiv migration genom afferent lymfatika på väg till sentinel LNs. Om cancerceller följer och överlever i LNs, kan de lätt sprida sig till andra sekundära organ. Här beskriver vi en enkel metod för snabb och billig funktionell analys av specifika självhäftande interaktioner mellan tumörceller och frysta LNs.
Strukturellt är LNs diskretsvamp-liknande massor av täta och omfattande nätverk av ECM fibrer, ofta kallad "reticular fibrer", som fungerar som vägar för cellmigration och som ledningar för snabb leverans av lösliga faktorer (antigener och / eller chemokines) inom LN parenkym27. De bevarade reticular fibrerna i de frysta LNs av analysen stöder haptotaktiska signaler och ger byggnadsställningar för tumörcell vidhäftning in vitro. Dessa fibrer består främst av strukturella proteiner, såsom kollagen I och III, och av sekundära ECM-element, såsom fibronectin, tenascin, laminin, vitronectin och heparan sulfat proteoglycans28,29. Efter cellvidhäftning ger de flesta av dessa LN-härledda ECM-faktorer molekylära ledtrådar som bestämmer cellöverlevnad (proliferativa eller dvala tillstånd) eller celldöd (anoikis) genom integrin-medierade signaler.
Här demonstrerar vi analysen med xenogenrrråttor och en celllinje för brösttumör. Alternativt kan andra källor till LN användas. Sammansättningen av råtta, mus eller mänskliga LN innehåller samma strukturella och funktionella proteiner som är en del av inhemska däggdjur ECM, alla bevara liknande bindande platser som är nödvändiga för cell vidhäftning23. Viktigt är det enda kritiska steget att använda på varandra följande skivor av samma LN per experiment för att minimera regionala variationer i ECM sammansättning av varje LN avsnitt, vilket i sin tur kan diktera cell vidhäftningshastigheten.
En nackdel med analysen är att det inte rekapitulera de första stegen i lymfspridning, bara återspeglar limstyrka tumörceller till LNs. Till exempel, sådd mindre aggressiva brösttumör celler på LN sektioner, som MCF-7 (Figur 2) eller T47D tumör cellinjer24, leda till en stark vidhäftning till LN sektioner in vitro, på liknande nivåer än den observerade för den höga aggressiva MDA-MB-231 tumörceller (data som inte visas). Det är dock väl känt att ortopediska MCF-7 xenograft tumörer inte kan nå sentinel LNs, medan MDA-MB-231 tumörer spontant metastasera till dem30. Klart, den största flaskhalsen för MCF-7 celler LN-metastasering bildas förekommer i steg innan de når och hålla sig till LNs, som oförmåga MCF-7 celler effektivt fly från de primära tumörer. Så, styrkan i analysen som beskrivs här är inte att fastställa direkta korrelationer med LN-metastaserande potential, men är en enkel metod för att kvantifiera de självhäftande egenskaperna hos en tumörcell i en mer realistisk ECM in vitro. Genom att använda frysta vävnader representerar kryosektionerna lns naturliga komplexitet när det gäller struktur och sammansättning, vilket skulle vara omöjligt att återskapa med hjälp av syntetiska tekniker, särskilt de som använder renade ECM-proteiner.
Ytterligare begränsningar i metoden är (1) det tillåter inte utvärdering av cellotaktiskpotential av faktorer som utsöndras av LNs och att (2) den inte informerar om huruvida cellspecifika vidhäftning till LN sektioner är ett resultat av förmånsbindande för ECM proteiner, celler eller andra strukturer som finns i LN sektioner. Vi ansåg dock att detta tillvägagångssätt skulle kunna vara relevant och allvarligt övervägas för vissa ansökningar, men att detta särskilda manuskript inte hade tillämpningsområdet. Till exempel, i en färsk studie, identifierade vi N-Myc nedströms-reglerad gen 4 (NDGR4) som en mekanistisk biomarkör för LN metastasering i brösttumörer24. Mekanistiskt, tumörceller saknas NDRG4 uttryck öka vidhäftning till kryosektioner av LNs genom att gynna monteringen av β1-integrin receptorer vid framkanten av brösttumörceller. Dessutom, med hjälp av ytterligare kontroller, som rätter belagda med renade ECM proteiner, upptäckte vi att differential vidhäftning till LN sektioner är ett resultat av selektiv associering med vitronectin24.
Slutligen är det värt att notera att denna metod inte är begränsad till LNs sektioner och kan inrättas för att bedöma cell vidhäftning till olika levande organ, som kryosektioner av mjälte eller lungor. Metastaserande celler uppvisar organotropism och mätningar av självhäftande styrka i frysta delar av olika organ in vitro, kan vara ett användbart medel för förutsäga organspecifik cancerspridning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Rosana De Lima Pagano och Ana Carolina Pinheiro Campos för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av bidrag från: FAPESP - São Paulo Research Foundation (2016/07463-4) och Ludwig Institute for Cancer Research (LICR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352096 | |
| 2-propanol | Merck | 109634 | |
| Benchtop Laminar Flow | Esco Cell Culture | ||
| Bin for Disc | Leica | 14020139126 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100 | |
| Cell culture flask T-25 cm2 | Corning | 430372 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 UV | |
| Cryostat-Brush with magnet | Leica | 14018340426 | |
| DiIC18 Cell Traker Dye | Molecular Probes | V-22885 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 12657-029 | |
| Fluorescence microscope | Nikon Eclipse 80 | ||
| Forma Series II CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| High Profile Disposable Razor | Leica | 14035838926 | |
| Incubation Cube (IHC) | KASVI | K560030 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX31 | |
| Isofluran 100 mL | Cristália | ||
| Liquid Bloquer Super Pap Pen | Abcam, Life Science Reagents | ab2601 | |
| Optimal Cutting Temperature "OCT" compound | Sakura | 4583 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | Gibco | 31800-022 | |
| Serological Pipettes 1 mL | Jet Biofil | GSP010001 | |
| Serological Pipettes 10 mL | Jet Biofil | GSP010010 | |
| Serological Pipettes 2 mL | Jet Biofil | GSP010002 | |
| Serological Pipettes 5 mL | Jet Biofil | GSP010005 | |
| Serological Pipettes 50 mL | Jet Biofil | GSP010050 | |
| Serological Pipettor Easypet 3 | Eppendorf | ||
| Tissue-Tek cryomold | Sakura | 4557 | |
| Trypan Blue 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Instituto Adolfo Lutz | ATV |
References
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer and Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, Q., Zhang, H., Jiang, X., Qian, C., Liu, Z., Zuo, D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to seed and soil hypothesis. Molecular Cancer. 16 (1), 176 (2017).
- Padera, T. P., Meijer, E. F., Munn, L. L. The Lymphatic System in Disease Processes and Cancer Progression. Annual Review of Biomedical Engineering. 18, 125-158 (2016).
- Leemans, C. R., Tiwari, R., Nauta, J. J., van der Waal, I., Snow, G. B. Regional lymph node involvement and its significance in the development of distant metastases in head and neck carcinoma. Cancer. 71 (2), 452-456 (1993).
- Kowalski, L. P., et al. Prognostic significance of the distribution of neck node metastasis from oral carcinoma. Head & Neck. 22 (3), 207-214 (2000).
- McGuire, W. L. Prognostic factors for recurrence and survival in human breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 10 (1), 5-9 (1987).
- Gervasi, L. A., et al. Prognostic significance of lymph nodal metastases in prostate cancer. The Journal of Urology. 142 (2 Pt 1), 332-336 (1989).
- Naruke, T., Suemasu, K., Ishikawa, S. Lymph node mapping and curability at various levels of metastasis in resected lung cancer. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 76 (6), 832-839 (1978).
- Sasako, M., et al. D2 lymphadenectomy alone or with para-aortic nodal dissection for gastric cancer. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 453-462 (2008).
- Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: systematic review. Journal of the National Cancer Institute. 99 (6), 433-441 (2007).
- Watanabe, T., et al. Extended lymphadenectomy and preoperative radiotherapy for lower rectal cancers. Surgery. 132 (1), 27-33 (2002).
- Machens, A., Dralle, H. Correlation between the number of lymph node metastases and lung metastasis in papillary thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (12), 4375-4382 (2012).
- Dijkstra, C. D., Kamperdijk, E. W. A., Veerman, A. J. P. Normal Anatomy, Histology, Immunohistology, and Ultrastructure, Lymph Node, Rat. Hemopoietic System. Jones, T. C., Ward, J. M., Mohr, U., Hunt, R. D. , 129-136 (1990).
- Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shaw, S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunological Reviews. 156, 11-24 (1997).
- Podgrabinska, S., Skobe, M. Role of lymphatic vasculature in regional and distant metastases. Microvascular Research. 95, 46-52 (2014).
- Wiley, H. E., Gonzales, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
- Chen, J., Alexander, J. S., Orr, A. W. Integrins and their extracellular matrix ligands in lymphangiogenesis and lymph node metastasis. International Journal of Cell Biology. 2012, 853703 (2012).
- Müller, M., Gounari, F., Prifti, S., Hacker, H. J., Schirrmacher, V., Khazaie, K. EblacZ tumor dormancy in bone marrow and lymph nodes: active control of proliferating tumor cells by CD8+ immune T cells. Cancer Research. 58 (23), 5439-5446 (1998).
- Cady, B. Regional lymph node metastases; a singular manifestation of the process of clinical metastases in cancer: contemporary animal research and clinical reports suggest unifying concepts. Annals of Surgical Oncology. 14 (6), 1790-1800 (2007).
- Klein, C. A. The systemic progression of human cancer: a focus on the individual disseminated cancer cell-the unit of selection. Advances in Cancer Research. 89, 35-67 (2003).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brodt, P. Tumor cell adhesion to frozen lymph node sections-an in vitro correlate of lymphatic metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 7 (3), 343-352 (1989).
- Badylak, S. F. Xenogeneic extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Transplant Immunology. 12 (3-4), 367-377 (2004).
- Jandrey, E. H. F., et al. NDRG4 promoter hypermethylation is a mechanistic biomarker associated with metastatic progression in breast cancer patients. NPJ Breast Cancer. 5, 11 (2019).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333 (1989).
- Costa, E. T., et al. Intratumoral heterogeneity of ADAM23 promotes tumor growth and metastasis through LGI4 and nitric oxide signals. Oncogene. 34 (10), 1270-1279 (2015).
- Song, J., et al. Extracellular matrix of secondary lymphoid organs impacts on B-cell fate and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), E2915-E2924 (2013).
- Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell and Tissue Research. 252 (2), 367-375 (1988).
- Sobocinski, G. P., Toy, K., Bobrowski, W. F., Shaw, S., Anderson, A. O., Kaldjian, E. P. Ultrastructural localization of extracellular matrix proteins of the lymph node cortex: evidence supporting the reticular network as a pathway for lymphocyte migration. BMC Immunology. 11, 42 (2010).
- Pathak, A. P., Artemov, D., Neeman, M., Bhujwalla, Z. M. Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Xenografts Is Associated with Increased Regions of Extravascular Drain, Lymphatic Vessel Area, and Invasive Phenotype. Cancer Research. 66 (10), 5151-5158 (2006).
